Chromobacterium violaceum
Maria Luiza Ribeiro Bastos da Silva1, Márcia Vanusa de Silva2, Daniel Jordão Amaral3, Carlos Alberto Alves da Silva4, Hélio Almeida Burity3, Galba Maria de Campos –Takaki4.
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Universidade Federal de Pernambuco,
50670-420 Recife-Pernambuco, Brasil;
2Departamento de Bioquímica - Universidade Federal de Pernambuco, 50670-420 Recife-
Pernambuco, Brasil;
3Laboratório de Genoma - Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária, 50761-000 Recife,
PE, Brasil
4Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, 50050-590
Recife-Pernambuco, Brasil
Resumo
Chromobacterium violaceum é uma bactéria gram-negativa, encontrada em
regiões tropicais, sendo que no Brasil sua maior ocorrência é nas águas do Rio Negro. Com o seqüenciamento do genoma foram encontradas várias ORFs, correspondentes a genes de interesse biotecnológico, e entre eles cinco que codificam quitinases. A importância das quitinases nas áreas da agricultura, biológica e ambiental levou ao extenso estudo de clonagem, expressão gênica e regulação da secreção das quitinases como esforço para aumentar a produção da enzima. Esse trabalho se propôs verificar a habilidade da linhagem UCP1489 de C. violaceum em produzir e secretar enzimas quitinolíticas e a expressão do gene de quitinase na presença de quitina coloidal. A atividade de endoquitinase e exoquitinase foi observada em intervalos de tempo, utilizando o método dos substratos sintéticos e também através da liberação de açucares redutores com quitina coloidal como substrato. Para avaliar a expressão do gene de quitinase foi utilizada a técnica do RT-PCR. A partir dos resultados obtidos podemos considerar que a linhagem UCP1489 é promissora para a produção da enzima quitinase quando comparada à linhagem padrão ATCC12472.
Palavras-chaves: Chromobacterium violaceum, quitinases, expressão gênica e
Introdução
Quitinases, enzimas que catalisam a conversão de quitina (homopolímero linear insolúvel, formado por ligações do tipo β-l,4 de monômeros de 2- acetoamino-2-desoxi-D-glicopiranose N-acetilglicosamina – NAcGlc ou NAG) a componentes monoméricos são amplamente distribuído na natureza (Gooday 1999). As quitinases podem ser classificadas em duas grandes categorias. Endoquitinases (EC 3.2.1.14) clivam aleatoriamente a quitina em locais interno, gerando polímeros ou oligômeros de NAcGlc, como a quitotetraose, a quitotriose e a di-acetilquitobiose. Exoquitinases podem ser divididos em duas subcategorias: quitobiosidases (EC 3.2.1.29 que atuam liberando unidades de di-acetilquitobiose a partir da extremidade não-redutora da quitina, e as 1,4-β-N-
acetilglicosaminidases (EC 3.2.1.30), que clivam oligômeros produzidos pela atividade de endoquitinases e quitobiosidases, liberando monômeros de NAcGlc (Sahai e Manocha 1993). Uma alternativa precursora envolve deacetilação de quitina para quitosana, que é convertido para resíduos de glicosamina pela ação da quitosanase (EC 3.2.1.132).
Elas são produzidas por uma grande variedade de organismos que degradam quitina, incluindo bactérias, fungos, insetos, plantas e animais (Gooday 1990). As funções das quitinases nestes organismos são diversas (Dahiva, et al., 2006). Em bactérias, quitinases desempenhar um papel na nutrição e parasitismo (Wen et al., 2002). Estudos com quitinases bacterianas, como propriedades bioquímicas, estrutura dos genes, mecanismo catalítico envolvidos, bem como estruturas terciárias vêm aumentando rapidamente. A hidrólise da quitina por quitinases é o mais crítico passo na degradação e utilização da quitina por bactérias (Watanabe et al., 1993). No entanto, o estudo de quitinases não é suficiente para elucidar o processo pelo qual a quitina é degradada e utilizada por bactérias. O processo envolve uma série de medidas, incluindo o reconhecimento de quitina, a indução de quitinases, a manutenção de níveis adequados de produção de quitinases, bem como a incorporação e catabolismo dos produtos de degradação.
