Manuscrito a ser submetido para publicação no periódico
CARACTERIZAÇÃO DOS ISOLADOS DE Chromobacterium violaceum PELO MARCADOR 16S rRNA E DO PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS.
Silva, M.L.R. B.1, Lyra, M.C.C.P2, J. P. Oliveira, J. P2, Burity, H. A.2, Shiosaki, R.K3,.And Campos-Takaki, G.M 3,4*
¹Doutorado em Ciências Biológicas, UFPE, Recife-PE; 2Laboratório de Genoma, IPA, Recife- PE; 3Departamento de Química; 4Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais – Universidade Católica de Pernambuco, 50.050-900 Recife – PE, Brasil.
*Corresponding author: e-mail: takaki@unicap.br, Phone: +55 81 21194017
Resumo
A Chromobacterium violaceum é uma bactéria saprófita não-patogênica, Gram- negativa e aeróbica facultativa, encontrada em amostras de solo e água de regiões tropicais e subtropicais de diversos continentes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética e bioquímica de isolados de
Chromobacterium violaceum a partir de sua seqüências do gene 16S rRNA e
composição dos graxos ácidos. Os primers usados foram fD1 e rD1 complementares a região do 16S rRNA. Foram caracterizados cinco ácidos graxos principais. A composição dos ácidos graxos forneceu informações adicionais que podem ser combinadas com os testes convencionais selecionados para fornecer uma identificação mais segura e mais rápida dos isolados de C. violaceum. Os dados das distâncias genéticas baseadas na região do 16S rRNA apresentaram altas percentagens de identidades 99-95% entre as seqüências. Os isolados UCP1489, UCP1466 e UCP1035 revelaram similaridades próximas sendo os mesmos agrupados em grupo distinto no marcador 16S rRNA e na composição dos ácidos graxos.
Palavras-Chave: Chromobacterium, seqüência de16S rRNA, composição dos
ácidos graxos.
Introdução
Chromobacterium violaceum é uma bactéria gram-negativa versátil,
classificada como da classe das Betaproteobacteria, ordem Neisseriales, da família Neisseriaceae (Dewhirst et al., 1989). É uma bactéria de vida livre e apresenta a uma elevada flexibilidade para sobreviver nos mais diversos ambientes (Creczynski-Pasa et al., 2004). Esta bactéria é um habitante comum em amostras de solo e água de regiões tropicais e subtropicais de diversos continentes. A característica mais notável de C. violaceum é a produção do pigmento chamado violaceina quimicamente caracterizado (Bromberg & Duran 2001).
O seqüenciamento do seu genoma pela Rede Nacional do Projeto Genoma Brasileiro (Brazilian National Genome Project Consortium, 2003), disponível em servidores Web (www.brgene.lncc.br; www.ncbi.nlm.nih.gov: número de acesso NC_005085), permitiu identificar numerosos genes que podem apresentar potencial para serem usados em produtos farmacológicos, como propriedades biotecnológica e industriais e vários genes que codificam enzimas e proteínas especificas foram patenteados (Vasconcelos et al., 2003).
O uso da reação em cadeia da polimerase (PCR), de sequenciamento automatizado do DNA e da análise dos ácidos graxos metil ester (FAME) na microbiologia ambiental conduziu a uma compreensão melhor da taxonomia bacteriana (Berg et al., 1999; Embley e Stackebrandt 1996). Apesar destes avanços, há uma extensa necessidade que microbiologistas trabalhem para isolar, identificar e caracterizar a maioria de espécies bacterianas conhecidas (Veys et al. 1989; Ward, et al., 1990; Osterhout, et al., 1991). O uso da análise do rRNA isoladamente tem mostrado que há uma diversidade muito maior entre as bactérias do que foi suspeitado previamente (Torsvik, et al., 2002). A aplicação de técnicas moleculares avançadas para a microbiologia ambiental facilitou extremamente a identificação e a caracterização de novas espécies bacterianas. O acoplamento de métodos de análise molecular com a sistemática bacteriana e uso de software para análise filogenética tem facilitado o estabelecimento das relações entre grupos de bactérias (Lane et al. 1985; Weisburg et al. 1991; Turenne et al. 200l; Cohan 2002).
