3.2.1 Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami
Badania strukturalne faz kubicznych i kubosomów wykonano w Pracowni Fizykochemii Dielektryków i Magnetyków Uniwersytetu Warszawskiego. Otrzymane układy ciekłokrystaliczne umieszczono w szklanych kapilarach o średnicy 1,5 mm z firmy Hilgenberg, a następnie zaklejano klejem epoksydowym w celu zapobiegania odparowaniu frakcji wodnej.
Kapilary umieszczano w dyfraktometrze niskokątowym Bruker Nanostar wyposażonym w detektor Vantec 2000 ze źródłem promieniowania Cu(Kα). Pomiary prowadzono w 25 °C oraz 37 °C przez 5 min (fazy kubiczne) oraz 150 min (kubosomy).
Dwuwymiarowe wzory zostały zintegrowane do funkcji I(q) (gdzie q (nm-1) to długość wektora rozpraszania). Wektor rozpraszania q został określony na podstawie kąta rozpraszania, wykorzystując zależność q = (4π/λ)sinθ (gdzie 2θ to kąt rozpraszania, a λ to długość fali promieniowania).
64 Na tej podstawie obliczono parametr sieci krystalicznej a, korzystając z równania:
𝑎 = 2𝜋√ℎ2+ 𝑘2+ 𝑙2 𝑞0
gdzie: q0 - wartość dla pierwszego piku na dyfraktogramie; hkl - wskaźniki Millera dla pierwszego piku na dyfraktogramie.
Promień kanału wodnego (rw) otrzymano z następującej zależności:
𝑟𝑤 = (− 𝜎 2𝜋𝜒)
1/2
𝑎 − 𝑙
gdzie: σ - wartość stała wynosząca 1,919 dla fazy o symetrii diamentowej Pn3m; χ -wartość stała wynosząca -2 dla fazy o symetrii diamentowej Pn3m, a - parametr sieci krystalicznej, l - długość łańcucha lipidowego. We wszystkich obliczeniach przyjęto, że długość łańcucha lipidowego dla GMO wynosi 1,8 nm, zgodnie z danymi literaturowymi. [195]
3.2.2 Dynamiczne rozpraszanie światła
Średnicę hydrodynamiczną kubosomów, polidyspersyjność oraz potencjał zeta sprawdzono w neutralnym pH. Przed pomiarami otrzymane próbki rozcieńczano 1000-krotnie wykorzystując filtrowaną wodę destylowaną (50 µg lipidu na 1 mL wody). Rozcieńczone roztwory umieszczono w kuwecie Disposable Capillary Cell (DTS1070) i wkładano do Analizatora Malvern Zetasizer ZS. Pomiary wykonywano w temperaturze 25 °C i powtarzano trzykrotnie.
3.2.3 Transmisyjna kriomikroskopia elektronowa
Badania strukturalne cryo-TEM wykonał dr Tomasz Góral w Centrum Nowych Technologii Uniwersytetu Warszawskiego. Otrzymane próbki kubosomów nakładano na perforowane węglowe siatki Quantifoil R2/2 i zamrażano w ciekłym etanie za pomocą urządzenia Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific). Dwuwymiarowe obrazy otrzymano wykorzystując tryb liniowy na mikroskopie Thermo Fisher Glacios TEM, pracującym przy napięciu 200 kV, wyposażonym w kamerę do bezpośredniej detekcji elektronów Falcon 3EC o wymiarach 4k × 4k oraz oprogramowanie EPU 2.10. Do zbierania obrazów zastosowano następujące parametry: powiększenie 92k odpowiadające wielkości piksela 0,15 nm (1,5 Å) na poziomie próbki; defokus ustawiony na 4,0 i 3,5 μm; oraz całkowity strumień elektronów ok.
40 e/Å2.
65 3.2.4 Badanie profilu uwalniania leku z faz kubicznych za pomocą metod
elektrochemicznych
Pomiary elektrochemiczne wykonano z zastosowaniem potencjostatu CH Instruments Electrochemical Workstation. Pomiary prowadzono w układzie trójelektrodowym. Jako elektrody pracujące stosowano elektrody z węgla szklistego GCE (powierzchnia A = 0,07 cm2).
Elektrodą odniesienia była elektroda chlorosrebrowa (Ag/AgCl), a elektrodą pomocniczą blaszka platynowa. Przed pomiarami elektrody pracujące były czyszczone na krążkach polerskich z tlenkiem glinu (średnica 1 µm, 0,3 µm, 0,05 µm) i przemywane wodą destylowaną.
