Equação de transferência de átomos de hidrogênio (APAK et al., 2007).

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Os métodos baseados na transferência de elétrons medem a capacidade de um antioxidante (AH) em reduzir qualquer composto, normalmente íons metálicos, grupos carbonila e radicais (R•), por meio da transferência de um elétron. Na maioria destes ensaios, os antioxidantes reagem com um indicador fluorescente ou colorimétrico (agente oxidante). Os ensaios espectrofotométricos baseados na transferência de elétrons medem a capacidade de um antioxidante em reduzir um agente oxidante, o qual muda de cor quando reduzido, sendo que o grau de mudança de cor (um aumento ou redução da absorbância a um dado comprimento de onda) é correlacionado à concentração de antioxidantes presentes na amostra (APAK et al., 2007). Dentre os métodos incluem-se o método de Capacidade Antioxidante Equivalente ao

Trolox (TEAC) e de Atividade Sequestradora do Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH•);

R• + AH → R‾+ AH•+ AH•+ _{+ H}

2O → A• + H3O+ R‾ + H3O+ → RH + H2O AH + M3+ → AH+ + M2+ Equação 2. Equação de transferência de elétrons (APAK et al., 2007).

No entanto, não há procedimento padronizado para avaliar a capacidade antioxidante, por isso, é necessário realizar diferentes ensaios, com fundamentos e mecanismos de ação diferentes (OLIVEIRA et al., 2009). DPPH, TEAC e ORAC estão entre as técnicas mais utilizadas para avaliação da capacidade antioxidante de extratos de plantas e alimentos. Na Tabela 3 estão apresentados os métodos mais utilizados para determinação da capacidade antioxidante in vitro de matrizes vegetais.

Tabela 3 - Principais métodos e seus princípios de ação utilizados na determinação da atividade antioxidante de componentes alimentares.

Método Princípio Referências

Capacidade de Absorção do Radical

Oxigênio (ORAC)

O método ORAC mede a habilidade que um antioxidante tem contra o radical peroxila, onde o antioxidante e um marcador fluorescente (normalmente fluoresceína) competem cineticamente por radicais peroxila gerados através da decomposição de compostos nitrogenados tais como AAPH (2,2’-azobis-(2- metilpropionamidina)-dihidroclorado) a 37 °C e pH fisiológico. A atividade antioxidante pode ser determinada calculando a curva de decaimento da fluorescência de um indicador na presença e ausência de antioxidantes, integrando a área sob essas curvas (emissão 520 nm e excitação 485 nm). Apak et al. (2007) Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC)

No método TEAC, o composto ABTS é oxidado por oxidantes (normalmente K2S2O8) à sua correspondente forma radical cátion

(ABTS•+_{), que absorve a 734 nm (coloração verde-azulado), por}

meio da perda de um elétron pelo átomo de nitrogênio do ABTS. Na presença de qualquer antioxidante ocorre descoloração da solução acompanhada pelo decréscimo da absorbância que é proporcional à concentração de sequestradores de radicais adicionados na solução reagente de ABTS.

Gülçin (2012); Thatoi, Patra & Das (2014) Atividade Sequestradora do Radical 2,2-difenil- 1-picrilhidrazil (DPPH•)

Este método é baseado na redução do radical DPPH• em solução alcoólica na presença de um antioxidante doador de elétrons devido à formação da forma não-radical DPPH-H na reação. Neste ensaio, o radical cromogênio púrpura (DPPH•), que absorve em um comprimento de onda de 516 nm, é reduzido por compostos sequestradores de radicais (antioxidantes) à sua correspondente forma reduzida (DPPH-H), de coloração amarela, com consequente desaparecimento da banda de absorção, sendo a mesma acompanhada pelo decréscimo da absorbância que é proporcional à concentração de sequestradores de radicais adicionados à solução reagente de DPPH.

