Obtenção de compostos bioativos a partir das sementes de Adenanthera pavonina L. utilizando extração assistida por enzimas

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

NAYARA MACÊDO PEIXOTO

OBTENÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A PARTIR DAS

SEMENTES DE Adenanthera pavonina L. UTILIZANDO EXTRAÇÃO

ASSISTIDA POR ENZIMAS

CAMPINAS 2017

NAYARA MACÊDO PEIXOTO

OBTENÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A PARTIR DAS

SEMENTES DE Adenanthera pavonina L. UTILIZANDO EXTRAÇÃO

ASSISTIDA POR ENZIMAS

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciência de Alimentos.

Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore Coorientador: Prof. Dr. Ruann Janser Soares de Castro

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Nayara Macêdo Peixoto, e orientada pela Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore.

CAMPINAS 2017

BANCA EXAMINADORA

________________________________________ Prof.a _Dr.a _{Glaucia Maria Pastore}

Orientadora DCA/FEA/UNICAMP

________________________________________ Dr.a Renata Aparecida Soriano Sancho

Membro Titular

________________________________________ Prof.a Dr.a Fabíola Aliaga de Lima

Membro Titular DEQ/EPUSP

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

“Tenho em mim todos os sonhos do mundo. ”

D

edico esse trabalho primeiramente a Deus por

sua infinita bondade, aos meus pais, as minhas

irmãs, aos meus sobrinhos e cunhados, e também a

todos os meus amigos.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, que foi o grande responsável por todas as minhas conquistas e que cuidou de todos os detalhes para que esse momento fosse tão especial. Não me abandonando em nenhum momento durante toda essa jornada, me dando força e coragem para enfrentar todos os desafios. Me abriu caminhos, me permitiu desfrutar de momentos tão enriquecedores, colocou no meu caminho pessoas tão generosas e acolhedoras, me fez crescer profissionalmente e pessoalmente, e me fez ver que eu sou capaz de tudo ao seu lado.

Se há algo que faz diferença na formação da personalidade e na vida de uma pessoa é o amor que ela recebe durante a vida. Entender a diferença entre ter e ser foi algo que aprendi desde cedo, já que seus valores e princípios me foram ensinados em cada ação e em todos os momentos que você abdicou dos seus sonhos para viver os meus. Mainha, Elba Maria Macêdo Peixoto, te dedico todas as minhas vitórias. A senhora é a principal responsável pela minha felicidade diária e por toda motivação que tenho em cada desafio. A SENHORA É A MINHA PESSOA FAVORITA NO MUNDO.

À Painho, Francisco Peixoto Pinheiro, por sempre me ensinar qual o melhor caminho a seguir, por ser uma referência de integridade, honestidade e amor, pela serenidade e sacrifícios dedicados as suas filhas e pela sua incrível capacidade de ser a força e segurança da nossa família. Sou uma filha orgulhosa do homem que o senhor é, da sua capacidade de ser tão forte diante das dificuldades de criar 6 filhas e por fazer isso com tanta sabedoria. Lhe devo por todas as coisas boas que só me trazem a certeza de que ser sua filha foi a maior sorte que eu tive.

À minha irmã, Tatiany Macêdo Peixoto Correia, por me incentivar na realização deste sonho, pela sua capacidade de se reinventar cada vez que a vida nos prega uma peça e mais ainda por ser meu maior exemplo força, fé e esperança.

À minha irmã, Viviany Macêdo Peixoto Silva, por seu apoio incondicional em todas as fases da minha vida, por me encorajar a enfrentar meus medos e ser forte nas minhas decisões e além de tudo isso, ainda encontrar tempo para ser meu exemplo de mãe, esposa e amiga.

À minha irmã, Cristiany Macêdo Peixoto Vasconcelos, pela sua generosidade e por cuidar tão bem de mim, por sua bondade infinita e inspiradora, por me tranquilizar todas as vezes que eu tive medo, por ser meu principal exemplo de profissionalismo e dedicação com todos.

À minha irmã, Naiany Macêdo Peixoto, por desde pequena ter por mim os sentimentos mais lindos e puros que uma irmã pode sentir por outra: amor e proteção, por sempre me motivar e acreditar em mim, mesmo quando eu não acreditava. Por me fazer sentir tão especial e única em sua vida. Se eu pudesse escolher outra forma de ser, eu escolheria ser você.

À minha irmã, Nayra Larissa Macêdo Peixoto, por ser a melhor amiga e confidente que eu poderia ter na vida. Você está no topo da lista das irmãs porque minha vida sempre foi totalmente ligada à sua, sempre estivemos juntas em todos os momentos, só você me entende perfeitamente. Te amo como minha filha, pois encontro em você todas as respostas da minha vida.

Aos meus cunhados, Haroldo Máximo, Leonardo Holanda e Carlos Eduardo (Cadu), pelos momentos de diversão e serenidade, pelos conselhos e cuidados que vocês sempre tiveram comigo, mas principalmente por unirem ainda mais nossa família.

Aos meus sobrinhos, Júlia, Leonardo, Lucca e Gustavo por me mostrarem que eu sou capaz de amar muito além do que eu conhecia, vocês são as pessoas mais puras e bondosas de coração que eu conheço, amo todos os nossos momentos de brincadeira, com vocês me sinto completamente realizada.

À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore, por ter sido sempre tão generosa e atenciosa comigo. Pela incrível capacidade que a senhora tem de ser tão paciente e parceira dos seus alunos, pela confiança dedicada a mim e pela oportunidade e apoio no desenvolvimento deste projeto.

Ao meu coorientador e amigo, Prof. Dr. Ruann Janser Soares de Castro, por me motivar em todas nossas reuniões, por suas correções e incentivo, por ser tão paciente e generoso, por acreditar em mim em todos os momentos e por me inspirar tanto profissionalmente.

Aos meus revisores, Hélia Sato, Fabíola Lima, Renata Sancho e Cinthia Bau, pelos conselhos, ensinamentos e paciência na correção deste projeto.

Ao Gustavo Araujo Pereira, que foi a melhor surpresa que esse mestrado me trouxe. Obrigada pela paciência, segurança e amor dedicados a mim com tanta verdade, por seu jeito incrível de ser e pela paz, calma e serenidade que você me transmite.