Uma das ferramentas preliminares usadas na identificação e na filogenia bacterianas é o sequenciamento e análise do rRNA (Harmsen e Karch 2004). O RNA ribosomal presta-se quase perfeitamente para a caracterização dos procariotos por causa de sua consistência funcional (Woese 1987; Embley e Stackebrandt 1996; Harmsen e Karch 2004). Há três moléculas conhecidas de rRNA nas bactérias. Os rRNAs 5S, 16S e os 23S, compostos de aproximadamente 120, 1600, e 3000 nucleotídeos respectivamente (Olsen et al. 1986; Fox e Stackebrandt 1987). Destes três, o 16S rRNA provou ser o mais eficiente na identificação bacteriana (Lane et al. 1985; Turenne et al. 2001). O sequenciamento do gene 16S rRNA requer geralmente a extração do DNA genômico e a amplificação do gene do rRNA 16S usando primers bacterianos universais e PCR, e um sequenciamento automatizado do DNA (Harmsen e Karch 2004). A seqüência do DNA obtida por este método deve referenciar as seqüências depositadas na base dos bancos de dados.
Uma outra ferramenta usada na determinação taxonômica de espécie bacteriana a análise dos ácidos graxos metil ester (FAME) (Osterhout, et al., 1991). De acordo com Stead et al. (1992), a espécie bacteriana pode facilmente ser identificada usando perfis dos ácidos graxos celulares, e frequentemente a exatidão da identificação ao nível da espécie é 100%. Os ácidos graxos bacterianos, como as moléculas do 16S rRNA, são altamente conservados devido ao seu papel na estrutura e na função da célula. As espécies de Chromobacterium foram identificadas e caracterizadas em um estudo conduzido por Lima-Bittencourt et al. (2007), onde o gene do 16S rRNA de diversas amostras de Chromobacterium sp. foram seqüenciados. Neste estudo foram avaliadas a diversidade genética e bioquímica de isolados de
Chromobacterium violaceum a partir de sua seqüências do gene 16S rRNA e
Material e Métodos
Microrganismos: Foram utilizadas treze linhagens de Chromobacterium
violaceum (Tabela 1) e a linhagem padrão de C. violaceum ATCC12472. As
linhagens estão depositadas no Banco de culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais da UNICAP/PE, Brasil.
Condições de cultivo: As linhagens foram crescidas em frascos de
Erlenmeyer com 250mL de capacidade, contendo 50mL de meio de cultura Luria Bertani (LB) líquido (Sambrook, et al 1989). Os frascos foram incubados a 300C, mantidos sob agitação de 150 rpm por 48h. Ao final do período de incubação as células foram centrifugadas a 1.700x g por 10min a 40C. A massa celular foi submetida à liofilização e subseqüente extração de ácidos graxos.
Extração e metilação de ácidos graxos: Os ácidos graxos foram convertidos
a ésteres metílicos de acordo com o método de Dunlap e Perry (1967), descrito por Durham e Kloos (1978). Depois de liofilizada 100 mg de biomassa foi colocada em um tubo com rosca e adicionada 2mL de uma solução de trifluoreto de boro em metanol a 14% e 2mL de benzeno, incubou a 600C overnight. Após a incubação adicionou-se 2mL de água destilada e os tubos
foram agitados em vortex por 5 minutos. A mistura foi centrifugada a 1700x g por 10min a 40C. O benzeno foi removido após a centrifugação e evaporado com nitrogênio. Os métil ésteres de ácidos graxos foram resuspensos em n- hexano e analisados em cromatógrafo a gás (CG).
Cromatografia em fase gasosa: As análises foram realizadas em um
cromatógrafo a gás Varian modelo CP-3380 equipado com amostrador automático CP-8200, coluna capilar CP SIL 8CB (30mx 0,25mm), utilizando gás hélio como gás carreador. A temperatura do injetor e detector (FID) em 2500C, a temperatura “oven” em 1300C, inicialmente e aumentando para 1700C em 10C/min, para 1800C em 30C/min, foram mantidos isotermicamente por 10min. Os ácidos graxos foram identificados comparando os tempos de retenção dos picos das amostras com os padrões. As quantidades relativas de
métil ésteres CFA foram calculadas pela integração das áreas dos picos. Foram utilizados vários padrões de ácidos graxos (Sigma).