C. violaceum é uma bactéria Gram-negativa, aeróbica facultativa que vive
em regiões quentes, geralmente em solos e rios. No Brasil é encontrada principalmente às margens do Rio Negro, na Amazônia. Esta bactéria destaca-se por apresentar um grande potencial para aplicações biotecnológicas diversas. Com o seqüenciamento do genoma de C. violaceum linhagem ATCC 12472 pelo BRGene (Brazilian National Genome Project Consortium, 2003) deu origem à necessidade de caracterizar a funcionalidade dos genes anotados presentes no cromossomo dessa bactéria. Em seu genoma foram identificadas várias ORFs (Open reading frames), que codificam para a enzima quitinase, e os dados do seqüenciamento estão disponíveis em servidores Web (www.brgene.lncc.br; www.ncbi.nlm.nih.gov: número de acesso NC 005085.1), onde relatam ORFs de quitinase extracelular que está sobre o controle de quorum sensing (Chernin et al., 1998) e ORFs responsáveis pela habilidade de C. violaceum em sobreviver em meio com quitina como única fonte de carbono e nitrogênio (Streischsbier, 1983). No presente estudo, foi avaliado genes de quitinases envolvidos na degradação e utilização de quitina em C. violaceum. Além disso, foi analisada a secreção de enzimas quitinolíticas em cultura, com a presença da quitina para elucidar como C.
Material e Métodos
Microrganismos
A linhagem de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 foi gentilmente cedida pela Dra. Mariângela Hungria (Coleção da Embrapa de Soja, Londrina PR), e o isolado de C. violaceum UCP 1489, cedida pelo professor Carlos Alberto da Silva (Coleção do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais- NPCIAMB - PE), foi utilizado para a realização deste trabalho.
Condições de crescimento bacteriano
Aos microrganismos foram crescidas no meio de cultura Luria Bertani-LB (Sambrook, 1989). Para o pré-inóculo, uma alçada de bactéria foi transferida para Erlenmeyer de 250mL de capacidade contendo 50mL de meio LB e incubada, sob agitação de 150rpm, a 300C por 24 horas. Após este período 1 mL de cada cultura foram transferidas para novos Erlenmeyer de 250mL contendo meio LB e incubados sob agitação de 150rpm, a 300C. Foram retiradas amostras no intervalo
de tempo 8, 24, 48, 72 e 96h. As células foram centrifugadas a 13.000 x g, 4oC por
10 minutos. Os sobrenadantes foram utilizados como fonte de enzima.
Zonas de hidrólise em substrato
Para se verificar a hidrólise em substrato de glicol quitina a 10% foi feito um tampão citrato de sódio (0,1 M) pH 5,0, fosfato de sódio pH 6,0 e agarose (4%) e foram feitos poços nas placas de Petri. Em cada poço foi adicionado 100μL do sobrenadante e incubados. Após a incubação a 300C por 24h, foi realizada a coloração a 0,1% de calcofluor em tampão Tris-HCL (0,5M pH 8,9) por 10min. e lavadas várias vezes em água destilada e os halos de degradação de quitina foram visualizados sob ultravioleta e o diâmetro das zonas de hidrólise foi medido. Os microrganismos que apresentaram halo de hidrólise ao redor da colônia foram testados quanto à produção de quitinase.
Quantificação de proteínas
O método de Bradford (1976) foi utilizado para quantificar as proteínas secretadas no meio de cultura. A 200μL da amostra foram adicionados 800μL do reagente de Bradford (Kit da AMRESCO). A mistura foi agitada vigorosamente e, a seguir, foi procedida à leitura da absorbância a 595nm. A curva-padrão foi construída com albumina sérica bovina (BSA).
Atividade de quitinase
A atividade enzimática de quitinase foi determinada pela quantificação de N-acetil glicosamina (NAcGlc) formada a partir da degradação dos substratos sintéticos N,N'-diacetilquitobiose (dímero) e N,N’,N’’- triacetilquitotriose (trímero), segundo modificações do método descrito por Reissig et al. (1955). A mistura da reação continha 40μL de tampão acetato 200mM pH 5,4 / 10μL de substrato 4mM dissolvido em água Milli-Q (N,N'-diacetilquitobiose ou N,N’,N’’- triacetilquitotriose) e 120μL do sobrenadante. Após a incubação, a 37°C por 1 h, adicionaram-se 30μl de tetraborato de sódio 0,8M pH 9,1. A mistura foi fervida por 3 min e resfriada rapidamente em gelo. Foram adicionados 1mL de DMAB (ρ-dimetilbenzaldeído 1,0% p/v / HCl 1,25% v/v em ácido acético glacial). A mistura foi incubada a 37°C por 10 min para o desenvolvimento e estabilização da coloração. O produto formado a partir da reação foi determinado pela medida da absorbância a 585nm. Uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1μmol de NAcGlc por min/mL a 37°C.
