Avaliação bioquímica da diversidade genética de linhagens de Chromobacterium violaceum e caracterização molecular do gene de quitinase

Texto

(1)UNIVERSIDADE FDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. AVALIAÇÃO BIOQUIMICA DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE LINHAGENS DE Chromobacterium violaceum E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO GENE DE QUITINASE. MARIA LUIZA RIBEIRO BASTOS DA SILVA. Recife-PE 2007.

(2) MARIA LUIZA RIBEIRO BASTOS DA SILVA. AVALIAÇÃO BIOQUIMICA DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE LINHAGENS DE Chromobacterium violaceum E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO GENE DE QUITINASE. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos, para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas área de Microbiologia.. Orientadora: Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki (UNICAP) Co-orientador: Prof. Dr. Hélio Almeida Burity (IPA/EMBRAPA). Recife Novembro/2007.

(3) Silva, Maria Luiza Ribeiro Bastos da Avaliação bioquímica da diversidade genética de linhagens de Chromobacterium violaceum e caracterização molecular do gene de quitinase. / Maria Luiza Ribeiro Bastos da Silva. – Recife: A Autora, 2007. 132 fls. .: il. Tese (Doutorado: Ciências Biológicas ) – UFPE. CCB Inclui anexos 1. Microbiologia 3. Bactérias I.Título 576 579. 2. Chromobacterium violaceum. CDU (2ª. Ed.) CDD (22ª. Ed.). UFPE CCB – 2008 – 19.

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(5) “O Senhor é o meu pastor; nada me faltará. Deitar-me faz em verdes pastos, guiam mansamente a águas tranqüilas. Refrigera a minha alma; guia-me pelas veredas da justiça pelo amor do seu nome. Ainda que eu andasse pelo vale da sombra da morte, não temeria mal algum porque tu estás comigo; a tua vara e o teu cajado me consolam. Preparas uma mesa perante mim na presença dos meus inimigos, unges a minha cabeça com óleo, o meu cálice transborda. Certamente que a bondade e a misericórdia me seguirão todos os dias da minha vida; e habitarei na casa do senhor por longos dias.” SALMO 23..

(6) DEDICO Aos meus pais Isaias e Adeilda, por todo amor e carinho transmitidos aos meus filhos nesse momento de ausência, pois sem o sacrifício e dedicação de vocês eu não teria alcançado meus objetivos. Ao meu companheiro José Francisco, por sua calma, seu carinho, seu amor e sua dedicação, obrigada por sempre acreditar em mim, pelo orgulho com que fala de meus feitos. Aos meus filhos Louise, Luana e Pedro Henrique pelo amor incondicional, desculpem-me pela ausência. AMO MUITO VOCÊS.

(7) AGRADECIMENTO É difícil descrever, em palavras, os sentimentos ao finalizar a tese de doutorado, o qual foi um processo de amadurecimento pessoal, profissional e acadêmico. Em meio a muitas sensações vivenciadas nesta fase está à certeza da conquista de mais um ideal, o qual só foi possível com muita determinação, perseverança e apoio de muitas pessoas importantes, sem as quais este trabalho não seria concluído.. Á Deus, por estar sempre presente em todos os momentos da minha vida, segurando em minhas mãos com seu infinito amor e, principalmente, pelo Dom da Vida!. A professora Dra Galba Maria de Campos Takaki, pela orientação e ensinamentos, pela oportunidade de crescimento profissional, pela acolhida em seu laboratório e por ter me confiado à realização deste trabalho.. Minha especial e sincera gratidão àquele que sempre recordarei com bastante carinho, por sua disponibilidade em me ajudar, pela dedicação e sabedoria, mas principalmente pela amizade e sinceridade em momentos decisivos em minha formação profissional, Dr. Helio Burity.. À Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP na pessoa do Magnifico Reitor Pe Dr. Pedro Rubens e ao Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, por ceder à infra-estrutura e apoio financeiro para execução do projeto. Em especial ao Prof. Dr. Carlos Alberto por ceder à linhagem de Chromobacterium violaceum. Quero deixar um abraço especial aos amigos do NPCIAMB que sempre dividiram comigo minhas alegrias e angústias: Raquel Rufino, Patrícia Mendes, Thayse Alves, Petrusk Marinho, Juliana Luna e Rosileide Andrade. Agradeço.

(8) também aos antigos amigos do NPCIAMB, que mesmo distantes, fizeram parte desta caminhada: Ricardo Kenji, Marcos Lima, Norma Evangelista, Mabel Calina.. A Secretária do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, Sônia Maria da Silva pela atenção dispensada e aos técnicos Salatiel José e Severino Humberto pela colaboração durante a fase experimental desta pesquisa.. Ao Programa de Pós-Graduação da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE e a CAPES pela bolsa de doutorado concedida.. Agradeço a todos os professores que participaram da minha formação, em especial a professora Dra. Maria Amélia do Dep. de Medicina Tropical, pela amizade, orientação e colaboração na realização da disciplina de docência.. Aos membros da banca: Dras Márcia Vanusa, Ana Porto, Kaoru Okada, e Maria Aparecida, por ter aceitado o convite para contribuição deste trabalho.. As professoras Dras Luciana Franco e Alzira Almeida, pelas sugestões no Exame de Qualificação, as quais contribuíram para o aperfeiçoamento deste trabalho.. Agradeço as minhas queridas irmãs Ana Maria e Taciana em especial a minha irmã Cybele, obrigada por tudo o que fez por mim, por se preocupar com meus filhos e pelo seu papel maternal salvando-me naquelas horas que somente uma mãe poderia participar.. Agradeço as queridas amigas, Virginia Donato, Márcia Vanusa, Adália Mergulhão, Eidy Simões, Márcia Barreto e Nara Suzy, pelos anos de convivência, pelas conversas, por estarem sempre por perto nas horas alegres e.

(9) também naquelas em que sempre precisamos de um ombro amigo. Pelos “puxões” de orelha que nos fazem crescer e até recolocar os pés no chão.. A Maria do Carmo Catanho, amiga querida que mesmo longe me fortalece com seu incentivo e carinho, ajudando-me com sua confiança nas horas decisivas para finalização deste trabalho.. Em especial ao meu grande amigo e anjo da guarda José de Paula, que nunca me abandonou, por me ouvir quando eu precisei desabafar nos momentos mais difíceis, obrigada por sempre ter acreditado no meu potencial.. À Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA, minha casa cientifica que me acolheu desde 1989 quando ingressei na Iniciação Científica e vem me apoiando na finalização desde trabalho. Em especial aos pesquisadores: Júlio Zoé, Maria do Carmo Santana, Antonio Felix, Liane Maranhão, Vanildo Cavalcanti.. A todos do Laboratório de Biologia do Solo e Laboratório de Genoma, em especial aos amigos Waldemar Araújo, Maria do Carmo Barreto, Clébia Maria e Daniel Jordão, que direta ou indiretamente, me ajudaram neste trabalho, trocando experiências acadêmico-profissionais. A ajuda de vocês foi essencial.. Aos colegas de Doutorado, que lembrarei com carinho Meiriane Vila Nova, Ana Beatriz, Flávia Uchoa e Andréa Apolinário.. A secretária da Pós-graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco Adenilda Eugênia (Adê) pelo carisma e eficiência..

(10) SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS. I. LISTA DE TABELAS. VII. LISTA DE ABREVIATURAS. VIII. RESUMO GERAL. IX. ABSTRACT. XI. 1. INTRODUÇÃO. 13. 2. REVISÃO DE LITERATURA. 15. 2.1 Chromobacterium violaceum - Histórico. 15. 2.1.1 Considerações sobre a Bactéria Chromobacterium violaceum. 16. 2.1.2 Produção de Metabólitos, Pigmentos e Enzimas. 19. 2.1.3 Potencial Biotecnológico. 24. 2.2 As quitinases. 25. 2.2.1 Quitinases Bacterianas. 28. 2.2.2 Aplicações Biotecnologias das Quitinases. 29. 2.3. Métodos Moleculares de Tipagem Baseados em DNA. 31. 2.3.1 Uso da seqüência 16S rRNA como marcador molecular. 33. 2.3.2 Tipagem genômica de bactérias por PCR de elementos repetitivos. 34. 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 37. PRIMEIRO ARTIGO. Titulo: Avaliação do 16S rRNA e do perfil de ácidos graxos como marcadores de isolados de Chromobacterium violaceum.. 57. RESUMO. 58. INTRODUÇÃO. 59. MATERIAL E MÉTODOS. 61.