Tabela 1: Relação dos isolados de Chromobacterium violaceum, suas origens e substratos analisados quanto a diversidade genética das composições dos ácidos graxos e seqüência de 16S rRNA.
Número da Coleção Procedência Substrato
UCP-1461 Amazonas Solo Inundado
UCP-1462 Amazonas Solo Inundado
UCP-1463 Amazonas Solo Inundado
UCP-1464 Amazonas Solo Inundado
UCP-1465 Amazonas Solo Inundado
UCP-1466 Amazonas Solo Inundado
UCP-1467 Amazonas Solo Inundado
UCP-1468 Amazonas Solo Inundado
UCP-1469 Amazonas Solo Inundado
UCP-1470 Amazonas Solo Inundado
UCP-1471 Amazonas Solo Inundado
UCP-1489 Pernambuco Riacho em Paulista
UCP-1035 Ceará Lagoa das Almécegas
Análise estatística: As afinidades entre os isolados foram baseadas nas
composições dos ácidos graxos e foram estabelecidas com a análise dos conjuntos usando o método UPGMA (Unweighted Pair Group Method using
arithmetic Averages) do programa NTSYS pc2.1 para Windows (Rholf, 1993).
Para a análise multivariada da matriz foi usada o teste padrão obtido a partir da distância de Jaccard.
Extração do DNA genômico: Os DNAs genômicos das bactérias foram
extraídos conforme metodologia descrita por Dhaese, et al. (1979) Os DNAs extraídos foram resuspendidos em 10 mg/ml de tampão TE + RNAse e suas
integridades depois das extrações foram determinadas em gel de agarose a 1,0% com tampão TBE (Sambrook, et al., 1989).
PCR e amplificação do gene 16S rRNA: O gene 16S rRNA foi amplificados
usando os primers fD1 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ e rD1 5’AAGGAGGTGATCCAGCC 3’ como descrito por Weisburg, et al., (1991). Para amplificação da PCR foram preparadas soluções (50 μL) constituídas de 0.2 mM de cada dNTP, 10 pmol/µL de cada primer, 1 U de Taq polimerase de DNA (Invitrogen, Brasil) e 50 ng do DNA bacteriano. A programação do termociclador consistiu de um ciclo a 94°C por 3 minutos, seguidos por 30 ciclos de desnaturação a 92°C por 50s, amplificação a 57°C por 50s e extensão a 72°C por 1 minuto e uma etapa final da extensão a 72°C por 7 minutos. As análises foram executadas em sistema de PCR GeneAmp, System 9700 da Applied Biosystems. As seqüências dos produtos de PCR foram diretamente purificadas com o Kit Purelink (Invitrogen). Os produtos de PCR foram posteriormente visualizados após a eletroforese de 80 volts durante 1h 30 minutos em gel de agarose e corada com Sybr Gold 1X (Invitrogen), os padrões revelados foram fotografados sob luz UV.
Análises das seqüências do gene ribosomal 16SRNA: As seqüências
parciais dos genes 16S rRNA dos isolados listados na Tabela 1 e a seqüência do 16S rRNA de Neisseria gonorrhoeae depositada no GenBank (NC_002946), utilizada como grupo externo, foram alinhadas no programa ClustalW 1.8 (Thompson et al., 1994) incorporado ao programa BioEdit (Tippmann, 2004). O número de sítios e taxa de substituições de nucleotídeos e agrupamentos filogenéticos foram obtidos pelo método de Neighbor-Joining com bootstrap 500 e modelo de Tamura-Nei disponível no programa MEGA4 (Tamura et al, 2007), da mesma maneira foi utilizado o modelo de Tamura-Nei para calcular a distância dos pares das seqüências. As percentagens das identidades das seqüências entre os isolados foram obtidas pelo BLAST especializado do NCBI (BLAST/bl2seq), onde uma entre duas seqüências foi sempre a do isolado UCP1489 coletado em Pernambuco.