Gel de atividade quitinásica
Amostras do sobrenadante das bactérias foram adicionadas (1:1) ao tampão da amostra (Tris- HCl 0,0625M, pH 6,8, SDS 2,5%, glicerol 10%, azul de bromofenol 0,001%) e incubadas por 30 min. a 300C. A eletroforese foi em SDS- PAGE, de acordo com Laemmili (1970), pelo método vertical com placas de 20x20 cm, com gel de separação a 12% e gel de empilhamento a 4% com glicol quitina 0,01%. Como padrão, utilizou-se marcador de proteína de quitinase Serratia
agitado suavemente por 24h a 300C em tampão acetato de sódio 100mM pH 5,4. Em seguida o gel foi corado um uma solução recém preparada de calcofluor White M2R 0,1% em tampão Tris-HCL (0,5M pH 8,9) por 10 minutos e descorado em água por 2h, a temperatura ambiente, observado sob luz UV e fotodocumentado.
Eletroforese de proteínas sob condições desnaturantes (SDS-PAGE)
Amostras do sobrenadante das bactérias foram adicionadas (1:1) ao tampão da amostra (Tris- HCl 0,0625M, pH 6,8, SDS 2,5%, glicerol 10%, azul de bromofenol 0,001%) e incubadas por 30 min. a 300C. Para a análise eletroforética em condições desnaturantes procedeu-se segundo método descrito por Laemmli (1970), pelo método vertical com placas de 20x20 cm, com gel de separação a 12% e gel de empilhamento a 4%. Como padrão, utilizou-se marcador de proteína (AMRESCO), o qual marca pesos moleculares entre 14.000 e 70.000 dáltons. Os géis foram corados com solução de Comassie Brilliant Blue 250-R (Comassie Blue 0,15%, metanol 53% e ácido acético 7% em água Mili-Q) por aproximadamente 18h. A descoloração dos géis para evidenciação das bandas foi efetuada em solução de metanol 50% e ácido acético 7% em água Mili-Q. Por cerca de 3 horas e a seguir, os géis foram imersos numa solução de secagem (metanol 50% e glicerol 1% em água Mili-Q) por 2 horas.
Extração de RNA total
Para a extração do RNA utilizou-se o produto comercial TRIZOL (Invitrogen), seguindo as orientações do fabricante. Esse método desenvolvido por Chomczynski e Sacchi (1987), baseia-se na desnaturação e precipitação de proteínas através do fenol clorofórmio e solução de isotiocianato de guanidina que é um poderoso inibidor da enzima Rnase, para posterior precipitação do RNA com álcool. A qualidade e a concentração do RNA foram mensuradas por eletroforese em gel de agarose a 1% e espectrofotômetro.
Transcrição reversa (RT)
O RNA extraído serviu de molde para a produção de uma cadeia complementar de DNA (cDNA) utilizando o sistema de pré-amplificação Superscript para RT-PCR (Invitrogen, SP, Brasil) com os primers de quitinase.
A transcrição reversa foi feita em duas etapas. Inicialmente em uma mistura (Mistura 1) de 4 μL de água livre de Rnase com 1 μL de primer do gene de quitinase onde se acrescentou 5μL do RNA em estudo. Essa mistura foi incubada no termociclador (Biometra TGradient) a 70°C por 10 minutos.
Na segunda etapa da RT se preparou outra mistura (Mistura 2) contendo 2,5 μL de 10X tampão RT- PCR (200mM tris-HCl pH 8.4 – 500 mM KCl), 2,5 μL de 25mM MgCl, 2,5 μL de 0,1 M DTT (dithiotreitol), 1,5 μL de 10mM dNTPs, 1,0 μL da enzima (transcriptase reversa) Superscript II 50u/μL, 0,5 μL de Rnase OUT 40u/μL e4,5 μL de água livre de Rnase perfazendo um total de 15μL por reação, que foram acrescentados ao tubo que continha a Mistura 1 e incubado no termociclador, por 60 minutos a 42°C seguido de 15 minutos a 70°C.