Ao meu amigo, Henrique Silvano Arruda, que durante todo este projeto se manteve sempre a disposição, me ensinando e auxiliando em todas as fases desse momento tão

desafiador, com você compartilhei várias horas de trabalho e também momentos de estudos e diversão.

À minha amiga, Livia Prado, por ser tão presente na minha vida, por me ensinar tanto, por me ajudar nas minhas dúvidas durante o desenvolvimento deste projeto, pelos conselhos e dicas e pelos momentos de diversão.

À Angel, pelo incentivo, comprometimento, ajuda e paciência ao me ensinar tudo que eu sempre precisei. Obrigada pela amizade e generosidade que você sempre teve por mim.

Às minhas melhores amigas, Vivianny Jácome, Alice Pinheiro, Joice Barreira, Larissa Félix e Renata Castro, que desde pequenas são minhas principais referências de amizade. Em vocês encontro refúgio, calmaria, felicidade e, principalmente, cumplicidade. E foi através dessa cumplicidade que nós nos fizemos irmãs de vida.

À minha amiga, Lais Marinho Aguiar, por ser minha família em Campinas, por dividir comigo diariamente as alegrias e conquistas, pelos segredos compartilhados, por sermos tão amigas e parceiras de vida. Obrigada pelos conselhos e pela sua amizade que é tão importante para mim.

À minha amiga, Laísa Dias, por cuidar de mim nos momentos de solidão e medo, por ser sempre tão presente na minha vida. Obrigada por todas as vezes que você cuidou de mim e por me proporcionar momentos de tanta amizade e companheirismo.

Aos meus amigos, Tiago, Líbia, Mayra, Marina, Letícia, Felipe, Luis, Murilo, Marcela, Carol, Viny, Valquíria por toda apoio e companheirismo durante essa jornada e pelos momentos de distração tão necessários nessa fase tão importante da minha vida.

As minhas companheiras do Projeto de Estágio à Docência (PED), Marília Crivelari, Beatriz Melo (Bia) e Karla Martins por todo ensinamento transmitido com tanta sabedoria e paciência e, mais do que isso, pela amizade construída com tanta verdade.

Aos meus alunos do Projeto de Estágio à Docência (PED), em especial Giovanna, Gabriel, Guilhermo, Luciana, Bruna, Marina e Vanessa, por me ajudarem no meu crescimento profissional, pela amizade que construímos ao longo do meu estágio e por todos os momentos de aprendizado e diversão durante nossas aulas.

Às amigas Carol e Carine Almada, Ana Carine e Lia Maristela pela receptividade, apoio e amizade, principalmente, durante os primeiros meses de chegada a Campinas.

Aos meus amigos, Larissa Vieira, Nathana Cristofoli, Marcelo Sousa, Denis Lima, Alan e Renata Guerreiro que mesmo distantes se fazem presentes diariamente, me incentivando e acreditando nos meus sonhos.

As minhas primas Beatriz e Isabela Peixoto pelo incentivo mesmo à distância, pela inspiração profissional e pessoal (força e dedicação) que vocês sempre me trouxeram e pela disponibilidade que vocês sempre tiveram para me ajudar em tudo que eu precisei.

À minha tia Gorete Peixoto por ser tão presente na minha vida, pelas orações, pelas ligações tão motivadoras e, principalmente, pelos momentos de tanta alegria que sempre tenho ao seu lado.

Aos meus amigos, Renato e Natalia, por me ajudarem na coleta das sementes utilizadas neste projeto, pela amizade e por todo apoio.

Aos meus tios, Italvan Milfont Macêdo e Dorreino Maria Macêdo, por acreditarem no meu sonho, por serem tão presentes em minha vida e por me inspirarem com seu exemplo de garra, força e esperança.

À minha professora e amiga, Lucicléia Barros de Vasconcelos, pelos ensinamentos e amizade durante tantos anos. Todos seus conselhos foram tão importantes para mim.

Aos meus companheiros de caminhada do Laboratório de Bioaromas e Compostos Bioativos: Nadir, Leo, Alexsandra, Tailleah, Ana Paula, Bruno, Marina, Débora, Dora, Rose que contribuíram positivamente para o sucesso deste projeto.

Aos colaboradores, Ana Lúcia Ruiz e Marcos Nogueira Eberlin pela disponibilidade e atenção durante o desenvolvimento deste trabalho.

Aos funcionários da FEA, em especial ao Camila, Andrea, Cosme, Rose, Marcia, Claudia, Geraldo e Bianca pela disponibilidade, ajuda e atenção, facilitando assim todo meu trabalho durante este ano.

Aos professores do Programa de Mestrado em Ciência de Alimentos da UNICAMP que foram tão importantes na minha vida acadêmica, por todo ensinamento, paciência e dedicação ao meu aprendizado e crescimento profissional.

À Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (FEA-UNICAMP), pela oportunidade e por fornecerem os recursos necessários para a realização deste projeto.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida durante a realização do mestrado. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Muito obrigado a todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho e para meu crescimento profissional.

RESUMO

O presente trabalho teve por objetivo estudar os compostos bioativos das sementes de

Adenanthera pavonina L. utilizando extração assistida por enzimas. O tratamento enzimático

foi realizado utilizando α-amilase (Termamyl® de Bacillus licheniformis), protease (Neutrase® de Bacillus amyloliquefaciens), e celulase (Optimase® CX 56L de Bacillus subtilis) nas seguintes condições: 0 a 250 µL de mistura de enzimas, 5 g da semente triturada em 45 mL de tampão fosfato 100Mm pH 7,0, 50 ºC, 100 rpm por 2 horas de incubação. A proporção de cada enzima foi otimizada por meio de um planejamento de misturas, onde foi observado que o uso de protease e celulase (1:1, v/v) aumentou o conteúdo de compostos bioativos e atividade antioxidante da semente de Adenanthera pavonina L. Após o tratamento enzimático, o efeito do solvente extrator (água, etanol, metanol, etanol: água (1:1, v/v) e metanol: água (1:1, v/v)) sobre a recuperação de compostos antioxidantes a partir dos hidrolisados da semente de