Resultados e Discussão
Ácidos Graxos e identidades dos 16S rRNA
Os perfis dos dois ácidos graxos principais que caracterizaram os isolados de Chromobacterium violaceum foram os 16:0 e 16:1. Estes são também os ácidos graxos os mais abundantes descritos para a cepa de ATCC 12472 apresentou nível elevado de 18:2 (Figura 1). Da mesma forma que, essa composição é consistente com outros resultados encontrados na literatura para bactérias (Oliver, et al., 1973; Kamimura et al., 1992).
A maior concentração observada de ácidos graxos saturados, foi para a cadeia longa C16:0, todos os isolados testados e o UCP1470 apresentou o ácido palmítico como o componente principal (61,2%), seguido pelos ácidos graxos C16:1 a 21, 2%. Os isolados UCP1466 (40,7%), UCP1489 (38,0%) e UCP1035 (40,0%) apresentaram valores mais alto do ácido graxo C16:1. Delong e Yayanos (1985), trabalhando com Vibrio relataram a presença dos ácidos graxos C16:1 e C18:1.
Para o ácido graxo C12:0 o isolado UCP1035 produziu o menor índice (4,2%) enquanto que o isolado UCP1463 apresentou o índice mais elevado (8,5%). A composição desse ácido graxo não for detectada para o isolado UCP1471. O problema relevante envolvido nos estudos dos ácidos graxos bacterianos é a dificuldade de encontrar uma extração de todos os ácidos graxos que atuam nas células. Em toda a espécie bacteriana algumas porcentagens de ácidos graxos estão livres e podem ser facilmente removidas das células simplesmente pela extração com o solvente orgânico apropriado.
Para o ácido graxo C14:0 encontrada nos isolados de C. violaceum, o valor mais baixo foi observado no isolado UCP1462 (5,3%), enquanto o índice mais elevado foi para UCP1468 (13.4%). Em relação ao ácido graxo C18:2 mostrados neste trabalho as concentrações mais elevadas foi para os isolados UCP1462, UCP1465, UCP1466 e UCP1471 de 24,0%, 22,0%, 20,0% e de 22,0%, respectivamente. Houve uma redução do ácido C18:2 para os isoladas UCP1461 e UCP1467, que apresentaram concentrações relativamente baixas (3,0%).
Composição dos ácidos graxos e identidade dos rRNA 16S 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 65,0 A T CC 124 72 U C P -146 1 U C P -146 2 U C P -146 3 U C P -146 4 U C P -146 5 U C P -146 6 U C P -146 7 U C P -146 8 U C P -146 9 U C P -147 0 U C P -147 1 U C P -148 9 U C P -103 5 96 98 98 96 96 96 98 95 97 96 96 98 100 99
Isolados e % de id dos rRNAs 16S
C om pos iç ão do s ác id os gra xos C 12:0 C 14:0 C 16:0 C 16:1 C 18:2
Figura 1: Composição de ácidos graxos (C 12:0, C 14:0, C16:0, C 16:1 e C
18:2) e % de identidade das seqüências de rRNA 16S (BLAST/bl2seq) em isolados de Chromobacterium violaceum ATCC12472 (Malásia); UCP1461, UCP1462, UCP-1463, UCP1464, UCP1465, UCP1466, UCP1467, UCP1468, UCP1469, UCP1470, UCP1471 (todos da Amazônia), UCP1489 (Pernambuco) e UCP-1035 (Ceará).
O dendrograma baseado na composição dos ácidos graxos (Figura 2) demonstra as similaridades entre os isolados e revela a formação de dois grupos diferenciados. O primeiro grupo pode ser dividido em dois subgrupos: o primeiro subgrupo com ATCC12472, UCP1466 e UCP1489, e o segundo subgrupo, com UCP1461 e UCP1035, caracterizado pelo menor e mais elevado índice de 12:0, 14:0, 16:0 e 16:1. O segundo grupo também pode ser dividido em dois subgrupos: o primeiro representado pelo UCP1468, UCP 1463, UCP1469, UCP1464 e UCP1467 e UCP1470 e o segundo formados pelos isolados UCP1465, UCP1462 e UCP1471. O primeiro subgrupo foi caracterizado por uma concentração ligeiramente mais elevada de 16:0 e de 16:1.