Haminiuk et al. (2012); Thatoi, Patra & Das (2014)

3.5 - Extração assistida por enzimas

A extração é o estágio inicial e um dos passos mais importantes em estudo de obtenção de compostos bioativos a partir de plantas, pois desempenha um papel significativo e crucial no rendimento do processo de extração (AZMIR et al., 2013). Ao longo dos anos, diversas técnicas foram criadas e melhoradas para facilitar a recuperação de compostos bioativos de matrizes alimentares. Dentre eles, métodos não convencionais, como a extração assistida por enzimas têm ganhado destaque.

As enzimas, catalisadores de alta especificidade, podem ser empregados na extração, modificação ou síntese de compostos bioativos de origem natural (PURI; SHARMA; BARROW, 2012). As enzimas hidrolisam os componentes da parede celular de vegetais e, consequentemente, ocorre a liberação de compostos bioativos, o que promove o aumento na

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recuperação destes compostos a partir da matriz vegetal (PINELO; ARNOUS; MEYER, 2006). O processo de extração assistida por enzima (EAE) consiste em um método inovador para o uso de enzimas. Primeiramente, essa técnica foi utilizada para facilitar a extração de lipídios e proteínas a partir de sementes oleaginosas (LIU et al., 2016). A água é utilizada como meio reacional na EAE, assim, essa técnica é uma alternativa promissora aos métodos convencionais de extração que empregam solventes orgânicos (BAIANO, 2014). A EAE baseia-se na capacidade das enzimas de catalisar reações com especificidade e regiosseletividade em condições de processamento suave e em meio aquoso (GARDOSSI et al., 2010)

A EAE apresenta mais vantagens em relação aos métodos de extração convencionais por possuir apelo ecológico já que nessa técnica não são utilizados solventes orgânicos, apresenta maior rendimento e menor gasto de tempo na extração, o produto final apresenta maior qualidade devido à ausência de resíduos de solventes e baixo consumo de energia. Para a eficiência do processo, é necessário compreender parâmetros bioquímicos relacionados às enzimas, como modo de ação, propriedade catalítica, condições ótimas de atuação e quais enzimas ou combinação delas são mais adequadas para a obtenção dos compostos de interesse (PURI; SHARMA; BARROW, 2012).

Devido as suas vantagens, a EAE tem despertado o interesse de vários pesquisadores na busca por combinações de diferentes enzimas (carboidrases e proteases) para a degradação da parede celular de sementes e frutos (LIU et al., 2016). No entanto, essa é uma técnica que apresenta limitações, devido ao elevado custo para o processamento de grandes volumes de matéria-prima, a disponibilidade de preparações enzimáticas que não podem hidrolisar completamente as paredes celulares de vegetais, a dificuldade do uso em escala industrial já que as enzimas se comportam de forma diferente nas condições do meio ambiente (porcentagem de oxigênio, temperatura e disponibilidade de nutrientes) (BAIANO, 2014).

A liberação de compostos bioativos de células vegetais por degradação e extração pode ser otimizada usando preparações enzimáticas únicas ou combinadas (BAIANO, 2014). A combinação das enzimas amilase, celulase e protease foi mencionada (SHARMA; GUPTA, 2001; FANG; MOREAU, 2014) por melhorar o rendimento da extração de óleo a partir do farelo de arroz e do trigo. A combinação das enzimas α-amilase e celulase tem sido usada para a recuperação de ácidos fenólicos a partir da cevada (YU; VASANTHAN; TEMELLI, 2001). As enzimas podem ser de origem bacteriana, fúngica, animal e de vegetal. Para aumentar o rendimento da extração as condições operacionais, tais como temperatura, tempo, pH e relação enzima-substrato, podem ser otimizadas (BAIANO, 2014).