O produto da transcrição reversa, agora designadas cDNA, foi conservado a temperatura de -80°C até sua utilização.
Análise do perfil de expressão
Para cada 5,0 μL de cDNA a ser estudado preparou-se uma mistura de 5,0 μL de 10X PCR tampão (200mM tris-HCl pH 8.4 – 500 mM KCl), 1,5 μL de 50mM MgCl2, 1,0 μL de 10mM dNTPs, 1,0 μL de “primer” direto (25 pmol/μL), 1,0 μL de primer quitinase A (5’ GGCATAGACCTGGATCTGGA 3’ e 5’ CAGTTGATCGACCACGTCAT 3’) e da endoquitinase (5’ GCTACACCTACACCCGCTTC 3’ e 5’CGTTGATGATCTGGATGGTG3’), 0,5 μL de Taq DNA polimerase 5U/μL e 35,0 μL de água livre de Rnase totalizando 50 μL por reação.
O RT-PCR foi processado em um termociclador da Biometra TGradient, sob as seguintes condições: 50°C por 30 min, 94°C por 3 min seguidos de 35 ciclos de amplificação (94°C por 30 seg, 55°C por 30 seg e 72°C por 1 min) e 7 min por
72°C. Primers específicos para a subunidade 16S ribossomal bacteriano (fD1 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ e rD1 5’AAGGAGGTGATCCAGCC 3’) foi utilizado como controle nos experimentos de RT-PCR. O produto final da amplificação foi separado em gel de agarose a 1.5%.
As bandas foram visualizadas e fotografadas em um transiluminador de luz ultravioleta. Também foi incluído no gel de agarose um padrão de peso molecular (Marcador 100pb, Invitrogen) para identificação do tamanho do produto. Os produtos amplificados que apresentaram bandas na altura esperada foram recuperados do gel e purificados para posterior seqüenciamento.
Purificação dos produtos da PCR
Para a purificação dos produtos da PCR utilizou-se o Kit “Concert Rapid Gel Extraction System” (Life Technology, SP, Brasil) seguindo as orientações do fabricante.
A quantidade de 45 μL do produto da PCR foi homogeneizado em 15 μL de tampão de arrasto e submetido à eletroforese em gel de agarose 1%, conforme descrito anteriormente.
Após a eletroforese, o pedaço do gel que continha a banda desejada foi, por visualização de luz ultravioleta, cortado com auxílio de bisturi.
A purificação (purificação por afinidade) se baseia na diluição do gel de agarose para a recuperação do DNA e na afinidade do DNA com a sílica. Pesou- se a banda cortada em um “eppendorf” de 1,5 mL e acrescentou-se o tampão de solubilização L1 e sílica (providos pelo Kit “Concert Rapid Gel Extraction System”) nas proporções de 30 μL e 1 μL por 10 mg de agarose respectivamente. A mistura foi incubada por 20 minutos a 50°C em bloco térmico, sendo homogeneizada a cada três minutos e centrifugados a 12.000 x g por trinta segundos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi novamente suspendido em tampão L1 com o mesmo volume anteriormente utilizado, seguido de nova centrifugação a 12.000 x g. Na etapa subseqüente, a sílica contendo o DNA foi suspensa e centrifugada (12.000 x g / trinta segundos) por duas vezes em tampão L2 (providos pelo Kit “Concert Rapid Gel Extraction System”) na proporção de 30 μL /
10 mg de agarose onde em cada etapa o sobrenadante foi descartado. O tubo contendo o pellet com sílica e DNA foi deixado aberto, a TA, por um breve período, até que se evaporasse o resíduo de L2 e o DNA foi eluído da sílica mediante a adição de 20 μL de tampão TE (providos pelo Kit “Concert Rapid Gel Extraction System”). Após homogeneização e incubação à 50°C por cinco minuto, DNA purificado (sobrenadante) foi recuperado por centrifugação de 12.000 x g por trinta segundos.
Seqüenciamento e análise das seqüências
Os fragmentos obtidos foram seqüenciados em seqüenciador automático de DNA ABI 3100. Para a confirmação dos produtos de PCR como membros da família quitinase as seqüências obtidas foram submetidas ao Gene Runner 3.01 (www.generunner.com) para obtenção das suas respectivas seqüências de aminoácidos blast no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Resultados e Discussão
As 14 linhagens de C. violaceum, isoladas de diferentes regiões do Brasil, foram avaliadas quanto à capacidade de secretar enzimas quitinolíticas. Diferenças nos tamanhos dos halos de degradação sobre o substrato de quitina coloidal foram observadas (dados não mostrados). A linhagem UCP 1489 foi selecionado dentre os demais por apresentar um dos maiores halos de degradação da quitina, maior que 2 centímetros, em média. A linhagem ATCC 12472 foi utilizada com padrão e uma quitinase de Serratia marcescens purificada como marcador (Sigma) (Figura1).