As percentagens das identidades entre as seqüências de 16S rRNA obtidas pelo BLAST especializado do NCBI (BLAST/bl2seq) e as concentrações dos ácidos graxos convertidos não revelaram correlações relevantes (Figura 1). Mas os isolados UCP1466, UCP1489 e UCP1035 foram incluídos em um mesmo subgrupo (Figura 3 e 4) tendo ou não as seqüências de 16S rRNA da cepa de Neisseria gonorrhorae (NC_002946) como grupo externo.
Gene 16S rRNA
Os DNAs dos isolados, listados na Tabela 1, foram submetidos à reação da PCR com oligonucleotídeos específicos para região 16S rRNA e resultaram na amplificação de um fragmento de aproximadamente 1500pb. A molécula da subunidade menor do 16S rRNA foi estabelecida como marcador universal, e somado à técnicas de seqüenciamento de DNA e softwares de análise mais acessíveis surgiu uma taxonomia baseada em DNA, sendo impensável para publicar a descrição de uma nova espécie e para que se estabeleça sua correta posição taxonômica (Young, 2000).
As seqüências dos isolados foram submetidas ao BLAST especializado do NCBI (BLAST/bl2seq) para verificar as identidades dos pares, agora confirmadas como, de C. violaceum apresentaram 95-99% de identidade (Figura 1) com a linhagem de C. violaceum UCP1489 isolada no Estado de Pernambuco. A identidade é o resultado do alinhamento entre duas seqüências
similares que passam a ter um cunho evolutivo a partir de 75% de homologia Yoon et al (2005).
O isolado UCP1467 da região Amazônica e coletado pela Universidade Federal da Amazônia (UFAM) foi o que apresentou a maior distancia genética (Tabela 2) entre os pares dos quatorze isolados analisados com uma média de 0.36% de divergência em relação aos demais. Todos os outros pares apresentaram uma distância entre 0.0, 0.01, 0.02 a 0.03% envolvendo um total de 856 sítios analisados. Mostrando que a análise comparativa da estrutura primária dos genes de 16S rRNA transformaram a taxonomia microbiana em um sistema mais simples de identificação da sistemática baseada nestas seqüências e suas histórias evolutivas (Olsen, et al., 1994). Visto que, no momento, apenas aproximadamente de 1 a 10 % dos microrganismos podem ser isolados por método de cultura, em meio líquido ou sólido (Borneman et al, 1996; Kuske et al., 1997) e taxas relativamente baixas de novos microrganismos tem sido caracterizados e cultivados atualmente (Sebat et al., 2003).
A presença da cepa de Neisseria gonorrhorae (NC_002946) como grupo externo gera duvidas sobre a confiança do bootstrap do maior grupo, com 10 isolados (Figura 3), mas sua formação é altamente confiável para o subgrupo formado pelos isolados de C. violaceum UCP1035, UCP1466 e UCP1489 e pelo grupo externo composto por UCP1467 (Figuras 3 e 4). Para o alinhamento com N. gonorrhorae foi obtido um total de 490 sítios conservados entre os 1581 gerados (36%) e entre os alinhamentos realizados exclusivamente com os isolados de C.violaceum o número de sítios conservados foi de 1001/1482 (67%) mostrando que mesmo com a divergência do isolado UCP1467 e a riqueza dos ecossistemas da sua região de origem os dados analisados não são suficientes para relatar uma nova espécie. Principalmente por que características já consagradas como a ferramenta baseadas nas análises dos ácidos graxos conforme Osterhout, et al (1991) podem ser consideradas como marcadores taxonômico e não destingiu o isolado UCP1467, pelo contrário revela que sua alta composição de ácidos graxos C 16:0 o coloca mais próximo dos isolados UCP1468, UCP1469 e UCP1470 que os demais (Figura 1). Por outro lado, Hungria et al (2005) analisando seqüências do gene 16S rRNA verificaram a diversidade genética entre isolados coletados pela UFAM no Rio
Negro – Amazônia Brasileira e apresentou que pela diversidade os isolados Brasileiro poderiam se incluídos em dois novos grupos de espécies de C.
violaceum já descritos.
Figura 2: Dendrograma de similaridade dos isolados de Chromobacterium
violaceum com suas respectivas composição percentual de ácidos graxos
obtido a partir da media aritmética pelo método UPGMA do programa de NTSYS pc2.1 para Windows (Rholf, 1993).