Adenanthera pavonina L. foi avaliado utilizando três métodos antioxidantes, ORAC, TEAC e

DPPH. A água foi o melhor solvente extrator. O uso de solventes polares (água) para a extração de compostos antioxidantes pode aumentar a recuperação de compostos mais polares, tais como fenólicos glicosilados, vitaminas hidrossolúveis e peptídeos bioativos. O extrato aquoso apresentou elevada atividade antioxidante (221,84, 100,08 e 13,49 µmol TE/g de extrato seco para os ensaios ORAC, TEAC e DPPH, respectivamente). O extrato aquoso das sementes de

Adenanthera pavonina L. atuou de maneira mais eficiente por meio do mecanismo de

transferência de átomos de hidrogênio do que pela transferência de elétrons. Os compostos fenólicos catequina (6,08 µg/g), quercetina (0,18 µg/g), naringenina (1,31 µg/g), ácido protocatecuico (3,35 µg/g), ácido gentísico (2,81 µg/g), ácido 4-hidroxibenzóico (0,53 µg/g) e ácido ferúlico (0,45 µg/g) foram identificados no extrato aquoso do hidrolisado por CLUAE-EM/EM. O flavanol catequina foi o principal composto fenólico encontrado no extrato aquoso do hidrolisado. Assim, o extrato aquoso do hidrolisado foi selecionado para os ensaios de atividade antiproliferativa e apresentou resultados significativos para as linhagens tumorais de próstata (GI50 = 2,5 µg/mL) e rim (GI50 = 29,9 µg/mL), enquanto a amostra controle (não tratada enzimaticamente) apresentou resultado relevante apenas para a linhagem tumoral de rim (GI50 = 67,5 µg/mL). Os valores de GI50 do extrato aquoso do hidrolisado para as linhagens de rim e próstata foram menores quando comparados ao controle, sugerindo que o tratamento enzimático realizado foi necessário para evidenciar atividade antiproliferativa das sementes de

A. pavonina L.

Palavras-chave: Atividade antioxidante, compostos bioativos, extração assistida por enzimas, atividade antiproliferativa, sementes de Adenanthera pavonina L.

ABSTRACT

The aim of this study was to investigate the bioactive compounds of Adenanthera pavonina L. seeds using enzyme assisted extraction. The enzymatic treatment was performed using commercial α-amylase from Bacillus licheniformis (Termamyl®), protease from Bacillus

amyloliquefaciens (Neutrase®) and cellulase from Bacillus subtilis (Optimase®) in the

following conditions: 0 to 250 µL of enzyme mixture, 5 g of the seed powder in 45 mL of phosphate buffer 100 mM pH 7.0, 50 °C, 100 rpm for 2 hours of incubation. The proportion of each enzyme was optimized by response surface methodology, which was observed that the use of protease and cellulase (1:1, v/v) increased the content of bioactive compounds and antioxidant activity of Adenanthera pavonina L. seeds. After the enzymatic treatment, the effect of extraction solvent (water, ethanol, methanol, ethanol: water (1:1, v/v) and methanol: water (1:1, v/v)) on the recovery of antioxidant compounds from hydrolysates of Adenanthera

pavonina L. seeds was evaluated using different assays, namely, ORAC, TEAC and DPPH.

Water was the best solvent extractor. The use of polar solvents (water) for the extraction of antioxidant compounds can increase the recovery of more polar compounds, such as glycosylated phenolics, water soluble vitamins and bioactive peptides. The aqueous extract from hydrolysate (AEH) showed high antioxidant activity (221.84, 100.08 and 13.49 μmol/g of dry extract for the ORAC, TEAC and DPPH, respectively). The AEH of Adenanthera pavonina L. seeds was more efficiently through the transfer mechanism of hydrogen atoms than the transfer of electrons. The phenolic compound such catechin (6.08 µg/g), quercetin (0,18 µg/g), naringenin (1,31 µg/g), protocatechuic acid (3,35 µg/g), gentisic acid (2,81 µg/g), 4-hydroxybenzoic acid (0,53 µg/g), and ferulic acid (0,45 µg/g) were identified in the AEH by UHPLC-MS/MS. The flavanol catechin was the main phenolic compound found in the AEH. Therefore, AEH was chosen for antiproliferative activity assays, and showed significant results for the tumoral lineage of prostate (GI50= 2,5 µg/mL) and kidney (GI50= 29,9 µg/mL), while the control sample (non-enzymatically treated) showed only relevant results for the tumoral lineage of kidney (GI50= 67.5 µg/mL). The GI50 values of the AEH for the tumoral lineage of kidney and prostate were lower than control, which suggest that the enzymatic treatment was necessary to evidence the antiproliferative activity of A. pavonina L. seeds.

Keywords: antioxidant activity, bioactive compounds, enzyme-assisted extraction, antiproliferative activity, Adenanthera pavonina L. seeds.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Aspectos gerais da árvore e sementes da Adenanthera pavonina L. A) Árvore, B) Folhas C) Vagem e semente D) Sementes. Fonte: Maurício Mercadante. ... 24 Figura 2. Estrutura de compostos fenólicos comumente encontrados nas plantas. ... 29 Figura 3. Preparação da amostra. A) Semente in natura, B) Sementes após o procedimento de

lavagem, C) Sementes trituradas e armazenadas em embalagens seladas à vácuo. ... 39 Figura 4. Fluxograma geral do processo de extração assistida por enzimas de compostos

bioativos das sementes de Adenanthera pavonina L. Abreviações: TPC, conteúdo total de compostos fenólicos; TFC, conteúdo total de flavonoides. ... 42 Figura 5. Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos

utilizada no teste de atividade antiproliferativa. ... 47 Figura 6. Curva de contorno (A) e valores observados versus valores previstos (B) para a

capacidade antioxidante, avaliada pelo ensaio TEAC, do extrato aquoso das sementes de

A. pavonina L. ... 60

Figura 7. Curva de contorno (A) e valores observados versus valores previstos (B) para a capacidade antioxidante, avaliada pelo ensaio ORAC, do extrato aquoso das sementes de