Para confirmar a secreção de enzimas quitinoliticas foi analisado gel de atividade onde se observa a produção de múltiplas quitinases (Figura 2). Múltiplas enzimas quitinoliticas foram descritas em vários microrganismos, como S.
marcescens (Suzuki et al., 2002), Aeromonas sp. No. 10S -24 (Ueda et al. 1995),
por Pseudomonas aeruginosa K-187 (Wang & Chang 1997), B. circulans WL-12 (Mitsutomi et al., 1998), Bacillus licheniformis X - 74 (Takayanagi et al., 1991),
Streptomyces Sp. J. 13-3 (Okazaki et al., 1995), e Streptomyces griseus HUT
6037 (Itoh et al., 2002). Vários fatores físicos, com pH e temperatura afetam a produção de quitinase. A adição de aminoácidos e seus análogos, como triptofano, tirosina, glutamina e arginina (0,1mM), no meio de crescimento estimulam produção de quitinase (Bhushan 1998).
.
A B
C
Figura 1: Zonas de degradação de quitina coloidal formada por linhagem de C.
violaceum. Nos poços foram adicionados 100μL do sobrenadante de células resultante do
cultivo após 48h e uma zona de clareamento foi produzida na quitina coloidal. A – Linhagem padrão de Chromobacterium violaceum ATCC12472; B – Isolado de C. violaceum UCP1489; C – Marcador de quitinase Serratia marcescens (Sigma).
A Figura 3 mostra o perfil protéico da fração proteínas total secretadas nos sobrenadantes. Os resultados demonstraram que houve uma pequena variação no perfil protéico das linhagens estudadas. O perfil protéico da linhagem ATCC12472 apresentou duas proteínas (44 KDa e 14,4 KDa) apresentaram forte expressão. A linhagem UCP1489 obtive perfil semelhante tendo uma proteína de peso molecular próximo a 40 KDa bem expressada e uma bem menor inferior ao marcador de 14,4 KDa.
A atividade quitinolítica foi avaliada pela adição dos substratos cromóforos diacetilquitobiose e triacetilquitotriose de NacGlc na mistura da reação para as linhagens ATCC12472 e UCP1489 (Figura 4A e 4B) respectivamente. Considerando os produtos de hidrólise da quitina, observa-se que houve atividade de ambos os substratos. Indicando que os maiores valores da atividade quitinolítica foram observados usando o cromóforo diacetilquitobiose, sendo considerada uma exoquitinase, que catalisa a liberação progressiva de dímeros solúveis de baixa massa molecular, iniciando pela porção não redutora do polímero. Chernin et al., (1998) observou a indução da atividade quitinolítica em C.
violaceum pela presença de quitina com fonte de carbono e as proteínas
1 2 3 4 5
Figura 2: Gel de atividade quitinásica em linhagem de C. violaceum. 1- Marcador de
quitinase Serratia marcescens (Sigma); 2- linhagem padrão de C. violaceum ATCC12472; 3- padrão de C. violaceum ATCC12472 em meio induzido com quitina coloidal; 4- isolado de C. violaceum UCP1489; 5- isolado de C. violaceum UCP1489 em meio LB induzido com quitina coloidal.
secretadas foram observadas na presença dos cromóforos (dissacarídeos, trissacarídeos, tetrassacarídeos e oligômeros of N-acetilglicosamina) onde concluiu-se que essa indução é regulada pela N-acil homoserina lactona (AHL). As atividades N-acetilglicosamidase, endoquitinase e quitobiosidase também foram observadas em outras bactérias como: Enterobacter agglomerans (Chernin et al., 1995), Serratia marcescens (Brurberg et al., 1996), Bacillus cereus (Pleban & Chet, 1997).