(11) RESULTADOS E DISCUSSÃO. 64. CONCLUSÕES. 72. REFERÊNCIAS. 72 SEGUNDO ARTIGO. Title: Characterization and genetic diversity via. Rep-PCR of. Chromobacterium violaceum strains isolated from Brazil. 77. ABSTRACT. 78. BACKGROUND. 79. RESULTS. 80. DISCUSSIONS. 81. CONCLUSION. 82. METHODS. 83. REFERENCES. 84. TABLES. 87. FIGURES. 88. TERCEIRO ARTIGO. Title: Characterization of chitinase genes of Chromobacterium violaceum UCP1489. 93. ABSTRACT. 94. INTRODUCTION. 95. MATERIALS AND METHODS. 96. RESULTS AND DISCUSSIONS. 100. CONCLUSION. 109. REFERENCES. 110. QUARTO ARTIGO Titulo:. Estudo. da. expressão. de. genes. de. quitinases. em.

(12) Chromobacterium violaceum. 112. RESUMO. 113. INTRODUÇÃO. 114. MATERIAL E MÉTODOS. 116. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 122. CONCLUSÕES. 128. REFERÊNCIAS. 128. 4. CONCLUSÕES GERAIS. 131. 5. ANEXOS. 132.

(13) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO DE LITERATURA Figura 1. Micrografia eletrônica da Chromobacterium violaceum Disponível em www.unb.br/acsweb/imagens/bactéria1.jpg.. 18. Figura 2. Aspecto geral de C. violaceum em meio LB-ágar, cultivadas a 30°C por 24 horas.. 21. Figura 3. Mecanismo de ação das quitinases. 29. PRIMEIRO ARTIGO Figura 1. Composição de ácidos graxos (C 12:0, C 14:0, C16:0, C 16:1 e C. 18:2). e. %. de. identidade. das. seqüências. de. 16S. rRNA. (BLAST/bl2seq) em isolados Chromobacterium violaceum ATCC12472 (Malásia); UCP-1461, UCP-1462, UCP-1463, UCP-1464, UCP-1465, UCP-1466, UCP-1467, UCP-1468, UCP-1469, UCP-1470, UCP-1471 (Amazônia), UCP-1489 (Pernambuco) e UCP-1035 (Ceará).. Figura. 2.. Dendrograma. Chromobacterium. de. violaceum. similaridade. com. suas. dos. 65. isolados. respectivas. de. composição. percentual de ácidos graxos obtido a partir da media aritmética pelo método UPGMA do programa de NTSYS pc2.1 para Windows (Rholf, 1993).. 68. Figura 3. Árvore filogenética das seqüências de 16S rRNA. de 14. isolados Chromobacterium violaceum: ATCC12472 (Malásia); UCP1461, UCP-1462, UCP-1463, UCP-1464, UCP-1465, UCP-1466, UCP1467,. UCP-1468,. UCP-1469,. UCP-1470,. UCP-1471. (todos. da.

(14) Amazônia), UCP-1489 (Pernambuco) e UCP-1035 (Ceará) tendo como grupo externo Neisseria gonorrhorae, obtido pelo método de NeighborJoining com bootstrap 500 e modelo de Tamura-Nei (Mega4).. 70. Figura 4. Árvore filogenética das seqüências de 16S rRNA de 14 isolados Chromobacterium violaceum ATCC12472 (Malásia); UCP-1461, UCP-1462, UCP-1463, UCP-1464, UCP-1465, UCP-1466, UCP-1467, UCP-1468, UCP-1469, UCP-1470, UCP-1471 (todos da Amazônia), UCP-1489 (Pernambuco) e UCP-1035 (Ceará), obtido pelo método de Neighbor-Joining com bootstrap 500 e modelo de Tamura-Nei (Mega4). 71. SEGUNDO ARTIGO Figure 1. Primer BOX M: Leader Marker 1Kb, (Invitrogen DNA Ladder)1Chromobacterium violaceum strains: ATCC 12472, 2 – UCP 1461, 3UCP1462, 4- UCP 1463, 5 –UCP 1464, 6-UCP1465, 7-UCP1466, 8UCP1467, 9-UCP1468, 10-UCP1469, 11-UCP1470, 12 –UCP1471, 13UCP 1035, 14 - UCP 1489. Figure 2.. 88. Primer ERIC M: Leader Marker 1Kb, (Invitrogen DNA. Ladder)1- Chromobacterium violaceum strains: ATCC 12472, 2 – UCP 1461, 3-UCP1462, 4- UCP 1463, 5 –UCP 1464, 6-UCP1465, 7UCP1466, 8-UCP1467, 9-UCP1468, 10-UCP1469, 11-UCP1470, 12 – UCP1471, 13-UCP 1035, 14 - UCP 1489. 89. Figure 3. Primer REP M: Leader Marker 1Kb, (Invitrogen DNA Ladder)1Chromobacterium violaceum strains: ATCC 12472, 2 – UCP 1461, 3UCP1462, 4- UCP 1463, 5 –UCP 1464, 6-UCP1465, 7-UCP1466, 8UCP1467, 9-UCP1468, 10-UCP1469, 11-UCP1470, 12 –UCP1471, 13UCP 1035, 14 - UCP 1489 Figure 4. Dendrogram of Chromobacterium violaceum strains based on. 90.

(15) clustering of BOX-PCR, REP-PCR and ERIC-PCR products using the UPGMA algorithm and the Simple Matching coefficient.. 91. Figure 5. Head office of the molecular data with the lineages and type strain of Chromobacterium violaceum using the program NTSYS-PC. 92. TERCEIRO ARTIGO Figure 1: Amplification products corresponding to the chitinase genes of C. violaceum lines, visualized on 1.5% agarose gels: A) ORF Cv1897 (endochitinase) 1- 1Kb Ladder DNA Marker (Invitrogen); 2- ATCC12472 and 3 -UCP1489; B) ORF Cv2935 (chitinase A) 1- 1Kb Ladder DNA Marker (Invitrogen); 2- ATCC12472 and 3- UCP1489.. Figure. 2A:. Multiple. sequence. alignments. of. 101 amino. acids. of. endochitinase of lines of: Chromobacterium violaceum ATCC12472 (BrGene); C. violaceum ATCC12472 (Embrapa-CNPSO); C. violaceum UCP1489 (UNICAP); Hahella chejuensis KCTC2396; Reinekea sp. MED297; Enterobacter sakazakii ATCCBAA-894; Salmonella enterica Choleraesuis SC-B67; Salmonella enterica Paratyphi A ATCC 9150; Salmonella typhimurium LT2; Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi; Shewanella woodyi ATCC 51908, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449 and Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC, obtained by the programme ClustalW. Sites in grey are synonymous with C.violaceum.. 103. Figure 2B: Domain of the enzyme chitinase of glycosyl hydrolase family 19 for line UCP 1489, according to the Blast-PDB result. Numbers in blue represent amino acid residues.. 104. Figure 2C: Tree of amino acid sequences of the Chromobacterium violaceum lines ATCC 12472 (BrGene); C. violaceum ATCC12472 (Embrapa-CNPSO);. C.. violaceum. UCP1489. (UNICAP);. Hahella.

(16) chejuensis KCTC 2396; Reinekea sp. MED297; Enterobacter sakazakii ATCC. BAA-894;. Salmonella. enterica. subsp.. enterica. serovar. Choleraesuis str. SC-B67; Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150; Salmonella typhimurium LT2; Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi; Shewanella woodyi ATCC 51908, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449 and Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC, which corresponds to chitinase of the glycosyl hydrolase family 19 (endochitinase).The dendrogram was constructed using the UPGMA algorithm and the robustness of the inferred trees was evaluated by 500 bootstrap resamplings.. 104. Figure 3A- Multiple alignments of amino acid sequences of chitinase A of the Chromobacterium violaceum lines UCP1489 (UNICAP); C. violaceum ATCC 12472 (BrGene); C. violaceum ATCC12472 (Embrapa-CNPSO); Xanthomonas sp. AK; Aeromonas sp. 10S-24; Vibrio cholerae MZO-2; Vibrio cholerae AM-19226; Vibrio cholerae 1587; Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961; Vibrio cholerae O395; Vibrio parahaemolyticus AQ3810. obtained by the programme ClustalW. Sites in grey are synonymous with those of Chromobacterium violaceum and highlighted letters are β-6 strands of glycosyl hydrolase family 18.. 107. Figure 3B: Domain of the COG3469 of enzyme chitinase of glycosyl hydrolase family 18 for line UCP 1489 according to the result Blast-PDB. Numbers in blue represent amino acid residues. Figure 3C: Tree of amino acid sequences of lines of Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (BrGene); C. violaceum ATCC12472 (EmbrapaCNPSO); C. violaceum UCP1489 (UNICAP); Aeromonas sp. 10S-24; Vibrio cholerae MZO-2; Vibrio cholerae AM-19226; Vibrio cholerae 1587; Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961; Vibrio cholerae O395; Vibrio parahaemolyticus AQ3810, corresponding to the chitinase region COG3469. The dendrogram was constructed using the UPGMA algorithm and the robustness of the inferred trees was evaluated by 500. 108.