A. pavonina L. ... 60

Figura 8. Atividade antiproliferativa in vitro da doxorrubicina em painel de linhagens celulares humanas. ... 67 Figura 9. Atividade antiproliferativa in vitro do extrato aquoso das sementes de Adenanthera

pavonina L. em painel de linhagens celulares humanas. ... 67

Figura 10. Atividade antiproliferativa in vitro da amostra controle das sementes de

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Atividades biológicas in vitro e in vivo da Adenanthera pavonina L. ... 26 Tabela 2 - Composição química da semente de carolina (Adenanthera pavonina L.) ... 27 Tabela 3 - Principais métodos e seus princípios de ação utilizados na determinação da atividade

antioxidante de componentes alimentares. ... 35 Tabela 4 - Exemplos do uso de extração assistida por enzimas para extração de compostos

antioxidantes a partir de diferentes partes de plantas. ... 38 Tabela 5 - Matriz do planejamento experimental de misturas para obtenção de compostos

bioativos das sementes de Adenanthera pavonina L. utilizando diferentes preparações enzimáticas. ... 41 Tabela 6 - Linhagens celulares tumorais e não tumoral (HaCaT) utilizadas nos ensaios de

atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI). ... 45 Tabela 7 - Parâmetros de espectrometria de massas para as transições MRM ... 51 Tabela 8 - Valores médios de parâmetros físico-químicos e composição centesimal das

sementes in natura de A. pavonina L. ... 53 Tabela 9 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio ORAC,

das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes* ... 55 Tabela 10 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio TEAC,

das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes* ... 55 Tabela 11 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio DPPH,

das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes* ... 55 Tabela 12 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método

DPPH das sementes de A. pavonina L. ... 57 Tabela 13 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método

TEAC das sementes de A. pavonina L. ... 58 Tabela 14 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método

Tabela 15 - ANOVA do modelo quadrático para a capacidade antioxidante, avaliada pelo método TEAC, das sementes de A. pavonina L. ... 59 Tabela 16 - ANOVA do modelo cúbico especial para a capacidade antioxidante, avaliada pelo

método ORAC, das sementes de A. pavonina L. ... 59 Tabela 17 – Análise da atividade antioxidantes dos extratos aquosos das sementes de A.

pavonina . L. tratadas com protease e celulase... 61

Tabela 18 - Conteúdo de fenólicos totais, flavonoides e taninos condensados para os extratos aquosos das sementes de A. pavonina . L. tratadas com protease e celulase. ... 63 Tabela 19 - Perfil de compostos fenólicos para o extrato aquoso das sementes de A. pavonina

. L. tratadas com protease e celulase. ... 64

Tabela 20 - Valores de GI50 (em µg/mL) para as amostras controle e extrato das sementes de carolina (Adenanthera pavonina L.) frente a um painel de linhagens celulares humanas69

LISTA DE EQUAÇÕES

Equação 1. Equação de transferência de átomos de hidrogênio (APAK et al., 2007). ... 33 Equação 2. Equação de transferência de elétrons (APAK et al., 2007). ... 34 Equação 3. Equação para definição dos modelos das variáveis estudadas ... 40 Equação 4. Área da curva de decaimento da fluoresceína com adição da substância

antioxidante ... 44 Equação 5. Área sob a curva de decaimento da fluorescência corrigida... 44 Equação 6. Porcentagem de inibição do radical DPPH ... 45 Equação 7. Modelo quadrático para a capacidade antioxidante, avaliada pelo método TEAC,

das sementes de A. pavonina L. P: protease; A: α-amilase; C: celulase. ... 57 Equação 8. Modelo cúbico especial para a capacidade antioxidante, avaliada pelo método

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

786-0: Linhagem celular de adenocarcinoma de rim

AAPH: 2,2’-azobis (2’-metilpropionamidina) dihidrocloreto AC: Ácido cítrico

ABTS: 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) ANOVA: Análise de variância

ATT: Acidez total titulável

AUC: Área de decaimento sobre a curva CE: Equivalentes de catequina

CLUAE: Cromatografica líquida de ultra alta eficiência

CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

CTAAE-DAP (HPAEC-PAD): Cromatografia de Troca Aniônica de Alta Eficiência acoplada ao Detector Amperométrico Pulsado

DI: Densidades de inoculação DMSO: Dimetilsulfóxido

DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazil EAE: Extração assistida por enzimas EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético ERN: Espécies reativas de nitrogênio EROs: Espécies reativas de oxigênio

FUFOSE: The European Commission’s Concerted Action on Functional Food Science in

Europe

GAE: Equivalente de ácido gálico

GI50: Growth Inhibition 50 – concentração necessária para inibição de 50% da viabilidade

celular

HaCaT: Linhagem celular de queratinócito humano HbA1c: Hemoglobina glicosilada

HCl: Ácido clorídrico

HHDP: Ácido hexahidroxidifênico

HT-29: Linhagem celular de adenocarcinoma colorretal K-562: Linhagem celular de leucemia

IE: Fonte de ionização por electrospray

MCF-7: Linhagem celular de adenocarcinoma de mama MS: Massa seca

MRM: Monitoramento de reações múltiplas NaOH: Hidróxido de sódio

NAUC: Área útil, calculada pela diferença entre as AUC do extrato e do branco NCI: National Cancer Institute

NCI-ADR/Res: Linhagem celular de adenocarcinoma de ovário resistente a múltiplas drogas NCI-H460: Linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão tipo não pequenas células ORACFL: Capacidade de absorção do radical oxigênio

OVCAR-3: Linhagem celular de adenocarcinoma de ovário PBS: Solução salina tamponada

PC-3: Linhagem celular de adenocarcinoma de próstata pH: Potencial hidrogeniônico

RNS: Espécie reativa de nitrogênio

RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute 1640 SFB: Soro fetal bovino

SNC: Sistema nervoso central SRB: Sulforrodamina B SST: Sólidos solúveis totais TCA: Ácido tricloroacético TE: Equivalentes de Trolox

TEACABTS: Capacidade antioxidante equivalente ao trolox

TGI: Inibição total do crescimento

TPC: Conteúdo total de compostos fenólicos TFC: Conteúdo total de flavonoides

Trolox: Ácido (±) -6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromama-2-carboxílico U-251: Linhagem celular de glioblastoma

