Área da curva de decaimento da fluoresceína com adição da substância antioxidante

Onde, f0 representa a fluorescência obtida no tempo 0 e fi a fluorescência obtida nos

tempos intermediários entre 1 e 80 minutos.

𝑁 𝐴𝑈𝐶 = 𝐴𝑈𝐶_{𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜}− 𝐴𝑈𝐶_{𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜} Equação 5. Área sob a curva de decaimento da fluorescência corrigida

Onde, AUCExtrato é a área sob a curva para a amostra e AUCBranco para o branco.

4.5.1.3 - Atividade sequestradora do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH•)

O ensaio DPPH foi realizado de acordo com Roesler et al. (2007), com algumas adaptações. Os extratos foram inicialmente diluídos em etanol (p.a.) e 200 μL de cada diluição foram misturados a 1000 μL de solução DPPH (0,004 % m/v) em cubeta. A mistura foi incubada por 30 minutos a temperatura ambiente e no escuro. O controle da reação (reagente DPPH) foi preparado de acordo com o procedimento descrito anteriormente, substituindo o extrato por etanol (p.a.). A solução de DPPH foi preparada, armazenada em frascos âmbar e mantido ao abrigo da luz a 4 °C. A absorbância do DPPH remanescente foi determinada a 517 nm contra um branco (etanol p.a.) usando o espectrofotômetro UV/Visível (Beckman, modelo DU600, CA, EUA) e a capacidade de sequestrar radicais livres foi calculada de acordo com a Equação 6. A curva de calibração foi preparada com padrão de Trolox (25 - 200 μM) e os resultados foram expressos em µmol de equivalentes de Trolox (TE) por g de amostra (µmol TE/g).

% 𝑑𝑒 𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = [(𝐴𝐷𝑃𝑃𝐻− 𝐴𝐸𝑋𝑇𝑅𝐴𝑇𝑂)

𝐴_{𝐷𝑃𝑃𝐻} ] 𝑋 100 Equação 6. Porcentagem de inibição do radical DPPH

Onde, ADPPH é a absorbância da solução de DPPH e AExtrato é a absorbância da amostra.

4.5.2 - Ensaio de atividade antiproliferativa com células tumorais humanas

Com o objetivo de evitar possíveis contaminações e garantir a viabilidade celular, os testes foram realizados sob condições assépticas em ambiente controlado de fluxo laminar biológico, utilizando materiais e reagentes previamente esterilizados de acordo com a natureza de cada um. As linhagens tumorais humanas foram cedidas pelo NCI (Instituto Nacional do Câncer, Frederick-MA, EUA) e a linhagem de queratinócitos humanos imortalizados (HaCaT) foi doada pelo Dr. Ricardo Della Coletta (FOP, UNICAMP) (Tabela 6).

Tabela 6 - Linhagens celulares tumorais e não tumoral (HaCaT) utilizadas nos ensaios de atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI).

Linhagem celular Sigla DI (x 104 _{células /mL)}

Linhagens tumorais

Glioma U251 3,0

Mama MCF-7 6,0

Ovário com fenótipo de

resistência NCI-ADR/RES 5,0 Rim 786 - 0 3,0 Pulmão NCI - H460 3,5 Próstata PC - 3 3,5 Cólon HT - 29 5,0 Leucemia K562 6,0 Melanoma UACC- 62 4,0 Ovário OVCAR - 3 7,0 Linhagens não

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4.5.2.1 - Cultivo celular

As células foram cultivadas em frascos de 25 cm³ (Corning®, EUA) com 5 mL de meio RPMI 1640 (Gibco®, EUA), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB-GibcoTM, EUA) e mantidas a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Durante os experimentos, o antibiótico na solução de penicilina: estreptomicina (Nutricell®, Campinas, 1000 U mL- 1:1000 g mL - 1_{) foi adicionada ao meio de cultura.}

Para linhagens aderidas (com exceção da linhagem de leucemia – K562), o desprendimento celular foi realizado mediante ação enzimática da tripsina. Para isso, o meio de cultura foi aspirado, o frasco foi lavado com 500 μL de tampão fosfato (PBS, pH 7,0) para eliminar resíduos de meio de cultura e, após aspiração do tampão, foram adicionados 500 μL de tripsina - EDTA 2,5 g/L (Vitrocell®), a 37ºC, até que as células conseguissem se desprender totalmente. A ação da tripsina foi bloqueada com RPMI + SFB 5% e uma alíquota dessa suspensão foi transferida aos novos frascos, completando-se o volume para 5 mL.