(17) bootstrap resamplings.. 109. QUARTO ARTIGO Figura 1. Zonas de degradação de quitina coloidal formada por linhagem de C. violaceum. Nos poços foram adicionados 100μL do sobrenadante de células resultante do cultivo após 48h e uma zona de clareamento foi produzida na quitina coloidal. A – Linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC12472; B – Isolado de C. violaceum UCP1489; C – Marcador de quitinase Serratia marcescens (Sigma).. 122. Figura 2. Gel de atividade quitinásica em linhagem de C. violaceum. 1Marcador de quitinase Serratia marcescens (Sigma); 2- linhagem padrão de C. violaceum ATCC12472; 3- padrão de C. violaceum ATCC12472 em meio induzido com quitina coloidal; 4- isolado de C. violaceum UCP1489; 5- isolado de C. violaceum UCP1489 em meio LB induzido com quitina coloidal.. 123. Figura 3. Gel de SDS-PAGE em linhagem de C. violaceum. 1- marcador de proteína; 2- linhagem padrão de C. violaceum ATCC12472; 3linhagem padrão de C. violaceum ATCC12472 em meio LB induzido com quitina coloidal; 4- isolado de C. violaceum UCP1489; 5- isolado de C. violaceum UCP1489 em meio LB induzido com quitina coloidal após 48h de cultivo.. 124. Figura 4: Estudo da atividade quitinolítica (NAcGlc, NAcGlc2, NAcGlc3) das proteínas secretadas no extrato do sobrenadante de C. violaceum cultivado em meio LB: A – Linhagens ATCC12472; B- Linhagem UCP 1489. Os ensaios foram feitos em triplicata e os resultados representam à média aritmética. Figura 5. Análise do produto de transcrição do gene quitinase (quitinase. 125.

(18) A e endoquitinase) por meio de reações de RT-PCR semi-quantitativo. O cDNA foi preparado de RNA total de Chromobacterium violaceum ATCC12472 e UCP1489 A- 8 horas , B- 24 horas, C- 48 horas e D- 72 horas. Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose a 1,5%.. 127.

(19) LISTA DE TABELAS. PRIMEIRO ARTIGO Tabela 1. Relação dos isolados de Chromobacterium violaceum suas origens e substratos analisados quanto a diversidade genética das composições dos ácidos graxos e seqüência de rRNA 16S.. 61. Tabela 2. Análise do cálculo de distância dos pares das seqüências de rRNA 16S de 14 isolados Chromobacterium violaceum: ATCC12472 (Malaysia); UCP-1461, UCP-1462, UCP-1463, UCP-1464, UCP-1465, UCP-1466, UCP-1467, UCP-1468, UCP-1469, UCP-1470, UCP-1471 (Amazônia), UCP-1489 (Pernambuco) e UCP-1035 (Ceará), obtido pelo modelo de Tamura-Nei (Mega4).. 68. SEGUNDO ARTIGO Table 1. Chromobacterium violaceum isolates and reference strain used in this study. 86. TERCEIRO ARTIGO Table 1. Primer sequences used for DNA amplification of C. violaceum isolates. 99.

(20) LISTA DE ABREVIATURAS 16S rRNA: RNA ribossomal de 16S AFLP: Amplified Fragment Lenght Polymorfism (análise de polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado) ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (análise de restrição de DNA ribossomal amplificado) ATCC – American Type Culture Collection BLAST - Basic Local Alignment Search Tool BOX - Box elements (elemento BOX) cDNA – Complementary DNA (DNA complementar) DNA - Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico) dNTP. –. 2’-deoxynucleotides. 5’triphosphates. (Desoxirribonucleotídeos. Fosfatados) EDTA – Ethylenediaminetetracetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético). ERIC - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (seqüências repetitivas enterobacterianas intergênicas de consenso) FAME - fatty acid methyl ester (ésteres metílicos de ácidos graxos) HHL – Hexanoil Homoserina Lactona LB – Luria-Bertani mRNA – RNA mensageiro NCBI - National Center for Biotechnology Information ORFs – Open Reading Frame PCR - Polymerase Chain Reaction (análise pela reação em cadeia da polimerase) PHAs – Polihidroxialcanoatos rDNA – Ácido desoxirribonucléico ribossomal REP - repetitive extragenic palindromic (seqüências de elementos extragênicos repetitivos palindrômicos) Rep-PCR - Repetitive extragenic palindromic-PCR RNA - Ribonucleic acid RNAse – Ribonuclase A SDS – Sodium duodecyl sulfate (dodecilo sulfato de sódio).

(21) RESUMO Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, pigmentada, aeróbica facultativa, que vive em regiões de climas tropicais e subtropicais, encontrada principalmente, em solos e rios. Seu potencial biotecnológico demonstrado foi através do genoma seqüenciado da C. violaceum ATCC 12472, que apresentou genes desconhecidos relacionados à biossíntese de quitina. Neste trabalho foi avaliada inicialmente a diversidade genética de quatorze linhagens de C. violaceum de diferentes procedências, utilizando métodos bioquímicos e moleculares, das quais duas foram selecionadas para análise do sistema quitinolítico. As linhagens foram crescidas no meio Luria Bertani (LB) e caracterizadas pelo perfil de ácidos graxos e do gene 16S rDNA, e a diversidade genética, pela técnica de rep-PCR. Em seguida, foi realizada a caracterização das linhagens de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 para a biossíntese de quitina, utilizando células crescidas em meio Luria Bertani (LB) com e sem a presença de quitina coloidal 0,2%, sendo quantificada a atividade quitinásica (gel de atividade e ensaios enzimáticos com dímero e trímero) e proteínas totais. As amostras foram analisadas em gel de eletroforese SDSPAGE, corados com Azul de Coomassie G-250 e os géis da atividade quitinásica foram corados com calcofluor. Para a caracterização do gene de quitinase foram utilizadas seqüências codificadoras de quitinase A e endoquitinase (Cv1897 e Cv2736), utilizando-se o DNA genômico de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 como molde na técnica de PCR (Reação em. Cadeia. da. Polimerase),. usando. oligonucleotídeos. específicos.. A. metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Os resultados do perfil de ácido graxos e 16S rDNA permitiu a caracterização das linhagens e o rep-PCR demonstrou que as linhagens estudadas apresentam uma diversidade genética. As linhagens de C. violaceum selecionadas apresentaram um perfil diferenciado de atividade quitinolítica em gel desnaturante com a presença de glicol quitina. Nos ensaios com os substratos sintéticos (N,N”- diacetilquitobiose e N, N’, N’’-triacetilquitotriose), verificou-se que houve atividade para ambos os.

(22) substratos. Os resultados indicaram que os maiores valores da atividade quitinolítica foram observados usando-se o cromóforo diacetilquitobiose. A seqüência codificadora do gene CV1897 (endoquitinase) apresentou 439 aminoácidos, correspondendo ao domínio quitinase (CDD:29557) da família 19 da glicosil hidrolase (257 aminoácidos), formada por enzimas que catalisam e hidrolisam as unidades β-1,4-N-acetil-D-glucosamina ligadas no polímero de quitina. Além desta região, as bases restantes proporcionaram a formação de dois sítios, um putativo para a construção de açucares e outro constituído por resíduos catalíticos. A seqüência correspondente ao produto do gene Cv2935 sugere uma provável quitinase A no genoma de C. violaceum ATCC 12472 (BrGene), sendo formada por 439 aminoácidos. Observou-se duas regiões: i) a ChtBD3 como um domínio obrigatório para quitina tipo 3 (29..73) e CDD:47799; ii) a quitinase A com um CDD: 33272 responsável pelo transporte e metabolismo de carboidratos (109..419), pertencente a família 18 da glicosil hidrolase. Os resultados obtidos caracterizaram a C. violaceum UCP 1489 com alta identidade com a linhagem ATCC 12472, demonstrando também, ambos aspectos biotecnológico de produção das enzimas quitinase A (exoquitinase) da família 18 e a endoquitinase da família 19.. Palavras. Chave:. Diversidade. Chromobacterium violaceum.. genética,. endoquitinase,. quitinase. A,.