UACC-62: Linhagem celular de melanoma UV: Ultravioleta

Sumário

3.2 - Características da semente de Adenanthera pavonina L. relevantes para abordagem investigativa ... 27

3.3 - Compostos bioativos antioxidantes ... 27

3.4 - Capacidade antioxidante ... 32

3.5 - Extração assistida por enzimas ... 35

4 - MATERIAL E MÉTODOS ... 39

4.1 - Coleta e preparação das amostras ... 39

4.2 - Caracterização e composição centesimal da semente de Adenanthera pavonina L. .... 39

4.3 - Tratamento enzimático do pó das sementes de Adenanthera pavonina L. ... 40

4.4 - Procedimento de extração ... 41

4.5 - Atividades biológicas in vitro ... 43

4.5.1 - Avaliação da capacidade antioxidante ... 43

4.5.1.1 - Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) ... 43

4.5.1.2 - Capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC) ... 43

4.5.1.3 - Atividade sequestradora do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH•) ... 44

4.5.2 - Ensaio de atividade antiproliferativa com células tumorais humanas ... 45

4.5.2.1 - Cultivo celular ... 46

4.5.2.2 - Preparo das suspensões celulares ... 46

4.5.2.3 - Preparo e aplicação das amostras ... 47

4.5.2.4 - Análise dos Resultados dos ensaios antiproliferativos ... 48

4.6 - Determinação e identificação dos compostos bioativos ... 49

4.6.1 - Compostos fenólicos totais ... 49

4.6.2 - Determinação de taninos condensados ... 49

4.6.3 - Determinação do conteúdo de flavonoides ... 50

4.6.4 - Cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massas (CLUAE – EM/EM) ... 50

4.7 - Análise estatística ... 52

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 53

5.1 – Análise físico-química e centesimal ... 53

5.2 - Otimização do tratamento enzimático e extração de compostos com potencial antioxidante a partir das sementes de A. pavonina L. ... 54

5.3 - Análise das curvas de contorno ... 57

5.4 - Conteúdo de compostos fenólicos ... 62

5.5 - Perfil de compostos fenólicos do extrato aquoso do hidrolisado das sementes de A. pavonina L. ... 64

5.6 - Atividade antiproliferativa ... 66

6 - CONCLUSÃO ... 71

PERSPECTIVAIS FUTURAS ... 72

1 - INTRODUÇÃO GERAL

Nos últimos anos, os consumidores tornaram-se ainda mais exigentes na busca por uma alimentação saudável, uma vez que estão cada vez mais conscientes da associação entre a alimentação e seu impacto à saúde. Atualmente, os alimentos não visam apenas satisfazer a fome e fornecer os nutrientes necessários para os seres humanos, eles também podem prevenir doenças e melhorar o bem-estar físico e mental dos consumidores. Por isso, a consciência a respeito da correlação entre a dieta, saúde e prevenção de doenças está cada vez maior (MENRAD, 2003; ROBERFROID, 2000). Nas últimas décadas, a indústria alimentar investiu muitos esforços em pesquisa e desenvolvimento de alimentos mais saudáveis e nutritivos (LAGOS et al., 2015). Devido à busca crescente dos consumidores por alimentos mais saborosos e atrativos além de saudáveis e seguros.

Nesse contexto é possível observar que a nutrição evoluiu da prevenção de deficiências dietéticas e do estabelecimento do conceito de dieta equilibrada para a promoção do bem-estar, saúde e redução do risco de doenças (ROBERFROID, 2000). O termo alimento funcional foi utilizado pela primeira vez no Japão, na década de 1980, em referência aos alimentos utilizados na dieta normal que apresentam benefícios fisiológicos e/ou reduzem o risco de doenças, tais como doenças cardiovasculares, câncer, diabetes melito, obesidade, osteoporose e outras doenças crônicas não transmissíveis, além de suas funções básicas nutricionais (HARDY, 1998; KWAK; JUKES, 2001; STANTON et al., 2005).

Embora o termo alimento funcional tenha sido definido várias vezes (ROBERFROID, 2002), até agora não existe uma definição consensual para este grupo de alimentos (ALZAMORA et al., 2005). De acordo com a The European Commission’s

Concerted Action on Functional Food Science in Europe (FUFOSE), um produto alimentar

pode ser considerado funcional se, juntamente com o impacto nutricional básico, tenha efeitos benéficos em uma ou mais funções do organismo humano, melhorando assim as condições gerais e físicas e/ou diminuindo o risco de doenças. Um alimento é considerado funcional quando apresentar compostos biologicamente ativos naturalmente presentes ou adicionados intencionalmente nos alimentos, além disso, a bioatividade deve ser comprovada em ensaios clínicos. Assim, pílulas ou cápsulas contendo moléculas bioativas não são considerados como alimentos funcionais (DIPLOCK et al., 1999).

Os compostos bioativos são constituintes extra nutricionais e ocorrem em pequenas quantidades nos alimentos e podem ser obtidos por meio de uma dieta equilibrada, reduzindo o

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estresse oxidativo e o risco de doenças, especialmente câncer e aterosclerose, pois podem neutralizar as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio resultantes dos processos oxidativos intracelulares. Especialistas afirmam que pelo menos um terço dos casos de câncer e cerca da metade das doenças cardiovasculares podem ser prevenidas por meio da dieta (LUZIA; JORGE, 2013; VOLP; RENHE; STRINGUETA, 2009).

Nos últimos anos, estudos avaliaram a composição química de frutos e sementes exóticas a fim de encontrar fontes naturais de componentes bioativos que podem auxiliar na prevenção de doenças (HOLSER; BOST; VAN BOVEN, 2004; GONG et al., 2012; LUZIA; JORGE, 2013). As diferentes partes das plantas têm sido utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenças e suas características medicinais têm sido investigadas cientificamente em todo o mundo (SINGH; SHARMA; SARKAR, 2012). Dentre as plantas utilizadas na medicina popular destaca-se a Adenanthera pavonina L. No entanto, poucos estudos abordaram sua composição química e seus benefícios à saúde.