4.5.2.2 - Preparo das suspensões celulares

Os ensaios de atividade antiproliferativa realizados com os extratos da semente de

Adenanthera pavonina L. obtidos de acordo com o item 4.4 foram realizados segundo o

protocolo descrito por Monks et al. (1991). O crescimento celular foi determinado por espectrofotometria, utilizando-se o corante proteico sulforrodamina B (SRB, Sigma-Aldrich®) e as análises de atividade antiproliferativa em culturas de células foram baseadas na metodologia de triagem in vitro para drogas anticâncer realizada pelo NCI, EUA, que utiliza um painel de 60 linhagens tumorais humanas (NCI60) (MONKS et al., 1991; SHOEMAKER, 2006). Este protocolo inclui a determinação da densidade celular no tempo 0 (momento de adição das amostras), o que possibilita o cálculo da concentração que inibe totalmente o crescimento celular (SHOEMAKER, 2006).

No primeiro dia de experimento, as suspensões celulares foram preparadas com meio RPMI suplementado com 5% de SFB e penicilina-estreptomicina, em suas respectivas densidades de inoculação (Tabela 6). Foram inoculados 100 μL/compartimento de cada suspensão celular em placas de 96 compartimentos (Corning®, EUA), que foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido. Do mesmo modo, a placa controle (T0) foi preparada contendo todas as linhagens celulares utilizadas no experimento (Tabela 6).

4.5.2.3 - Preparo e aplicação das amostras

Os extratos da semente liofilizados das sementes de Adenanthera pavonina L. foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck®) na concentração de 0,1 g/mL. Para a adição à cultura de células, estas soluções foram diluídas pelo menos 400 vezes em meio de cultura RPMI com 5% de SFB e penicilina-estreptomicina (2 mg/L), o que evita a toxicidade do DMSO. As amostras de extratos da semente diluídas em DMSO foram adicionadas nas microplacas (cinco amostras por microplaca) nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL (100 μL/compartimento) em triplicata e, a seguir, foram incubadas por 48 horas a 37 ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido (Figura 5). Como controle positivo, utilizou-se o quimioterápico doxorrubicina, nas concentrações de 0,025; 0,25; 2,5 e 25 μg/mL (100 μL/compartimento) em triplicata.

Figura 5. Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos utilizada no teste de atividade antiproliferativa.

No momento de adição das amostras, as células inoculadas na placa controle T0 foram fixadas com a adição de 50 μL/compartimento de ácido tricloroacético (TCA) a 50% (m/v) (Sigma- Aldrich®) para determinada indiretamente a quantidade de células presentes no momento em que as amostras foram aplicadas, sendo este o valor basal no tempo 0.

Após 48 horas de tratamento, as células foram fixadas com 50 μL/compartimento de ácido tricloroacético a 50% (m/v) (TCA, Sigma-Aldrich®, EUA) e incubadas por 1 hora, a 4 ºC. Em seguida, as placas foram submetidas a quatro lavagens consecutivas em água corrente

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para a remoção dos resíduos de TCA, meio de cultura, SFB e metabólitos secundários. Em seguida, foram mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa.

Após a secagem, foram adicionados 50 μL/compartimento do corante proteico sulforrodamina B (SRB) (Sigma-Aldrich®) a 0,4 % (m/v) dissolvido em ácido acético a 1 % (v/v) e, em seguida, as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos.

As placas foram lavadas 4 vezes consecutivas com solução de ácido acético 1% (v/v) e, após secagem completa à temperatura ambiente, o corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com 150 μL/compartimento de Trizma Base (10 mM, pH 10,5) (Sigma- Aldrich®_{, EUA). A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em leitor de} microplacas a 540 nm (Molecular Devices®, modelo VersaMax).

4.5.2.4 - Análise dos Resultados dos ensaios antiproliferativos

As médias das absorbâncias foram calculadas descontando o valor de seus respectivos brancos e, por meio das fórmulas abaixo, foi determinada a inibição do crescimento celular (em porcentagem) de cada linhagem celular em função das concentrações de cada amostra testada. Os resultados obtidos foram analisados, considerando-se que:

Se T > C, a amostra estimulou o crescimento celular.