A enzima celulase é uma carboidrase que hidrolisa as ligações β-1,4 glicosídicas da celulose e pode romper a integridade da parede celular de plantas. As preparações de enzimas celulolíticas hidrolisam os componentes da parede celular, como a hemicelulose, celulose e lignina, aumentando o rendimento da extração (PURI; SHARMA; BARROW, 2012) de compostos, por exemplo, antioxidantes, polissacarídeos, óleos, pigmentos naturais e aromas (DE MOURA et al., 2008). Celulase de Thermobifida fusca foi empregado para a extração de compostos fenólicos a partir de casca de maçã (KIM et al., 2005). Além disso, celulase foi empregada para melhorar a extração de oligossacarideos a partir de arroz branco, no qual foi observado um rendimento de aproxidamente 40% (PATINDOL et al., 2007).

As proteases são enzimas que hidrolisam as ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas, podendo assim liberar peptídeos bioativos e outros compostos complexados às proteínas (WEIHOFEN; MARTOGLIO, 2003). O aumento na recuperação de compostos fenólicos a partir do bagaço de groselha preta foi observado com o uso de proteases (LANDBO; MEYER, 2001).

A adição de amilase durante o processo de extração melhora a recuperação de alguns compostos bioativos de interesse que estão ligados a parede celular da planta (AZMIR et al., 2013). Uma combinação de α-amilase, pectinase, protease e celulase aumentou o rendimento da extração de oleoresinas e gingerol a partir de gengibre (Zingiber officinale Roscoe) (NAGENDRA et al., 2013).

Enzimas únicas, por exemplo, celulase, pepsina, pectinase e β-glicosidase, ou combinadas (ex.: misturas comerciais) foram empregadas na extração de diferentes compostos antioxidantes, tais como naringenina, antocianinas e carotenoides e outros compostos bioativos (oligossacarídeos) a partir de diferentes partes de plantas, principalmente, casca e sementes de frutas (Tabela 4). As cascas e sementes de frutas contêm elevado conteúdo de compostos fenólicos livres e, principalmente, ligados a parede celular, material lignocelulosíco composto de celulose, hemicelulose, pectina, proteínas e outras componentes em menor quantidade. O uso de enzimas capazes de clivar parcial ou totalmente os componentes da parede celular permite liberar compostos fenólicos facilmente extraíveis com potencial antioxidante, dentre eles podemos citar o ácido ferúlico e o ácido p-coumárico. Por isso, o uso de EAE na extração de compostos antioxidantes a partir de subprodutos ou das partes não-comestíveis de plantas têm sido amplamente estudados nos últimos anos (PURI et al. 2011; KAMMERER et al. 2005; KIM et al. 2005; PATINDOL et al. 2007; FERRUZZI; GREEN 2006; RUIZ-TERAN et al. 2001; STOLL et al. 2003; MUÑOZ et al. 2004; LI et al. 2006; LANDBO; MEYER 2001).

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Tabela 4 - Exemplos do uso de extração assistida por enzimas para extração de compostos antioxidantes a partir de diferentes partes de plantas.

Fonte Enzima Origem Composto Rendimento

(%) Referência Casca de laranja α-L- Ramnosidase Escherichia coli Naringenina n.d Puri et al. (2011) Bagaço de uva Enzimas pectinolíticas e celulolíticas n.d Antocianina e outros compostos fenólicos 98,1 Kammerer et al. (2005) Casca de maça Celulase Thermobifida fusca Compostos fenólicos n.d Kim et al. (2005) Arroz branco Celulase n.d Oligossacarídeos 39,9 Patindol et al.

(2007)

Chá Pepsina n.d Catequina 80 Ferruzzi;

Green (2006) Vagens β-glicosidase e pectinase n.d Vanilina 14-21 Ruiz-Teran et al. (2001) Bagaço de cenoura Pectinex Ultra SP-L Aspergillus aculeatus Carotenoides 0,0064 Stoll et al. (2003) Pele de uva Pectinex

BE3-L n.d Antocianinas n.d Muñoz et al. (2004) Casca de frutas citrícas Celluzyme MX n.d Compostos fenólicos 65,5 Li et al. (2006) Bagaço de

groselha preta Protease Aspergillus niger

Compostos

fenólicos n.d

Landbo; Meyer (2001)