(23) ABSTRACT. Chromobacterium violaceum is a Gram-negative bacterium, pigmented, aerobics optional, who lives in regions of tropical and subtropical climates, mainly found in soil and rivers. Considering its potential biotechnology demonstrated by the genome sequenced of C. violaceum ATCC 12472, which submitted unknown genes related to the biosynthesis of chitin. This work assessed the genetic diversity of fourteen strains of C. violaceum of different origins, using biochemical and molecular methods. The strains were grown in Luria Bertani (LB) medium and characterized by the profile of fatty acids and the gene 16S rDNA, and the genetic diversity, the technique of rep-PCR. It was then held the characterization of strains of C. violaceum ATCC 12472 and UCP 1489 for the biosynthesis of chitin using cells grown in the Luria Bertani (LB) with and without the presence of colloidal chitin 0.2%, and quantified the chitinolytic activity (gel of enzymatic activity and trials with dimeric and trimeric) and total protein. The samples were analyzed in gel electrophoresis, SDSPAGE, stained with Coomassie brilliant blue G-250 and gels of chitinase activity were stained with calcofluor. For the characterization of the gene for chitinase were used coding sequences of A chitinase and endochitinases (Cv1897 and Cv2736), using the genomic DNA of C. violaceum ATCC 12472 and UCP 1489 as mold in the technique of PCR (Polymerase Chain Reaction), using primers specific. The methodology employed involved the use of bioinformatics tools for exploiting information from the genome, as structure of genes, the setting, fields and grounds preserved. The results of the profile of fatty acid and 16S rDNA allowed the characterization of strains and the rep-PCR showed that the strains studied have a genetic diversity. The strains of C. violaceum selected had a different profile of chitinolytic activity in denaturant gel in the presence of glycol chitin. In trials with the synthetic substrates (N,N’-diacetylchitobioside. and. N,N’,N’’-triacetylchitotriose), it was found that there was activity for both substrates. The results showed that the highest values of the chitinase activity were observed using the chromophore diacetylchitobioside. The encoder sequence of the gene Cv1897 (endochitinase) had 439 amino acids,.

(24) corresponding to the field chitinase (CDD: 29557) of the family 19 of glycosyl hydrolases (257 amino acids), formed by hydrolysing enzymes that catalyze and the units β - 1, 4-N -acetyl-D-glucosamine linked polymers in the chitin. Beyond this region, the bases remaining provided the training of two sites, a putative for the construction of sugars and another consisting of catalytic residues. The sequence corresponding to the product of the gene Cv2935 suggests a probable chitinase A in the genome of C. violaceum ATCC 12472 (BrGene), and is made up of 439 amino acids. There was two regions: i) the ChtBD3 as a mandatory field for chitin type 3 (29 .. 73) and CDD: 47799; Ii) the A chitinase with a CDD: 33272 responsible for the transport and metabolism of carbohydrates (109 .. 419), belonging to family 18 of glycosyl hydrolases. The results characterized the C. violaceum UCP 1489 with high identity with the strain ATCC 12472, also demonstrating, both aspects of biotechnological production of enzymes A chitinase (exochitinase) family 18 and endochitinase the family 19.. Keywords: Genetic diversity, endochitinase, A chitinase, Chromobacterium violaceum..

(25) 1. INTRODUÇÃO. Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas como. componentes. fundamentais. de. cadeias. alimentares. e. ciclos. biogeoquímicos. Apesar de sua grande importância na manutenção da biosfera, estima-se que menos de 10% dos microrganismos existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos (Stanley, 1998). Estudos sobre abordagens ecológicas e registros de diversidade bacteriana do meio ambiente são muito escassos. Atualmente, pouco se sabe sobre a função das bactérias nos ecossistemas, pois a maioria ainda não foi catalogada e não se encontrou uma metodologia adequada para o cultivo em laboratório. Buscando uma inovação nesta área, a ecologia molecular microbiana sofreu grandes avanços devido às técnicas do DNA recombinante, no final do século XX. Assim, o avanço das metodologias de biologia molecular aplicadas ao estudo dos microrganismos tem contribuído significativamente para os estudos sobre a diversidade microbiana (Amann et al.,1995; Zhou et al., 1996; Borneman & Triplett 1997; Cullen & Hirsch, 1998; Sandaa et al., 1998). Tais metodologias utilizam o DNA genômico total, extraído diretamente do meio ambiente e amplificações via PCR. Clonagem e seqüenciamento do gene do DNA/RNA ribossomal (rDNA/rRNA) tornam possível a identificação dos microrganismos ainda desconhecidos e não cultivados (Borneman et al., 1996; Canhos et al., 1997; Valadares-Inglis & Melo, 1998; Dojka et al., 1998; Macrae, 2000; Kent & Triplett, 2002). Além disso, essas metodologias podem ser aplicadas para identificar genes a serem usados na biossíntese de produtos farmacêuticos e outros usos industriais e caracterizar genes de bactérias do meio ambiente, do solo e da água. (Sebat et al., 2003). Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa com ocorrência comum em regiões tropicais e subtropicais. Diante do seu grande potencial biotecnológico, a C. violaceum foi escolhida como modelo para ter seu genoma seqüenciado pelo consórcio do Projeto Genoma Nacional Brasileiro (Vasconcelos et al., 2003). Os dados obtidos no final do.

(26) seqüenciamento forneceram um mapa com os possíveis genes, distribuídos em um único cromossomo circular de 4.751Kb com alto conteúdo de C+G (64,83%). O número de ORFs (Open reading frames) foi de 4.431, com um tamanho médio de 945 pb e que cobrem 89% do genoma, sendo que 2.717 (61%) apresentaram homologia com proteínas conhecidas, de acordo com dados disponíveis de banco de dados (www.brgene.lncc.br/cviolaceum). Aproximadamente um terço das famílias de proteínas identificadas estão relacionadas a funções de transporte e um quarto possui função desconhecida (Vasconcelos et al., 2003). Quanto à filogenia, a linhagem seqüenciada mostrou 17,4% de similaridade com Ralstonia solanacearum, 9,75% com Neisseria meningitidis sorotipo A e 9,61% com Pseudomonas aeruginosa. As maiores similaridades com R. solanacearum foram identificadas em ORFs de genes relacionados a interações ambientais, como modificações pós-traducionais, motilidade celular, transporte de íons inorgânicos e síntese de metabólitos secundários, e cerca de 50% dessas ORFs estão ausentes em N.meningitidis. Como C.violaceum e R. solanacearum são bactérias de vida livre, esses dados sugerem que a adaptação ambiental está ligada à presença ou ausência de determinados genes (Neiva, 2005).. OBJETIVO GERAL Foi avaliar inicialmente a diversidade genética de quatorze linhagens de C. violaceum de diferentes procedências, utilizando métodos bioquímicos e moleculares, das quais duas foram selecionadas para análise do sistema quitinolítico.. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Avaliar a diversidade genética e bioquímica das linhagens de C.violaceum a partir de sua seqüências do gene 16S rRNA e análise dos graxos ácidos..

(27) 2. Caracterizar a diversidade molecular das linhagens a partir de marcadores Rep-PCR. 3. Identificar os genes de quitinase envolvidos na degradação de quitina. 4. Avaliar a regulação da secreção do sistema quitinolítico de na presença de quitina. 5. Isolar o produto gênico correspondente as ORFs (Cv1897 e Cv2935) de quitinases..

(28) 2. REVISÃO DE LITERATURA. 2.1 Chromobacterium violaceum - Histórico Chromobacterium violaceum foi observada pela primeira vez em 1867. Em 1882 Compt Rendues d’ Academie du Science, publicou um artigo descrito por Boisbaudran, o qual relatou a formação de uma coloração violeta sobre um preparado à base de arroz, onde o autor referiu o microrganismo como sendo um “pequeno organismo” (Boisbaudran, 1882). Mais tarde, DeMoss definiu o “pequeno organismo” e o pigmento descrito por Boisbaudran, como sendo provavelmente a Chromobacterium violaceum e a violaceína respectivamente, por causa do espectro de absorção de luz visível registrado pelo próprio Boisbaudran (De Moss, 1967). Em 1880 em estudo independente, Bergozini fez uma descoberta acidental enquanto trabalhava com soluções de ovoalbumina. Inicialmente ele suspeitou da espécie Cromococcus violaceus, pois era o único microrganismo conhecido que produzira a coloração, entretanto esta possibilidade logo foi descartada devido à insolubilidade dos pigmentos. Após vários testes, Bergozini conclui que se tratava de uma nova espécie de bactéria, e nomeou-a de Cromobacterium violaceum, e publicou em 1881 a descoberta da nova bactéria “colorida” (Bergozini, 1881). Logo depois, Zimmerman corrigiu a ortografia de Cromobacterium dado por Bergozini para Chromobacterium violaceum, adicionando o ch ao nome (Balows et al., 1992; Buchanan, 1918; Zimmerman, 1881). Entretanto, por um longo período a Chromobacterium violaceum foi chamada de Baccilus violaceus (Tobie, 1934). Hoje, o gênero, descrito por Sneath, é encontrado no Manual de Bacteriologia Sistemática de Bergeys (Holt & Frieg, 1984). No Brasil foi identificada pelo professor Wilson Chagas de Araújo, do Instituto de Microbiologia da UFRJ em 1976, quase um século depois da sua descoberta, na estação de tratamento de água na cidade de Manaus (Amazonas) e os resultados indicaram a presença de colônias bacterianas: brancas e violetas. (Durán & Menck, 2001). A suspeita de que a violaceína.