Se T0 ≤ T < C, a amostra apresentou atividade citostática e a fórmula utilizada foi 100 x [(T-T0)/ (C-T0)].

Se T< T0, a amostra foi citocida e a fórmula utilizada foi 100 x [(T- T0)/(T0)]. Onde T = representa a média das absorbâncias das células tratadas, C = corresponde ao controle de células e T0 = controle das células no dia da adição das amostras.

Esses resultados foram expressos em curvas de crescimento celular para cada linhagem em função da concentração da amostra e, a partir deles, foram calculadas as concentrações efetivas de GI50 (concentração de amostra necessária para inibição de 50% do crescimento celular), por meio da regressão não linear, tipo sigmoidal, empregando-se software ORIGIN 8.0 (OriginLab Corporation).

4.6 - Determinação e identificação dos compostos bioativos

4.6.1 - Compostos fenólicos totais

O conteúdo de fenólicos totais foi determinado espectrofotometricamente pelo método de Folin-Ciocalteau como descrito por Roesler et al. (2007), com algumas modificações, para a amostra que apresentou maior capacidade antioxidante. Este método envolve a redução do reagente Folin-Ciocalteau pelos compostos fenólicos, com concomitante formação de um complexo azul em meio básico, cuja absorbância a 760 nm aumenta linearmente com a concentração de fenólicos no meio reacional. As amostras da semente tratadas enzimaticamente (5 g da semente triturada em 45 mL de tampão fosfato 100 mM pH 7,0, 125 µL de protease e celulase, 50 ºC, 100 rpm por 2 horas de incubação) e os padrões da curva de calibração foram diluídos em etanol 40% (v/v). Em seguida, 100 μL das amostras diluídas, soluções de calibração ou branco (etanol 40%) foram pipetadas em tubos teste de 10 mL juntamente com 100 μL de reagente Folin-Ciocalteau 50% (v/v). A mistura foi homogeneizada e deixada em repouso para atingir o equilíbrio. Após 2 minutos, 800 μL de Na2CO3 5% (m/v) foram adicionados. A mistura foi mantida a temperatura ambiente por 20 minutos. Subsequentemente, a absorbância foi mensurada em cubetas de 1 cm utilizando um espectrofotômetro UV/Visível (Beckman, modelo DU600, CA, EUA) operando a 760 nm. As soluções de etanol 40 % (v/v) e Folin-Ciocalteau 50 % (v/v) foram obtidas por meio da diluição em água. A curva de calibração foi preparada com padrão de ácido gálico (10 - 80 μg/mL), e o conteúdo de compostos fenólicos totais foi expresso como g de equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100 g de amostra (g GAE.100 g-1).

4.6.2 - Determinação de taninos condensados

A determinação de taninos condensados foi realizada apenas para o extrato que apresentou maior capacidade antioxidante (item 4.4). Uma alíquota de 30 μL do extrato (diluído em metanol) foi misturada com 900 μL de vanilina 4% (m/v) preparada com metanol e, em seguida, foi adicionado 450 μL de HCl concentrado. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 20 minutos ao abrigo da luz. Após o período de incubação, a leitura da absorbância foi realizada a 500 nm usando o espectrofotômetro UV/Visível (Beckman, modelo DU600, CA, EUA). A curva de calibração foi preparada com padrão de catequina (50 - 800 μg/mL), e o

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resultado foi expresso em mg de equivalente de catequina por grama de amostra (BROADHURST; JONE, 1978).

4.6.3 - Determinação do conteúdo de flavonoides

O teor de flavonoides totais foi determinado de acordo com o método proposto por Zhishen et al. (1999), com algumas adaptações, para o extrato que apresentou maior capacidade antioxidante (item 4.4). A amostra foi preparada em água na concentração de 10 mg/mL, homogeneizada em agitador de tubos por 30 segundos, seguido de ultrasonicação a 10 °C durante 30 minutos. Uma alíquota de 100 µL do extrato diluído e 400 µL de água ultrapura foram homogeneizados e 30 µL de NaNO2 5% (m/v) foi adicionado. Após 5 minutos, 30 µL de AlCl3 10% foi adicionado. Após 6 minutos, 200 µL de NaOH 1M e 240 µL de água ultrapura foram adicionados ao sistema de reação. A absorbância da mistura foi comparada a um branco (água) e medido a 510 nm. Uma curva de calibração foi construída com catequina (25 - 150 μg/mL) e o conteúdo de flavonoides totais foi expresso como mg de catequina equivalente por 100 g.