Tabela 2: Análise do cálculo de distância dos pares das seqüências de 16S
rRNA de 14 isolados Chromobacterium violaceum: ATCC12472 (Malásia); UCP1461, UCP1462, UCP1463, UCP1464, UCP1465, UCP1466, UCP1467, UCP1468, UCP1469, UCP1470, UCP1471 (todos da Amazônia), UCP1489 (Pernambuco) e UCP1035 (Ceará), obtido pelo modelo de Tamura-Nei (Mega4). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 UCP1466 2 UCP1035 0.012 3 UCP1469 0.027 0.020 4 UCP1462 0.019 0.012 0.008 5 UCP1463 0.023 0.015 0.012 0.004 6 UCP1470 0.023 0.015 0.012 0.004 0.002 7 UCP1465 0.021 0.014 0.011 0.002 0.001 0.001 8 UCP1464 0.020 0.013 0.009 0.001 0.005 0.005 0.004 9 UCP1461 0.024 0.017 0.013 0.005 0.001 0.004 0.002 0.006 10 UCP1468 0.019 0.012 0.008 0.000 0.004 0.004 0.002 0.001 0.005 11 UCP1489 0.014 0.017 0.030 0.021 0.025 0.025 0.024 0.023 0.026 0.021 12 ATCC12472 0.019 0.012 0.008 0.000 0.004 0.004 0.002 0.001 0.005 0.000 0.021 13 UCP1471 0.019 0.012 0.008 0.000 0.004 0.004 0.002 0.001 0.005 0.000 0.021 0.000 14 UCP1467 0.145 0.142 0.132 0.132 0.136 0.136 0.134 0.133 0.137 0.132 0.149 0.132 0.132
UCP1464 UCP1469 ATCC12472 UCP1471 UCP1468 UCP1462 UCP1461 UCP1470 UCP1463 UCP1465 UCP1035 UCP1466 UCP1489 UCP1467 Neisseria gonorrhoeae FA 1090 84 87 91 54 43 47 20 0.1
Figura 3: Árvore filogenética das seqüências de 16S rRNA de 14 isolados de
Chromobacterium violaceum: ATCC12472 (Malaysia); UCP1461, UCP1462,
UCP1463, UCP1464, UCP1465, UCP1466, UCP1467, UCP-1468, UCP1469, UCP1470, UCP1471 (Amazônia), UCP1489 (Pernambuco) e UCP1035 (Ceará) tendo como grupo externo Neisseria gonorrhorae, obtido pelo método de Neighbor-Joining com bootstrap 500 e modelo de Tamura-Nei (Mega4).
UCP1463 UCP1461 UCP1470 UCP1465 UCP1464 UCP1462 ATCC12472 UCP1468 UCP1471 UCP1035 UCP1466 UCP1489 UCP1469 UCP1467 86 98 66 89 80 88 0.01
Figura 4: Árvore filogenética das seqüências de 16S rRNA de 14 isolados
Chromobacterium violaceum ATCC12472 (Malásia); UCP1461, UCP1462,
UCP1463, UCP1464, UCP1465, UCP-1466, UCP1467, UCP1468, UCP1469, UCP1470, UCP1471 (Amazônia), UCP1489 (Pernambuco) e UCP1035 (Ceará), obtido pelo método de Neighbor-Joining com bootstrap 500 e modelo de Tamura-Nei (Mega4).
Conclusões
1. As composições dos ácidos graxos revelaram que mesmo sendo um importante marcador taxonômico sua utilização deve sempre ser associada com marcadores genéticos de genes de evolução lenta. Suas informações podem não revelar totalmente o grau de similaridade genético, mas é relevante para estudos taxonômicos.
2. As grandes diversidades genéticas dos ecossistemas tropicais e subtropicais podem justificar variações continentais e regionais em diferentes cepas de C. violaceum, quando são observadas variações das seqüências de 16S rRNA de até 95-99 % de identidade.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos professores Spartaco Astolfi (UFAM) Mariângela Hungria (CNPSO) e Carlos Alberto (UNICAP) pela doação dos microrganismos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP) e a Empresa Pernambuco de Pesquisa Agropecuária (IPA) pelo suporte financeiro.
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