Na czyste i suche elektrody nakładano przygotowane fazy kubiczne przy pomocy nakładki teflonowej. Każdą elektrodę ważono przed i po modyfikacji elektrody w celu ustalenia masy nałożonej fazy. Następnie elektrody zanurzano w 10 mL elektrolitu podstawowego (0,1 M bufor MES o pH 5,5) Przed każdym pomiarem roztwór elektrolitu był odtleniany argonem (99,999 %) przez 15 min. Pomiary prowadzono metodami cyklicznej i różnicowej pulsowej woltametrii. W czasie pomiarów argon również przepuszczano nad roztworem.
3.2.5 Badanie profilu uwalniania leku z kubosomów za pomocą spektrofotometrii UV- Vis
Do określenia profilu uwalniania DOX z nanocząstek zastosowano spektroskopię UV- Vis przy użyciu spektrofotometru UV-vis Cary 60 (Agilent Technologies). Pomiary UV-Vis wykonywano w kuwetach kwarcowych. Wyznaczanie profilu uwalniania leku z kubosomów odbywało się z wykorzystaniem dializy. Membrany do dializy (MWCO 12-14 kDa), wypełnione roztworem kubosomów domieszkowanych DOX, umieszczano w falkonie zawierającym 50 mL 0,1 M buforu MES o pH 5,5. Próbkę roztworu pobierano do kuwety w określonych odstępach czasowych, aby sprawdzić aktualne stężenie leku przy zastosowaniu krzywej kalibracyjnej. Do uzyskania standardowej krzywej kalibracyjnej dla roztworu DOX (w 0,1 M buforze MES o pH 5,5) użyto co najmniej dziesięć rozcieńczeń w zakresie stężeń 0,0005-0,1 mg/mL. Do pomiaru widm absorpcji roztworów DOX wybrano zakres długości fal 600-250 nm z charakterystycznym λ przy 480 nm. Wszystkie pomiary przeprowadzono w temperaturze pokojowej (25 °C) i powtórzono trzykrotnie.
66 3.2.6 Określenie kinetyki uwalniania leku
Jednym z mechanizmów transportu leku w nośnikach jest dyfuzja, którą można opisać za pomocą pierwszego prawa Ficka:
𝐽 = −𝐷𝜕𝐶
𝜕𝑥
gdzie: J - ilość substancji dyfundującej w jednostce czasu przez powierzchnię [mol/s*m2], D - współczynnik dyfuzji [m2/s] , C - stężenie [mol/m3], x - odległość [m]
W celu scharakteryzowania procesu uwalniania leków z nośników stosuje się modele matematyczne. Najczęściej wykorzystywane są modele kinetyki pierwszego rzędu, Higuchi’ego oraz Korsmeyera-Peppasa.
Kinetyka pierwszego rzędu opisuje uwalnianie, które jest proporcjonalne do stężenia leku.
Można ją opisać równaniem:
𝑙𝑛𝑄𝑡 = 𝑙𝑛𝑄0+ 𝐾𝐼𝑡
gdzie: Qt - ilość uwolnionego leku w czasie t, Q0 - początkowa ilość leku w czasie t=0, KI -stała szybkości pierwszego rzędu, t - czas [h]
Zależność logarytmu naturalnego z uwolnionego leku w funkcji czasu jest linowa. Przykładem kinetyki pierwszego rzędu może być uwalnianie hydrofilowej substancji leczniczej z porowatej matrycy. Takie uwalnianie maleje w czasie.
Model kinetyczny Higuchi’ego opisuje uwalnianie kontrolowane dyfuzją i przedstawiony jest równaniem:
𝑄 = 𝐾𝐻∗ 𝑡1/2
gdzie: KH - stała uwalniania Higuchi’ego
Graficznie model Higuchi’ego przedstawiany jest jako zależność ilości uwolnionego leku od pierwiastka kwadratowego z czasu. Model może opisywać różne przypadki, np. uwalnianie substancji aktywnej z tabletek rozpuszczalnych w wodzie.
Model kinetyczny Korsmeyera-Peppasa opisywany jest jako:
𝑄𝑡
𝑄0 = 𝐾𝑃∗ 𝑡𝑛 Gdzie: Kp - stała dyfuzyjna.