(29) seria um protetor contra a irradiação solar para a bactéria iniciou com Caldas (1977), seus estudos demonstram o potencial fototerapêutico da violaceína (Durán & Faljoni-Alario, 1980). A partir de então, muitos estudos têm sido realizados com esta bactéria.. 2.1.1 Considerações sobre a Bactéria Chromobacterium violaceum Chromobacterium violaceum, é classificada como β-proteobacteria, ordem Neisseriales, família Nesseriaceae, (Garrity & Holt, 2001), Gramnegativa, anaeróbia facultativa, com formato de bastonete, e dimensões de aproximadamente 0,5 a 1 μm por 2 a 3 μm (Figura 1). Locomove-se por meio de um flagelo polar e de vários flagelos laterais. Primariamente, a função do flagelo nessa espécie é a locomoção, mas em respostas quimiotáticas, em que a C. violaceum responde eficientemente para mudanças químicas na composição do ambiente, existe um talentoso sinal de transmissão entre complexos receptores e motores flagelares (Pereira et al., 2004). Ocorre uma modulação na direção da rotação flagelar e conseqüentemente altera a direção do nado. C. violaceum, é uma entre os milhões de espécies de microrganismos de vida livre, que habita o solo e águas ao redor do mundo em extensas áreas na biodiversidade tropical e subtropical, registrado geograficamente entre latitudes 35 graus Norte e 35 graus Sul (Richards, 1993). No Brasil, a bactéria é encontrada em elevada abundância nas margens e águas do Rio Negro, sendo o maior componente da Bacia Amazônia (Caldas, 1977; Caldas et al., 1978). É definida como bactéria saprófita, ocasionalmente pode atuar como um patógeno oportunista em animais e seres humanos e causar lesões de pele ou abscessos no fígado e ou pulmão, além de causar septicemia (infecção generalizada) (Hungria et al., 2004). Wooley (1905) descreveu pela primeira vez seu potencial patogênico, ao comprovar que este microrganismo causava infecções em búfalos d’ água nas Filipinas, por septicemias..

(30) Figura 1– Micrografia eletrônica da Chromobacterium violaceum. Disponível em www.unb.br/acsweb/imagens/bactéria1.jpg,. Posteriormente, verificou-se que esta bactéria pode causar também infecções em outros animais como porcos (Liu, et al. 1989; Wijewant & Weittimum, 1969), macacos (Collins et al., 1985; Kumar et al., 1999; McClure at al.; 1976), carneiro (Carrasco et al., 1996), e cães (Gogolewski, 1983). Apesar dos relatos de contágio por C. violaceum em humanos sejam escassos, devese alertar para o fato de que esta bactéria é encontrada freqüentemente na natureza e causa infecção grave, geralmente associado com uma alta taxa de mortalidade. Muitos pacientes apresentam febre inicialmente, lesões cutâneas (abscessos) e distensão do abdome, com um rápido progresso sistêmico. Investigações radiológicas evidenciaram septicemia associada com abscessos em múltiplos órgãos como fígado, pulmão, baço e cérebro. Outras apresentações são celulites no local do trauma, infecções no trato urinário, linfadenites, osteomielites, sinusites, celulite orbital e meningites (Moore et al., 2001; Chou et al., 2000). A porta de entrada para a contaminação com C. violaceum, deve ocorrer por pequenos traumas na pele como fraturas ou rachaduras, expostas ao solo ou águas estagnadas ou correntes contaminadas com este microrganismo. Raramente ocorre contaminação por via oral, sendo mais comum em casos de pneumonia (Desjardins, 1999). Acredita-se que em pacientes imunodeprimidos, acometidos por doença granulomatose crônica, leucocitose polimorfonuclear G6PD,. infecção. HIV. e. outras. imunodeficiências,. existe. uma. maior.

(31) predisposição para infecção com C. violaceum (Macher et al., 1982; Manlock, 1987). Entretanto, são condições questionáveis, visto que já foi relatado um caso de infecção severa com C. violaceum em uma criança de 12 anos, que não apresentava imunodepressão (Bilton & Johnson, 2000). Existem mais de 150 relatos de casos de septicemia em humanos (Ray et al., 2004). A primeira ocorrência de contaminação por C. violaceum em humanos foi descrita em 1927 (Sneath et al., 1953). Outros casos sérios e algumas infecções fatais foram reportados na Argentina, Austrália, Brasil, Cuba, Nigéria, Singapura, Taiwan, Estados Unidos, Vietnã, Sri Lanka, Índia, Senegal, Hong Kong e Itália (Balows, 1992; Blereau, 1980; Bilton & Johnson, 2000; Chong & Lam, 1997; Farrel et al., 1979; Fombuena et al., 1998; Geoghiou et al., 1989; Hassan et al., 1993; Hiraoka et al., 1999; Huffam et al., 1998; Johnson et al., 1971; Kaufman & Schugurensky, 1986; Lee et al., 1999; Machin et al., 1986; Martin & Brimacombe, 1992; Ognibene & Thomas, 1970; Onile & Odugbemi, 1984; Petrillo et al., 1984; Ponte & Jenkins, 1992; Roberts et al., 1997; Sneath et al., 1953; Starr et al.1981, Ti et al., 1993; Wilkey & Mcdonald, 1983). Os casos de infecções até agora registrados, foram ocasionados por bactérias pigmentadas e aquelas não pigmentadas, que são deficientes na síntese de pigmento-violaceína (Miller et al., 1988). As espécies não pigmentadas são mais difíceis de identificar devido à similaridade bioquímica com as espécies Aeromonas hydrophila e Pseudomonas spp. Portanto, a patogenicidade não parece estar associada à produção de violaceina. Os fatores que contribuem para a virulência da C. violaceum podem ser atribuídos aos lipopolissacarídeos da membrana plasmática ou à produção de metabólitos e enzimas que interferem com a função fagocitária do hospedeiro (Schoromm et al., 2000; Miller et al., 1988; Zins et al, 2001). A C. violaceum é um organismo de vida livre e a via metabólica central e intermediária desta bactéria inclui a síntese e catabolismo de todos os 20 aminoácidos, bem como os nucleotídeos purina e pirimidina. Além disso, possuem vias metabólicas para a síntese de uma ampla faixa de cofatores e vitaminas. É capaz de realizar a biossíntese de polissacarídeos complexos como celulose (mas não glicogênio) e também síntese e degradação de uma variedade de lipídeos, que são utilizados para a formação de membrana e.

(32) armazenamento. energético,. incluindo. triacilglicerol,. fosfolipídeo. e. lipopolissacarídeo (Brazilian National Genoma Project Consortium, 2003). A abundância notável de C. violaceum no Rio Negro indica uma capacidade de resistir a uma ampla variedade de condições ambientais severas, incluindo a escassez de nutrientes, altas temperaturas, próximas de 37°C, sendo incapaz de sobreviver a 4°C (Efthimion, 1969), altos níveis de radiação, e elevadas concentrações de agentes tóxicos, incluindo espécies reativas ao oxigênio. A capacidade de sobrevivência de C. violaceum nestas condições ambientais é facilitada pelo seu metabolismo versátil, capaz de utilizar uma ampla faixa de fontes de energia através do uso de oxidases e redutases apropriadas, o que permite também a sua capacidade de respiração aeróbia e anaeróbia (Brazilian National Genoma Project Consortium, 2003). 2.1.2 Produção de Metabólitos, Pigmentos e Enzimas A Chromobacterium violaceum é uma bactéria versátil, responsável pela produção de uma variedade de metabólitos secundários com grande interesse biotecnológico. Esta bactéria tem sido objeto de estudo para muitos pesquisadores, devido à sua característica fenotípica marcante: a produção da violaceína (Figura 2) (Bromberg & Duran, 2001). Desde 1867, este pigmento de cor metálica violeta escura, descrito como violaceína é objeto de estudo (August et al., 2000; Bromberg & Duran, 2001). Reilly e Pyne em 1927 foram os primeiros a estudar detalhadamente a estrutura química do pigmento violeta. Desde então, muitas propostas sobre a estrutura da violaceína foram reportadas e, mais tarde provadas incorretas (Reilly & Pyne, 1927). A dedução correta de sua estrutura ocorreu somente em 1958, por meio de estudos de síntese e degradação (Ballantine et al., 1958). A estrutura química da violaceína está bem definida e consiste de três porções: 5 – hidroxiindol, oxindol e um anel pirrolidone na parte central da molécula. Existem outros metabólitos. produzidos. minoritariamente. pela. bactéria,. como. a. desoxiviolaceína. Este pigmento parece ser ainda mais interessante que violaceína,. mas. pouco. estudado. devido. a. sua. baixa. produtividade.. Desoxiviolaceína difere da violaceína, na porção 5-hidroxindol pela ausência do grupo hidroxila o que torna a molécula menos polar (Hoshino & Momen, 2000)..