Figura 3: Gel de SDS-PAGE em linhagem de C. violaceum. 1- marcador de proteína;
2- linhagem padrão de C. violaceum ATCC12472; 3- linhagem padrão de C. violaceum ATCC12472 em meio LB induzido com quitina coloidal; 4- isolado de C. violaceum UCP1489; 5- isolado de C. violaceum UCP1489 em meio LB induzido com quitina coloidal após 48h de cultivo.
kDa 66 - 40 - 36 - 31 - 21- 14- 1 2 3 4 5
Figura 4: Estudo da atividade quitinolítica (NAcGlc, NAcGlc2, NAcGlc3) das
proteínas secretadas no extrato do sobrenadante de C. violaceum cultivado em meio LB: A – Linhagens ATCC12472; B- Linhagem UCP 1489. Os ensaios foram feitos em triplicata e os resultados representam à média aritmética.
0
1
2
3
4
5
6
7
A tiv id ade e nz imát ic a (U qui t/h)8
24
48
72
Tempo (h)
ATCC12472
NAcGlc NAcGlc2 NAcGlc3
0 1 2 3 4 5 6 A tiv id ade e nz im át ic a ( U qui t/ h) 8 24 48 72 Tempo (h) U C P 1489 NA cGlc NA cGlc2 NA cGlc3
Diversas técnicas são utilizadas na análise da expressão gênica como Northern
blotting, Differencial display e RT-PCR semi-quantitativo, dentre outras. A análise
da expressão de genes é normalmente realizada por Northern blotting. No entanto, essa técnica é demorada e requer uma quantidade relativamente grande de RNAm (Chelly & Kahn, 1994). Por outro lado, o RT-PCR é mais rápido e mais sensível e pode ser mais específico do que o Northern blotting (Dean et al., 2002).
Nesse trabalho utilizou-se a técnica do RT-PCR para estudar a expressão de genes de quitinases na linhagem UCP 1489, submetida a uma cinética de crescimento temporal cultivada com a presença ou ausência de quitina. O conjunto de primers desenhados para a endo e exoquitinases, amplificou um fragmento de, aproximadamente, 1500 pares de bases (pb) e 1600 pares de bases (pb), respectivamente. A confirmação da identidade dos amplicons serem genes de quitinases foi obtida por seqüenciamento, seguido da análise de homologia no Genbank (NCBI).
Na análise das amostras contendo ou não quitina no meio de cultivo foi possível observar que há uma variação na transcrição dos genes de quitinases entre a linhagem UCP1489 e a linhagem padrão ATCC12472. O gene da quitinase A na linhagem UCP1489 só foi expresso após 48h de cultivo com quitina e sua expressão gênica não mais observada após 72h nessa mesma condição de cultivo. Entretanto, analisando esse gene na linhagem padrão foi observado a sua expressão a partir de 48h e aumentado à expressão em pelo menos duas vezes após 72h na condição de cultivo sem quitina (Figura 5: A, B, C e D).
Para o gene endoquitinase, na linhagem UCP1489 observa-se a expressão do gene na condição de cultivo sem quitinase em todos os tempos estudados; enquanto na condição de cultivo com quitina observa-se sua expressão em 8h até 48 h. Analisando a linhagem ATCC12472 observa-se a expressão do gene de endoquitinase a partir de 24h nas duas condições de cultivo (Figura 5: A, B, C e D).
ATCC ATCC-Q UCP UCP-Q
Chi-A
16S rRNA Endo
A
ATCC ATCC-Q UCP UCP-Q
Chi-A
16S rRNA Endo
B
ATCC ATCC-Q UCP UCP-Q
Chi-A
16S rRNA Endo
D
Figura 5. Análise do produto de transcrição do gene quitinase (quitinase A e
endoquitinase) por meio de reações de RT-PCR semi-quantitativo. O cDNA foi preparado de RNA total de Chromobacterium violaceum ATCC12472 e UCP1489 A- 8 horas , B- 24 horas, C- 48 horas e D- 72 horas. Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose a 1,5%.
ATCC ATCC-Q UCP UCP-Q
Chi-A
16S rRNA Endo
Conclusões
1. A linhagem UCP1489 pode se considerada promissora para a produção da enzima quitinase quando comparada à linhagem padrão ATCC12472.
2. As enzimas quitinolíticas produzidas pelas linhagens de C. violaceum hidrolisam a quitina, sendo secretada exoquitinase em maior quantidade que endoquitinase. 3. As linhagens apresentaram maior expressão do gene de endoquitinase nas condições que foram submetidas.
Referencia Bibliografia
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