67 Po narysowaniu wykresu zależności logarytmu z ilości uwolnionego leku od logarytmu z czasu, można wyznaczyć wartość wykładnika n, który umożliwia określenie mechanizmu uwalniania leku. Dla n bliskiego 0,5 uwalnianie leku jest zgodne z prawami dyfuzji Ficka. Jeśli 0,5<n<1 to występuje anomalne uwalnianie substancji. Dla n=1 występuje mechanizm zerowego rzędu, natomiast dla n>1 super zerowego rzędu. W celu wyznaczenia wartości n, do sporządzenia wykresów zaleca się korzystać z wartości Qt/Qo mniejszych od 0,60.
3.2.7 Pomiar radioaktywności
Do pomiarów aktywności badanych próbek używano automatycznego licznika promieniowania gamma 2480 Wizard2 z detektorem NaI(Tl) firmy PerkinElmer. To urządzenie umożliwia pomiar wielu próbek ze względu na wbudowany automatyczny podajnik i zmieniacz próbek oraz posiada funkcję korekty tła i poprawki na rozpad, co jest niezwykle wygodnym rozwiązaniem. Aby czas martwy nie przekroczył 30%, maksymalna aktywność pojedynczej próbki nie mogła być wyższa niż 0,1 MBq. Stosowano to urządzenie do pomiarów roztworów pochodzących z badań komórkowych.
Ponadto, stosowano kalibrator dawek Atomlab 500 z komorą jonizacyjną firmy BIODEX, przystosowany do pomiarów aktywności konkretnych radionuklidów. Licznika używano do pomiaru próbek o wysokich aktywnościach w zakresie 0,1 MBq - 10 GBq. Stosowano także wielokanałowy analizator promieniowania gamma z detektorem germanowym typu HPGe (High Purity Germanium), firmy Canberra Packard, USA. Wykorzystano charakterystyczne dla radionuklidów emitowane kwanty promieniowania gamma. Dla 177Lu - 208,4 keV, dla 225Ac - 99,9 keV oraz kwant 218.2 keV emitowany przez pochodny radionuklid 221Fr a dla 213Bi - 440,6 keV.
3.2.8 Hodowla linii komórkowej HeLa
Badania biologiczne wykonano w Instytucie Chemii i Techniki Jądrowej we współpracy z dr hab. Agnieszką Majkowską-Pilip. Hodowlę komórek prowadziła mgr Kinga Żelechowska- Matysiak.
Hodowla komórkowa linii HeLa była prowadzona w sterylnych butlach z polistyrenu oraz w pożywce RPMI-1640 wzbogaconej 10 % płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz antybiotykami (penicylina 10000 jedn./mL, streptomycyna 10 mg/mL). Używane odczynniki ogrzewano w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Fiolkę z zamrożonymi komórkami umieszczono w łaźni wodnej, a po rozmrożeniu zawiesinę komórek przeniesiono do probówki zawierającej 9 mL pożywki RPMI-1640. Probówkę wirowano z prędkością 1100 rpm przez 10
68 minut. Po zakończeniu wirowania, znad pelletu komórek pobierano supernatant, zawieszano komórki w świeżej pożywce (5 mL), a następnie przenoszono do butli zawierającej 10 mL pożywki. Butlę umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5 % zawartości CO2.
Komórki obserwowano codziennie pod mikroskopem, a pożywkę wymieniano co 2 dni. Przy 80 % konfluencji komórki pasażowano. W tym celu najpierw usunięto starą pożywkę, a komórki przemyto buforem PBS. Do butelki dodano 2 mL trypsyny z EDTA i umieszczono w inkubatorze na ok. 5 minut, aby oderwać komórki od podłoża. Następnie dodano 4 mL pożywki w celu zneutralizowania działania trypsyny. Zawartość butli przeniesiono do probówki i wirowano z prędkością 1100 rpm przez 10 minut. Po zakończeniu wirowania pobierano supernatant i zawieszano komórki w świeżej pożywce, a następnie przenoszono do butli z pożywką. Komórki następnie liczono pod mikroskopem - w tym celu 50 µL zawiesiny komórek dodano do 450 µL barwnika Trypan Blue i nakropiono do komory Bürkera. Następnie przygotowano pożywkę z zawieszoną odpowiednią ilością komórek.