(33) Figura 2: Aspecto geral de C. violaceum em meio LB-ágar, cultivadas a 30°C por 24 horas Em estudos relacionados com a síntese de violaceína, observou-se que ao oxigenar culturas de C. violaceum houve um aumento significativo na produção do pigmento, indicando uma relevância do oxigênio molecular para a síntese. Outros estudos demonstraram que o pigmento é sintetizado a partir de duas moléculas de L-triptofano (Hoshino & Momen, 2000). Utilizando o Ltriptofano marcado com C14 em diferentes posições, foi demonstrado que Ltriptofano foi incorporado quase que totalmente à molécula da violacéina, exceto o carbono (C1), o qual é provavelmente retirado por descarboxilação durante a biossíntese do pigmento. Estudos posteriores, usando o triptofano marcado nas posições [2-C13] e [3-C13], revelaram que o átomo de carbonos do grupo 2-pirrolidone da violaceína é oriundo da cadeia lateral do L-triptofano (C1, C2, C3). Nesse mesmo trabalho, demonstrou-se que uma mudança do tipo 1,2 ocorre em um processo intramolecular para formar a porção esquerda (lado 5-hidroxindol) do esqueleto da violaceína. Também foi verificado que a ligação C-C do C2 do anel indólico da cadeia lateral do triptofano foi completamente mantida para formar a porção direita (lado oxindole) da violaceína, indicando que o lado direito da molécula de triptofano é inteiramente incorporado à estrutura da violaceína sem nenhuma modificação. Durante a biossíntese, o carbono carboxílico é removido em um passo posterior, provavelmente após a condensação entre as cadeias laterais. Todos os átomos de nitrogênio são originados exclusivamente do triptofano. A.

(34) incorporação de átomos de oxigênio dentro da molécula de violaceína é catalisada por oxigenase e a hidroxilação, primeiro passo da biossíntese, na posição-6 na violaceína é mediada por uma monooxigenase (Hoshino & Momen, 2000) mais especificamente pela enzima triptofano hidroxilase (Lentendre et al., 1974). Outras enzimas foram isoladas e caracterizadas da C. violaceum. Por exemplo, L-triptofano-2.,3.-oxidase catalisa a formação de uma dupla ligação entre os carbonos Cα e Cβ do triptofano (Genet et al., 1995). Geneticamente, a via de biossíntese de violaceína é codificada por um conjunto de quatro genes, denominados de vioABCD organizados em um operon, encontrados em um fragmento de DNA de 8 Kpb. Os genes vioA, vioB, vioC e vioD possuem 1254 pb, 2994 pb, 1287 pb e 1119 pb respectivamente. A síntese da violaceína encontra-se em estágio avançado de análise, uma vez que o uso desses fragmentos de DNA permitiu a forte expressão heteróloga de violaceína em E. coli, pela obtenção de colônias violeta (Pemberton, et al., 1991). A análise da seqüência dos genes da violaceína, indica que o vioA, vioC e vioD codificam para monooxigenases e o vioB é uma policetídeo sintase, enzima que catalisa a formação de ligação peptídica sem participação de ribossomo. Esta enzima é encontrada em microrganismos que sintetizam antibióticos (August et al., 2000). Em estudos com radioisótopo, sugeriu-se que além do L-triptofano, a C. violaceum é capaz de sintetizar violaceína a partir do ácido 3-indol acético, metabólito precursor de L-triptofano (Durán et al., 1994). Têm sido propostos vários compostos intermediários da biossíntese da violaceína, como ácido cromopirrólico, proviolaceína, prodeviolaceína, oxiviolaceína e outros (Hoshino & Momen, 2000). Contudo, a via de biossíntese de violaceína e seus intermediários. não. estão. completamente. elucidados.. Estudos. prévios. demonstraram que, por fazerem parte do metabolismo secundário, a produção de violaceína e intermediários é grandemente favorecida por baixas concentrações de carbono ou substratos de baixo rendimento energético, como glicerol, manitol e amido, o qual não é metabolizado pela bactéria. Condições que favoreçam um grande crescimento celular desfavorecem a biossíntese de violaceína (Antônio, 1994). Observou se que a produção de pigmentos minoritários ocorre concomitantemente à produção de violaceína, utilizando glicerol como fonte de carbono (Caris, 2003)..

(35) O. papel. fisiológico. da. violaceína. para. a. bactéria. permanece. desconhecido, sabe-se que o pigmento é produzido quando a bactéria é cultivada em aerobiose. A partir da determinação do alto coeficiente de extinção molar da violaceína (ε= 1,7.10 L.mol . cm 4 -1 -1, λ=570nm) e baixa solubilidade em água, sugeriu-se que o pigmento estivesse envolvido na proteção contra efeitos da radiação solar sobre o microrganismo. Outros estudos sugeriram ainda que o pigmento pudesse estar relacionado à regulação da concentração de triptofano, uma vez que este aminoácido em altas quantidades seria tóxico para a bactéria. A produção de violaceína poderia, então, estar envolvida na regulação da concentração de triptofano, mantendo os níveis adequadamente baixos (DeMoss, 1967; Durán & FaljoniAlario, 1980). A expressão de muitas características fenotípicas em fase tardia de crescimento nas bactérias Gram-Negativas, como as diferenciações celulares, produção de metabólitos secundários e exoenzimas, são fenômenos dependentes de densidade celular mediado por um complexo sistema de comunicação celular, processo conhecido como “quorum sensing”. A sinalização é intercelular e se processa através de um sinal molecular. A molécula de sinalização é uma N-acil homoserina lactona, a qual tem um baixo peso molecular, e sua concentração extracelular está relacionada com a densidade populacional das bactérias. Está molécula sinalizadora, controla a expressão de diversas funções fisiológicas da bactéria (Whitehead, 2001). A sinalização é transmitida em função das flutuações ambientais, como diferenças de pH, temperatura, disponibilidade de nutrientes e outras. Este fenômeno ocorre porque as bactérias têm desenvolvido múltiplos sistemas que permitem a sua adaptação ao ambiente. Existe uma extensa gama de microrganismos que têm a capacidade de perceber e responder à presença de populações vizinhas (Whitehead, 2001). Alguns trabalhos têm mostrado que a produção de violaceína em C. violaceum é induzida pela presença de moléculas de N-acil homoserina lactonas. Estudos com mutantes de C. violaceum deficientes na produção de violaceína provaram que o quorum sensing é um mecanismo regulatório gênico (Blosser, 2000). Estudos têm confirmado a importância dos metabólitos produzidos pela C. violaceum. Alguns são de grande interesse, como os.