Adenanthera pavonina L. é uma espécie exótica pertencente ao grupo da família

Fabaceae e subfamília Mimosoideae (JOLY, 2002; JUDD et al., 2009). É uma árvore tropical originária da Índia, tendo sido introduzida em diversos países, como Malásia e Brasil. Popularmente conhecida como semente de carolina, olho-de-pavão e falso pau brasil, a

Adenanthera pavonina L. apresenta porte médio e pode ter tamanho variável entre 6 e 20 metros

de altura (JAROMIN; KORYCIŃSKA; KOZUBEK, 2011). As sementes de Adenanthera

pavonina L. foram muito utilizadas para pesar ouro, devido a exatidão de 4 unidades

corresponderem a 1 grama. Atualmente, devido a sua textura e beleza, de colocação vermelho brilhante, as sementes são utilizadas artesanalmente para produção de bijuterias.

Várias partes da planta Adenanthera pavonina L., tais como semente, folha e madeira, têm sido utilizadas na medicina popular para o tratamento de gota, inflamações, febre e reumatismo (JAROMIN; KORYCIŃSKA; KOZUBEK, 2011). A semente de Adenanthera

pavonina L. apresenta capacidade anti-inflamatória (OLAJIDE et al., 2004) e sua atividade

anticancerígena foi mencionada por Mujahid et al. (2016). No entanto, para estabelecer o potencial funcional desta semente são necessários mais estudos para valorizar e preservar a espécie.

2 – OBJETIVOS

2.1 - Objetivo geral

O objetivo geral deste trabalho foi estudar os compostos bioativos das sementes de

Adenanthera pavonina L. utilizando extração assistida por enzimas.

2.2 - Objetivos específicos

• Determinar a composição centesimal das sementes da Adenanthera pavonina L.; • Avaliar o tratamento enzimático mais adequado para a obtenção de compostos bioativos antioxidantes das sementes da Adenanthera pavonina L.

• Avaliar qual o melhor solvente, dentre os propostos no trabalho, para a obtenção de compostos bioativos antioxidantes presentes nas sementes da Adenanthera pavonina L.;

• Avaliar a capacidade antioxidante dos extratos das sementes da Adenanthera

pavonina L pelos métodos TEAC (capacidade antioxidante equivalente ao Trolox), DPPH

(atividade sequestradora do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e ORAC (capacidade de absorção do radical oxigênio);

• Determinar o perfil de compostos fenólicos no extrato das sementes de

Adenanthera pavonina L. por meio de cromatografia líquida de ultra alta eficiência (CLUAE);

• Determinar espectrofotometricamente o conteúdo total de compostos fenólicos, taninos condensados e flavonoides;

• Avaliar a atividade anticancerígena utilizando o ensaio de atividade antiproliferativa com células tumorais humanas.

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3 - REVISÃO DA LITERATURA

3.1 - Adenanthera pavonina L.

Adenanthera é uma palavra de origem grega formada pelos termos adeno

(glândulas) e antera (antera), ou seja, a presença de uma glândula aderida a antera que é o local onde são produzidos os grãos de pólen (SILVA; DE SOUZA; CARREIRA, 2004).

Conhecida popularmente como semente de carolina, olho-de-pavão e falso pau brasil, a Adenanthera pavonina L. (Figura 1) é uma árvore pertencente à família Fabaceae que apresenta porte médio e pode ter tamanho variável entre 6 e 20 metros de altura (JAROMIN; KORYCIŃSKA; KOZUBEK, 2011). Adenanthera pavonina L. é uma árvore de crescimento rápido incluída no Global Compedium of Weeds como uma erva natural e agrícola (RANDALL, 2012). A classificação taxonômica da planta Adenanthera é mostrada como segue: Classe Magnoliopsida; Ordem Fabales; Família Fabaceae; Subfamília Mimosoideae; Gênero

Adenanthera; Espécie Adenanthera pavonina; Tribo Mimoseae; Adenanthera pavonina.

Figura 1. Aspectos gerais da árvore e sementes da Adenanthera pavonina L. A) Árvore, B) Folhas C) Vagem e semente D) Sementes. Fonte: Maurício Mercadante.

No Brasil, a Adenanthera pavonina L. foi incorporada como planta ornamental, para arborização urbana, paisagismo e pela sua madeira nobre. Devido a sua fácil adaptação e rápido crescimento, pode ser encontrada em quase todo o território nacional, em regiões de clima tropical, como nos Estados do Mato Grosso, São Paulo e Mato Grosso do Sul e na Região Nordeste, entre outros (D´AGOSTINI et al., 2009).

Sua madeira possui coloração avermelhada e apresenta elevada qualidade para a construção civil e marcenaria. Suas folhas são pecioladas e paripinadas devido a sua ligação

com um pecíolo e pelo número de folíolos no ápice serem pares, respectivamente, contendo de dois a cinco pares de pinas em lados contrários e de seis a dez folíolos curtos. As flores possuem coloração amarelo-pálida e suas vagens são estreitas, compridas e de coloração marrom que ao se abrirem liberam as sementes maduras. O tronco da árvore apresenta coloração marrom escuro na superfície externa e branco acinzentado na parte interna (ALVES; KUBOTA, 2013; MUJAHID et al., 2016).

As sementes moídas de Adenanthera pavonina L. são utilizadas popularmente na Índia no tratamento de inflamações, enquanto o líquido obtido após o cozimento das folhas é empregado no tratamento de reumatismo e gota (JAROMIN; KORYCIŃSKA; KOZUBEK, 2011). Na medicina popular as sementes cozidas são utilizadas para o tratamento de infecções pulmonares e aplicadas no tratamento de oftalmia crônica (GHANI, 2003). Na Índia,

Adenanthera pavonina L. tem sido tradicionalmente utilizada no tratamento de diabetes

mellitus e desordens no metabolismo lipídico (PANDHARE et al., 2012). Além disso, existem vários relatos na literatura a respeito das atividades anti-inflamatória (OLAJIDE et al., 2004), antioxidante (MUJAHID et al., 2015; RODRIGO; JAYASINGHE e BANDARA, 2007), antimicrobiana (CHAUHAN et al., 2015), antidiabética (PANDHARE e SANGAMESWARAN, 2012), anticancerígena (CHAUHAN et al., 2015), anticonvulsivante (ONI et al., 2009), antidepressiva (ONI et al., 2009) e antifúngica (MUJAHID et al., 2016) de extratos de folhas, sementes casca e tronco de Adenanthera pavonina L.. As atividades biológicas da Adenanthera pavonina L. reportadas na literatura estão apresentadas na Tabela 1.