4.6.4 - Cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massas (CLUAE – EM/EM)

A identificação e a quantificação dos compostos fenólicos no extrato com maior capacidade antioxidante (item 4.4) foram realizadas por meio de Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (CLUAE) acoplado ao espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo, modelo LCMS-8040 (Shimadzu, Kyoto, Japan), equipado com uma fonte de ionização por

electrospray (IE), de acordo com o método estabelecido por Bataglion et al. (2015), com

algumas adaptações.

Soluções estoque de cada padrão analítico (pureza ≥ 95%; Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) na concentração de 1 mg/mL foram preparados em metanol e estocados a -80 ºC. Os extratos e os padrões foram diluídos em água acidificada (0,1% de ácido fórmico, v/v) e filtrados através de filtros de membrana 0,20 μm antes da injeção. Curvas de calibração foram construídas (20-1000 ng/mL) para quantificar os compostos fenólicos identificados nos extratos. Os resultados foram expressos em µg/g de extrato.

A análise dos compostos fenólicos foi realizada no modo negativo. Para cada padrão analítico, os íons precursores foram determinados em experimentos de varredura e os

íons produtos foram escolhidos por experimentos EM/EM. As análises foram conduzidas por monitoramento de múltiplas reações (MRM) utilizando duas das transições mais seletivas para cada padrão analítico. As configurações do espectrômetro de massas foram utilizadas para cada transição como pode ser observado na Tabela 7. Os parâmetros da fonte de ionização foram voltagem capilar de 3,5 Kv; temperatura de 300 ºC; temperatura da linha de dessolvatação de 250 °C; fluxo de gás de secagem (N2) a 20 L/min; fluxo do gás nebulizador (N2) a 3 L/min); pressão de gás (Ar) para dissociação induzida por colisão de 228 kPa.

Tabela 7 - Parâmetros de espectrometria de massas para as transições MRM

Composto Transição (m/z)* DP (V) CE (V) CXP (V) TR (min) Ácido protocatecuico 153,00>109,00 30 15 17 3,71 153,00>108,15 30 30 18 Catequina 289,10>151,00 18 22 24 4,00 289,10>123,00 19 27 28 Ácido 4- hidroxibenzóico 137,00>93,10 26 16 14 4,35 137,00>65,05 26 28 23 Ácido ferúlico 193,10>134,00 12 17 21 5,00 193,10>178,00 12 11 30 Ácido gentísico 153,00>108,10 29 15 19 5,59 153,00>109,10 29 23 17 Quercetina 301,00>151,00 20 23 24 5,88 301,00>178,96 20 19 30 Naringenina 270,90>151,00 18 17 29 5,99 270,90>119,10 18 29 18

* Primeira linha transição usada para quantificação. Segunda linha transição usada para identificação. DP: Potencial de orifício, CE: energia de colisão, CXP: potencial de saída da cela de colisão, TR: tempo de retenção em minutos.

A separação cromatográfica foi realizada em coluna Shim-pack XR-ODS III (Shimadzu, Kyoto, Japan) com partículas de 2,2 µm, diâmetro interno de 2,0 mm e comprimento de 150 mm usando a fase binária móvel, onde a temperatura foi mantida a 40 ºC. O solvente A foi água ultrapura com 0,1% de ácido fórmico e o solvente B foi o metanol. O

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gradiente de eluição utilizado foi como segue: 0-1 min, 5% B; 1–4 min, 5-60% B; 4–7 min, 60– 70% B; 7–10 min, 70–100% B; 10–10.50 min, 100% B; 10.50–11 min, 100–5% B; 11–15 min, 5% B e fluxo de 0.4 mL/min. A temperatura do autoamplificador permaneceu à 10 °C e o volume de injeção foi de 10 µL. O processo cromatográfico foi controlado pelo software Labsolution.

4.7 - Análise estatística

Os resultados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA). Quando verificada diferença estatística utilizando ANOVA, os tratamentos foram comparados pelo teste de Tukey HSD. Todas as análises estatísticas foram realizadas com nível de 5 % de significância (p ≤ 0,05) com o Software STATISTICA versão 11 (Statsoft, Oklahoma,