(36) potenciadores de antibióticos β-lactâmicos glicopeptideos SQ28,504 e SQ28,546, os quais possuem ação especificamente com antibióticos βlactâmicos contra bactéria Gram-negativa. Antibióticos como aerocianidim, aerocavin, exibem atividade in vitro contra bactéria Gram-negativa e Grampositiva e foi encontrado gene responsável pela síntese do antibiótico fenazine. Outra substância que inibe o crescimento de bactéria Gram-negativa é o 3,6Diidroxi-indoxazene (também chamado de Y-T0678H, ou 6-Hidroxi-3-oxo-1,2benzisoxazole). Nessa bactéria, observou-se a produção do antitumoral depsipeptídeo FR901228, sendo novo membro de agente antineoplásico, como também, monobactama SB-26.180. Foi isolado da C. violaceum um inibidor de carboxipeptidase e aminopeptidase, o arfamenine B (Durán & Menck, 2001). A C. violaceum tem sido caracterizada como um microrganismo produtor de exopolissacarídeo. O seu genoma mostrou a presença de genes necessários para a biossíntese de celulose, organizados em um provável operon (Brazilian National Genoma Project Consortium, 2003). A produção de polihidroxialcanoatos (PHA) é outra característica importante observada em culturas de C. violaceum. Os PHAs são depositados intracelularmente na forma de grânulos como reservatórios de carbono e energia (Kolibachuk et al., 1999). Verificou-se nesta bactéria a presença de cianeto. A síntese do cianeto tem como precursor glicina e estimulador metionina (Ressler et al., 1973).. 2.1.3 Potencial Biotecnológico Devido. ao. alto. potencial. biotecnológico. e. farmacêutico,. a. Chromobacterium violaceum e o seu pigmento majoritário, a violaceína, têm sido objeto de estudo de vários grupos de pesquisadores. Lichstein e Van de Sand em 1945 foram os primeiros a fazer um estudo abrangente das propriedades antibióticas da violaceína. Até esta data, haviam sido relatadas mortes por septicemia pela C. violaceum e, em todos os casos, havia sido verificada a ausência de microrganismos contaminantes, indicando a possível atividade antibiótica da violaceína. Verificou-se, inicialmente, que a violaceína possuía efeito inibitório acentuado no crescimento de bactérias Gram (+) e efeito leve para as Gram (-). No entanto, estudos posteriores realizados com violaceína purificada, mostraram que ela é igualmente eficiente para os dois.

(37) grupos (Duran & Menck, 2001). Além disso, também exibe atividade inibitória de fungos fitopatogênicos, tais como Rosellinia necatrix (Shirata et al., 2000). A. violaceína. apresenta. atividade. antibacteriana. in. vitro. contra. Mycobacterium tuberculosis, em concentrações comparáveis àquelas descritas na literatura para a pirazinamida, fármaco utilizado no tratamento da tuberculose (De Souza et al.,1999; Duran & Menck, 2001). A violaceína apresenta, ainda, propriedades tripanossomicidas (Duran & Menck, 2001) e atividade antileishmania (Leon et al., 2001). Estudos de citotoxicidade realizados com a violaceína em linhagens de fibroblastos V79 demonstraram alta atividade citotóxica, sendo que essa se processa por meio de apoptose e não por necrose. As mudanças morfológicas no núcleo dessas células incluem condensação de cromatina e decréscimo do conteúdo de ácidos nucléicos (Melo et al., 2000). A violaceína apresenta atividade antitumoral, sendo efetiva em culturas de células de algumas leucemias, linfomas, e tumores de pulmão e cólon (Melo et al., 2000) e em linfomas relacionados à AIDS (Duran & Menck, 2001)). Foi relatado que a violaceína, contendo 10% de deoxiviolaceína, apresentou atividade antiviral para vírus herpéticos e para poliovírus (May et al., 1991).. 2.2 As quitinases Na natureza existe uma grande diversidade de oligossacarídeos e polissacarídeos, desempenhando os mais diversos papéis que vão desde reserva de energia até sinalização. Da mesma forma, há também uma grande diversidade de enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas. A superfamília das glicosilhidrolases são enzimas que hidrolisam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos ou entre misturas de carboidratos e demais biomoléculas. Segundo Henrissat (1991), essa superfamília é composta por 81 famílias que hidrolisam os mais variados substratos. Essas enzimas foram classificadas inicialmente por Henrissat (1991 e 1993) de acordo com similaridade na seqüência. de. aminoácidos,. onde. duas. seqüências. que. apresentam.

(38) similaridade em um domínio completo pertencem a uma mesma família. Além desse critério, elas podem também ser classificadas segundo mecanismos de reação (Koshland, 1953), que as categoriza segundo dois mecanismos: o de retenção e o de inversão da configuração do anômero C2 do anel glicosídico. A hidrólise se dá via catálise ácida, onde há um doador de prótons e um nucleófilo. Em ambos, o doador de prótons está próximo ao oxigênio glicosídico e o nucleófilo fica na posição vicinal ao carbono 2 do anel. A diferença é que no mecanismo de inversão a distância do nucleófilo é maior, a fim de comportar uma molécula de água. Essa distância é de cerca de 5,5 Ǻ no mecanismo de retenção e ~10 Ǻ no de inversão (Davies, 1995) na formação do complexo enzima-substrato.. O. ataque. nucleofílico. é. feito. pelos. dois. resíduos. aproximando-se pelo lado oposto da ligação glicosídica e há a retenção ou inversão da configuração anomérica do anel glicosídico (Henrissat, 1995). Embora se possam inferir muitas propriedades dessas proteínas por meio da seqüência de aminoácidos, a estrutura conformacional das glicosilhidrolases apresenta maior conservação quando comparada com a estrutura primária (Davies, 1995). Esse fato leva a um terceiro critério de classificação baseado na estrutura conformacional, e esse critério permite inferir homologia e indicar relações de divergência evolucionária. Essa inferência pode ser feita, pois enzimas com diferentes especificidades de substratos e que estariam separadas em diferentes famílias segundo a estrutura. primária,. poderiam. ser. agrupadas. segundo. a. estrutura. conformacional. Por outro lado, enzimas que hidrolisam o mesmo substrato, e, portanto classificadas como pertencentes à mesma família, podem ser separadas, como é o caso das quitinases, que possuem estrutura primária variável, mas estrutura conformacional semelhante. As quitinases (E.C. 3.2.1.14) são enzimas que hidrolisam a quitina, que é o segundo biopolímero natural mais abundante na natureza, inferior apenas à celulose (Haki et al., 2003). Por sua vez, a quitina é um polissacarídeo linear estruturalmente. semelhante. à. celulose,. cujos. monômeros. são. N. acetilglicosaminas, unidos por meio de ligações glicosídicas do tipo β-1,4. Normalmente a quitina é encontrada na natureza associada a outros polissacarídeos e proteínas, sendo o principal componente do exoesqueleto de.

(39) insetos, parede celular de alguns fungos, conchas de caranguejos e casca de lagostas e camarões. As duas grandes famílias das quitinases são denominadas 18 e 19 e há ainda uma subclassificação para as quitinases encontradas em plantas que se subdividem nas classes I, II, IV e V, dentro da família 19 e III, dentro da família 18 (Iseli, 1996). Essa subdivisão baseia-se, além da similaridade na seqüência de aminoácidos, na presença de um domínio de ligação à quitina ou chitin binding domain (CBD) na região N-terminal, rica em cisteínas altamente conservadas e ligadas por uma pequena região rica em glicina/prolina ao sítio catalítico que está presente nas quitinases de classe I, II e IV (Cohen-Kupic & Chet, 1998). A família 18 engloba quitinases encontradas em bactérias, fungos, animais superiores e plantas (classes III e V). A família 19 inicialmente incluía quitinases somente de plantas das classes I, II e IV, quando então foram isoladas em duas bactérias do gênero Streptomyces (Ohno et al., 1996; Saito et al., 1999). Baseado em dados de cristalografia e modelos teóricos, o mecanismo de reação da família 18 foi proposto como sendo de retenção. Nesse mecanismo um resíduo de aminoácido glutamato no sítio catalítico age como doador de prótons e a carbonila do carbono C2 do grupo acetoamido da quitina age como nucleófilo. A partir da análise cristalográfica da quitinase isolada da cevada (Hordeum vulgare L.), o mecanismo de reação da família 19 foi proposto por Brameld & Goddard III (1998). Nele foram identificados dois resíduos ácidos, um agindo como ácido (Glu 67) e outro como base (Glu 89), separados por 9,3Å. Nesse mecanismo há ainda a participação crucial de outros aminoácidos (Lys165, Asn124 e Asn199) que são altamente conservados em todas as quitinases dessa família e atuam na inversão do anômero (Hart et al., 1993). Uma quitinase pode ainda ser classificada com endoquitinases (EC 3.2.1.14) quando agem aleatoriamente, liberando oligossacarídeos como quitotetrose, quitotriose e quitobiose.. Exoquitinases liberando somente. diacetilquitobiose ou apenas quitobiose (EC 3.2.1.29) (dímeros de Nacetilglicosamina) de uma forma progressiva, a partir da extremidade não redutora do polímero. Por sua vez, a ß-1,4- N-acetilglucosaminidase (EC.