Adenanthera pavonina L. é uma árvore alimentícia, pois se consome suas sementes

e folhas após o cozimento. Na Índia, as sementes são assadas ou cozidas antes de serem usadas como complemento alimentar com arroz para crianças e adultos (MUJAHID et al., 2016). Segundo Howes (1974) e Yadav et al. (1976), as sementes e as vagens da Adenanthera

pavonina L. contém diversos fitoquímicos com destaque para os glicosídeos, saponinas e

esteroides. As sementes apresentam o composto O-acetiletanolamina como princípio ativo anti-inflamatório (PANDHARE et al., 2012). As folhas possuem octacosanol, dulcitol, e os fitoesteróis glicosídeos de β-sitosterol e estigmasterol, e a casca contém glicosídeo estigmasterol (KHARE, 2007). O composto β-sitosterol apresenta ampla variedade de benefícios reconhecidos cientificamente contra doenças inflamatórias, disfunções imunes e artrite reumatoide (BOUIC et al., 1996). No entanto, as sementes exóticas ainda são pouco

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exploradas comercialmente, sendo necessários mais estudos para melhor compreensão de suas atividades biológicas bem como seus benefícios à saúde humana.

Tabela 1 - Atividades biológicas in vitro e in vivo da Adenanthera pavonina L.

Atividade biológica Exemplo Dose resposta ou concentração do extrato Referência Atividade anti-hipertensiva

O extrato metanólico das sementes reduziu a pressão sanguínea em camundongos após um período de 4 semanas.

200 mg/kg Adedapo et al. (2009)

Atividade antidiabética

Extrato aquoso das sementes reduziu o conteúdo de proteinúria, albuminúria, níveis de lipídios e HbA1c em ratos diabéticos.

50 mg/kg Pandhare et al. (2012)

Atividade anti-inflamatória

Extrato metanólico das sementes reduziu significativamente a inflamação de edema de pata em ratos.

200 mg/kg Olajide et al. (2004) Extrato metanólico da casca da árvore inibiu a

inflamação de edema de pata em ratos. 400 mg/kg

Ara et al. (2010) Extrato metanólico das folhas inibiu a biossíntese de

prostaglandina e reduziu células inflamatórias em ratos.

200 mg/kg Jayakumari et al. (2012) Atividade

anticonvulsivante Extrato _{significativamente a incidência e a duração da} metanólico das sementes reduziu convulsão induzida em ratos.

50 mg/kg Oni et al. (2009)

Atividade antimicrobiana

Extratos metanólicos da semente apresentaram atividade antimicrobiana contra Salmonella sp,

Serretia sp, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcuus aureus e Klebsiella pneumoniae, enquanto o extrato metanólico das folhas inibiu o crescimento de Salmonella sp, Shigella sp e Proteus Mirabili.

50 mg/mL Chauhan et al. (2015)

Atividade antioxidante

Extrato metanólico das folhas neutralizou os danos causados por espécies reativas de oxigênio (EROs). Além disso, o extrato foi eficiente no sequestro de radical DPPH. IC50 = 425 μg/mL Mujahid et al. (2015) Atividade anticancerígena

Extrato metanólico das sementes apresentaram eficácia contra a linhagem tumoral de câncer de osso (MG 63). No entanto, o extrato metanólico das folhas não apresentaram efeito anticancerígeno contra hepatocarcinoma.

GI50 = 73.48

μg/mL

Chauhan et al. (2015)

Dose resposta, extrato/peso corpóreo (mg/kg); IC50, concentração em μg/mL de extrato metanólico das folhas de

Adenanthera pavonina L. requerida para diminuir 50% da concentração inicial do radical DPPH; GI50,

3.2 - Características da semente de Adenanthera pavonina L. relevantes para abordagem investigativa

As sementes de Adenanthera pavonina L. apresentam uma quantidade significativa de proteína e lipídios (Tabela 2), sendo a farinha desta semente uma alternativa como fonte de proteínas na alimentação animal. Uma pequena quantidade de compostos que podem apresentar alguma característica antinutricional foram encontrados nas sementes, tais como taninos (1,91 g/100 g), fitatos (0,13 g/100 g) e L-DOPA (2,86 g/100 g), sendo estes valores similares a outros alimentos consumidos, como feijão e ervilha (APATA; OLOGHOBO, 1994; EZEAGU et al., 2004; SIDDHURAJU; VIJAYAKUMARI; JANARDHANAN, 1996

Tabela 2 - Composição química da semente de carolina (Adenanthera pavonina L.)

Parâmetros Conteúdo Composição Centesimal (g/100g MS) Proteína 29,44 Lipídios 17,99 Cinzas 2,37 Carboidratos 50,20 Açúcares totais 8,22 Amido 41,95 Valor energético (kJ/g) 19,20 Minerais (mg/100g MS) Sódio 512,53 Potássio 1252,85 Ferro 10,25 Cobre 2,28 Zinco 4,56 Manganês 2,28

Fonte: Adaptado de (EZEAGU et al., 2004).

3.3 - Compostos bioativos antioxidantes

Os compostos bioativos em alimentos são classificados como substâncias extra nutricionais que ocorrem em pequenas quantidades e que oferecem benefícios à saúde além do valor nutricional básico (NIRMALA; BISHT; LAISHRAM, 2014). Os compostos bioativos são produzidos como metabólitos secundários de plantas e são conhecidos como substâncias que têm efeito em sistemas biológicos por apresentam potencial terapêutico e contribuir para as

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atividades biológicas (AZMIR et al., 2013; SINGH et al., 2016). Os produtos naturais ricos em compostos bioativos são promissoras fontes para o desenvolvimento de novos medicamentos, alimentos funcionais e aditivos alimentares (REN et al., 2013). Extratos de plantas contendo compostos bioativos podem ser usados como ingredientes funcionais na produção de medicamentos e cosméticos (BITENCOURT et al., 2014).