3.2.9 Badania cytotoksyczności
Komórki HeLa hodowano w pożywce RPMI-1640 wzbogaconej 10 % płodową surowicą bydlęcą oraz antybiotykami (penicylina 10000 jedn./mL, streptomycyna 10 mg/mL).
Komórki zostały wysiane na płytki 96-dołkowe w ilości 2 × 103 na dołek i inkubowane przez 24 h, w temperaturze 37 °C przy 5 % zawartości CO2. Następnie komórki zostały przemyte buforem PBS. Komórki inkubowano z roztworem kubosomów zawieszonych w pożywce w objętości 200 µL na dołek przez 24 h, 48 h i 72 h.
Aby dokonać oceny aktywności metabolicznej komórek w zależności od zaaplikowanego roztworu kubosomów wykorzystano test kolorymetryczny MTS.
Po danym czasie inkubacji do każdego dołka dodano 20 µL CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent i inkubowano komórki przez kolejne 2 h w 37 °C. Następnie zmierzono absorbancję badanych roztworów przy długości fali wynoszącej 490 nm, z wykorzystaniem czytnika płytek Apollo 11LB913 (Berthold). Eksperyment powtórzono trzykrotnie, a każdy roztwór kubosomów badano w trzech powtórzeniach. Otrzymane wyniki zostały wyrażone jako procent przeżywalności komórek w porównaniu do kontroli, którą stanowiły komórki inkubowane wyłącznie w pożywce.
69 3.2.10 Cytometria przepływowa
Metodą cytometrii przepływowej wykonano testy apoptozy i cyklu komórkowego.
W tym celu wykorzystano komórki HeLa hodowane w pożywce RPMI-1640 wzbogaconej 10 % płodową surowicą bydlęcą oraz antybiotykami (penicylina 10000 jedn./mL, streptomycyna 10 mg/mL). Komórki wysiano na płytki 6-dołkowe w ilości 4 × 105 na dołek i inkubowano przez 24 h w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2. Następnie inkubowano przez 24 h i 48 h z roztworami kubosomów w pożywce.
Komórki wykorzystane do testu apoptozy trypsynowano, przemywano dwukrotnie zimnym buforem fosforanowym (PBS) i zawieszono w buforze wiążącym aneksynę V. Następnie dodano 5 μL aneksyny V znakowanej FITC i 5 μL jodku propidyny (PI) i inkubowano przez 15 min w 37 °C w ciemności.
Próbki do analizy cyklu komórkowego przygotowywano identycznie jak próbki do testu apoptozy. Po dwukrotnym przemyciu zimnym PBS, komórki zawieszono w 70 % zimnym etanolu, a następnie umieszczono w zamrażarce na 90 min. Po odwirowaniu, komórki przemywano dwukrotnie PBS, a następnie dodawano 20 μL jodku propidyny i 2 μL rybonukleazy. Testy apoptozy i cyklu komórkowego wykonywano przy użyciu cytometru przepływowego FACSCelesta (BD Biosciences), natomiast analizę wyników przeprowadzono przy użyciu oprogramowania FACSDiva v8.0 (BD Biosciences).
3.2.10 Sferoidy
Tworzenie sferoidów zostało zainicjowane poprzez wysianie komórek linii HeLa na 96- dołkowe płytki charakteryzujące się powierzchnią o bardzo niskiej przyczepności (Corning).
Sferoidy były hodowane do rozmiaru 375 μm. Następnie sferoidy potraktowano roztworami kubosomów wyznakowanych 213Bi i inkubowano przez 24 h. Po 24 h roztwór usuwano i dodano roztwór pustych kubosomów bądź kubosomów domieszkowanych DOX. Po 24 h inkubacji sferoidy zawieszano w świeżym medium, które następnie wymieniano co 2 dni. Dodatkowo, sferoidy poddane działaniu 213Bi w kubosomach, w dawce 0,5 MBq/mL, były barwione odczynnikami fluorescencyjnymi, takimi jak jodek propidyny i Hoechst 33258. Wzrost poszczególnych modeli hodowli komórkowych 3D mierzono przez 12 dni od dnia po zaaplikowaniu kubosomów wyznakowanych 213Bi. Do określenia średnicy sferoidów zastosowano mikroskop Primovert z kamerą Axiocam 305 (Zeiss). Pomiarów dokonywano za pomocą oprogramowania ZEN 3.0 lite (Zeiss).
70