(40) 3.2.1.30) hidrolisa os oligossacarídeos da parede celular, formando monômeros de N-acetilglicosamina (GlcNac) como produto final (Figura 3) (De Marco et al., 2000). Na natureza existe uma grande diversidade de quitinase sendo identificadas em bactérias, plantas, algumas classes de invertebrados e todas as classes de vertebrados (Perrakis et al., 1994). Diante disso, a maioria das seqüências dessas proteínas é altamente conservada em certas regiões e não toleram mutações; no entanto, prováveis adaptações devem ter ocorrido nos organismos que as expressam, fazendo com que em determinadas regiões suas seqüências de nucleotídeos sejam bastante variáveis. A comparação das taxas de mutações silenciosas e não silenciosas, levou a uma classificação em três categorias de genes, uma das quais incluem aqueles envolvidos em mecanismo de defesa contra patógenos (Yang, 2005). Como as quitinases em geral estão relacionadas com esses processos, nos organismos mais distintos pode-se inferir que essa variação é devido a uma pressão seletiva positiva. Essa pressão poderia explicar os múltiplos genes de quitinase às vezes encontrados em um mesmo organismo, como é comum em microrganismos, e na própria Chromobacterium violaceum. Esse processo levaria a duplicações desses genes podendo os mesmos adquirir inclusive outras funções no organismo portador. Entretanto, esse é um fenômeno. que. requer. estudos. compreensão (Neiva 2005).. mais. aprofundados. para. sua. melhor.

(41) Figura 3. Mecanismo de ação das quitinases (Figura cedida por SCHRANK, A.).. 2.2.1 Quitinases Bacterianas Diversos estudos apontam o papel fisiológico e ecológico das quitinases. Na maioria desses estudos concluiu-se que elas estão envolvidas em processos de defesa contra patógenos, mas que também desempenham outros papéis importantes que serão abordados adiante. Tais processos são regulados por cascatas de transdução de sinais como quorum sensing em bactérias (Chernin et al. 1998), elicitores como ácido salicílico, radiação ultravioleta, metais pesados em plantas (Margis-Pinheiro et al., 1999) e oligossacarídeos e metabólitos secundários em outros organismos. As bactérias produzem quitinases para catalisar a degradação de quitina para utilização como fonte de energia (Kitamura, 2002). Como são capazes de habitar todos os ambientes no planeta, as bactérias são capazes de produzir quitinases de todos os tipos, provavelmente para hidrolisar as diversas fontes de quitina na natureza. Interessantemente, algumas bactérias produzem mais de um tipo de quitinase e já foi descrita inclusive uma quitinase bifuncional com.

(42) atividade também de lisozima da linhagem K-187 de Pseudomonas aeruginosa (Cohen-Kupiec & Chet, 1998), sugerindo que algumas bactérias secretam essas enzimas também como atividade antibacteriana tanto contra bactérias Gram-positivas como negativas, além de atividade antifúngica num processo de competição natural. Bactérias também são os principais mediadores da degradação de quitina em ambientes pelágicos, sendo que essa habilidade representa o passo essencial na reciclagem de carbono e outros nutrientes em ambientes marinhos (Baty III et al., 2000).. 2.2.2 Aplicações Biotecnologias das Quitinases As aplicações biotecnológicas de enzimas constituem um vasto campo de possibilidades nas mais diversas áreas como agricultura, medicina e o setor industrial. Nos últimos anos, várias quitinases derivadas de diversos organismos foram isoladas, clonadas e expressas na forma recombinante. A aplicação de quitinases em agricultura objetiva principalmente o controle biológico seja pelo desenvolvimento de bioinseticidas para controle de insetos, fungos e bactérias ou pelo desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao ataque de microrganismos. A aplicação industrial pode vir a ser a obtenção de quitosana e derivados a partir de quitina de crustáceos e ostras. A quitosana, que é a forma desacetilada da quitina, é um polímero de interesse comercial por possuir alto conteúdo de nitrogênio (6,89%). Essa característica a torna um polímero biocompatível, biodegradável, estável à umidade e não tóxico (Kumar, 2000). Como é um polissacarídeo altamente básico, possui propriedades de formar filmes com alta capacidade de adsorção, além ser quelante de íons metálicos. Possui propriedades que a tornam atraente para diversos tipos de indústrias. Como possui carga parcial positiva, interage com tecidos negativamente carregados como pele e cabelos, sendo essa a capacidade bioadesiva o principal fator para seu uso em cosméticos que indicam que a quitosana pode ainda ser utilizada para fins biomédicos no desenvolvimento de pele artificial (Kumar, 2000). A produção de quitosana de carapaça de crustáceos proveniente dos rejeitos da indústria de alimentos é economicamente viável, especialmente se.

(43) incluir a recuperação de carotenóides, uma vez que conchas contem consideráveis quantidades de astaxantina, um carotenóide utilizado como aditivo nutricional em aqüicultura. O processo utilizado atualmente para essa obtenção envolve uma reação de desacetilação e consome 40% de solução de hidróxido de sódio. Esse processo libera resíduo altamente corrosivo de difícil controle e o uso do processo catalítico eliminaria esse inconveniente (Haki et al., 2003). Um outro campo em que pode haver utilização de quitinases é a bioconversão. O consumo de camarões no mundo é muito grande, principalmente em países costeiros. No entanto, somente a carne é consumida e a “casca”, ou seja, o exoesqueleto é jogado fora. Há dados em que em alguns países são produzidos mais de 2,5 milhões toneladas de lixo dessa natureza (Haki et al., 2003 apud Healey et al., 1994). Assim, o desenvolvimento de métodos de conversão desse lixo em produtos derivados de quitina é de grande importância. Todas essas aplicações tornam o isolamento, obtenção e caracterização de quitinases bastante atraentes do ponto vista biotecnológico. Devido às várias possibilidades de aplicação das quitinases, estas enzimas têm sido amplamente estudadas. Diversas quitinases tiveram suas seqüências de nucleotídeos e aminoácidos determinadas e depositadas no banco de dados do NCBI (The National Center for Biotechnology Information). Em alguns casos, modelos de estrutura tridimensional também já estão disponíveis. Os principais microrganismos produtores de quitinases são Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Vibrio vulnificus, Streptomyces spp, Trichoderma. harzanium,. Cellulomonas. flavigena,. Beauveria. bassiana,. Enterobacter sp G-1, Enterobacter agglomerans, Aeromonas sp, entre outros (Wortman et al., 1986, Ueno et al., 1990, Deane et al., 1998, Chen et al., 1997, Matsuo et al., 1999, Chernin et al., 1995 e Huang et al., 1996).. 2.3. Métodos Moleculares de Tipagem Baseados em DNA Métodos baseados em tipagem de DNA geralmente referem-se a técnicas que permitem subdividir espécies em tipos distintos. Estas técnicas são universalmente aplicáveis, altamente reprodutíveis e relativamente fáceis.

(44) de realizar. A análise de fragmentos de restrição de genoma total pode ser feita em gel de agarose e os polimorfismos de comprimentos são assim estabelecidos. A desvantagem deste método é que muitos padrões complexos de fragmentos de DNA são gerados e difíceis de comparar. A análise dos polimorfismos de comprimento de DNA plasmidial possui um padrão de bandeamento mais simples (Vandamme et al, 1996). Para se diminuir o número de fragmentos pode-se selecionar enzimas com freqüência menor de corte no DNA, uma técnica que analisa fragmentos de restrição de baixa freqüência. Estes fragmentos gerados são muito grandes para serem separados por eletroforese em gel de agarose convencional, então se emprega a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), sendo esta técnica considerada como a mais discriminatória (Gordillo et al, 1993). Os padrões gerados depois da digestão com enzimas de restrição, podem ser transferidos para uma membrana e hibridizados com uma sonda marcada que permita revelar os fragmentos (Grimont & Grimont, 1986). Um exemplo é o uso do 16S ou 23S com ou sem a região intergênica marcados com fluorescência e usados como sonda e hibridizados com o DNA do isolado (Bingen et al, 1994). Métodos de tipagem por DNA baseados em PCR têm atraído cada vez mais interesse. Fragmentos de elementos repetitivos dispersos pelo genoma das. bactérias. podem. ser. usados. como. oligonucleotídeos. iniciadores. (Versalovic et al, 1991). A PCR também é usada para amplificar genes de rDNA (com ou sem região intergênica) por oligonucleotídeos iniciadores universais de rDNA. Os polimorfismos entre os diferentes operons de rRNA geram arranjos simples de se analisar (Kostman et al, 1992). Tipagem por DNA baseado em PCR também pode ser combinada com enzimas de restrição no método chamado de análise de restrição de rDNA amplificado (ARDRA). O gene de 16S ou 23S rDNA com ou sem a região intergênica é amplificado por PCR com oligonucleotídeos iniciadores universais e então digeridos com enzimas de restrição combinadas. Estes padrões, em contraste com outros métodos de análise de fragmentos, geram padrões espécie-específico (Gürtler at al., 1991) considerando-se o caráter conservado dos genes de rRNA. Um outro exemplo da combinação de PCR e enzimas de restrição é o AFLP (polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição amplificados) (Zabean, 1993). Neste caso a amplificação seleciona fragmentos.