Os vegetais produzem uma grande variedade de compostos orgânicos essenciais para o crescimento e para a reprodução vegetal que estão envolvidos diretamente na função estrutural e de armazenamento de energia, tais como os carboidratos, aminoácidos e lipídios. Por outro lado, outros compostos não estão associados diretamente aos processos de crescimento, desenvolvimento e reprodução dos organismos vegetais. Esses compostos são conhecidos como metabólitos secundários, cuja função é defender os vegetais contra o ataque de herbívoros e patógenos, além de atuarem como atrativos para animais polinizadores e dispersores de sementes (TAIZ; ZEIGER, 2006). Os metabólitos secundários de plantas podem ser divididos em três grupos quimicamente distintos: terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000; SHAHIDI, 1997; SHAHIDI; HO, 2005; SHAHIDI; NACZK, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2006). Os compostos bioativos mais estudados e comumente encontrados em fontes naturais são os compostos fenólicos, que apresentam inúmeros benefícios para a saúde (GUINÉ et al., 2011), bem como diversas aplicações na ciência e indústria de alimentos.

Quimicamente, os compostos fenólicos contêm pelo menos um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos (APAK et al., 2007; HAMINIUK et al., 2012), e podem estar associados com carboidratos (simples ou complexos), lipídios, ácidos orgânicos e componentes da parede celular (celulose, hemiceluloses e lignina) (QUIROS-SAUCEDA et al., 2014; VELDERRAIN-RODRÍGUEZ et al., 2014). A estrutura dos compostos fenólicos varia de moléculas simples (ácidos fenólicos) até polímeros (proantocianidinas). Exemplos de estruturas de compostos fenólicos comumente encontrados nas plantas estão apresentadas na (Figura 2). Os compostos fenólicos são sintetizados durante o desenvolvimento normal da planta, bem como em resposta a diferentes condições de estresse, radiação UV e ferimentos (NACZK; SHAHIDI, 2004). Esses compostos são metabólitos secundários abundantemente encontrados em plantas e podem ser classificados como compostos solúveis em água, tais como os ácidos fenólicos, fenilpropanoides, flavonoides e quinonas, ou compostos insolúveis em água, tais como os taninos, lignanas e ácidos hidroxicinamínico ligados à parede celular (RISPAIL; MORRIS; WEBB, 2005).

Figura 2. Estrutura de compostos fenólicos comumente encontrados nas plantas.

Fonte: Adaptado de Apak et al. (2007). As estruturas químicas foram obtidas com o auxílio do banco de dados ChemSpider (http://www.chemspider.com) e do software ACD/ChemSketch versão 2015.2.5 (ACD LABS, Toronto, Canadá).

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Apesar da grande variedade de compostos fenólicos que ocorrem na natureza, os principais são ácidos fenólicos, flavonoides e taninos (KING; YOUNG, 1999). Os ácidos fenólicos ocorrem nas matrizes vegetais na forma de ésteres ou como glicosídeos conjugados com outros compostos como flavonoides, álcoois, esteróis e glicosídeos (GUINÉ et al., 2011). Os ácidos fenólicos são classificados em dois subgrupos, conhecidos como ácidos hidroxibenzoicos que possuem em comum a estrutura C6-C1 e os ácidos hidroxicinâmicos que são compostos aromáticos de cadeia lateral com três carbonos C6-C3 (BRAVO, 1998). Os ácidos hidroxibenzoicos incluem o ácido gálico, p-hidroxibenzoico, ácido protocatecuico, vanílico e siríngico, os quais estão frequentemente presentes na forma ligada e são componentes de estruturas complexas como ligninas e taninos hidrolisáveis, sendo encontrados como derivados de açúcares e ácidos orgânicos em alimentos vegetais. Os ácidos hidroxicinâmicos incluem o ácido cafeíco, ferúlico, p-cumárico e sinápico que estão presentes principalmente na forma insolúvel, ligados a componentes estruturais da parede celular, como celulose, lignina e proteínas através de ligações éster (LIU, 2007).

Os flavonoides são uma grande família de compostos fenólicos sintetizados por plantas que apresentam na sua estrutura três anéis na forma C6-C3-C6 que constituem diferentes classes de compostos, tais como, antocianinas, chalconas, flavanois, isoflavonas, flavonas, flavononas e flavonois com base em diferentes padrões de substituição como os grupos metoxila e hidroxila (SHAHIDI; YEO, 2016). Entre as propriedades dos flavonoides, a ação anti-inflamatória, a capacidade de eliminação de radicais livres e inibição de enzimas hidrolíticas e oxidativas estão entre as mais conhecidas (FRANKEL, 1997; KUMAR; PANDEY, 2013).

Os taninos são compostos fenólicos solúveis em água com massas moleculares entre 500 e 3000 Da (BATE-SMITH; SWAIN, 1962) que possuem propriedades especiais, como a capacidade de formar complexos insolúveis em água com os alcalóides, gelatina e outras proteínas (SANTOS-BUELGA; SCALBERT, 2000). Baseados na estrutura química e propriedades, os taninos podem ser divididos em dois principais grupos: taninos hidrolisáveis e condensados. Os taninos hidrolisáveis são compostos que contém um núcleo central de glicose ou outro poliol esterificado, com ácido gálico, também chamado de galotaninos ou ácido hexahidroxidifênico (HHDP) (KOLECKAR et al., 2008) e são encontrados em menor concentração em plantas que os taninos condensados (CLIFFORD; SCALBERT, 2000; HASSANP OUR et al., 2011). Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela policondensação de duas ou mais unidades de flavon-3-ol (SCHOFIELD; MBUGUA;

PELL, 2001). Os taninos também são conhecidos como proantocianidinas devido a capacidade em se decompor em antocianidinas quando aquecidos em soluções etanólicas. As unidades básicas mais frequentes dos taninos condensados são derivadas dos flavan-3-ols: catequina, epicatequina, galocatequina (KOLECKAR et al., 2008).

Os compostos fenólicos despertam grande interesse devido a sua capacidade antioxidante observada em estudos in vitro e in vivo. Os compostos fenólicos podem ser encontrados nas plantas, principalmente, nas formas livre (ex.: ácido gálico), glicosilados (ex.: naringina), esterificados (ex.: proantocianidinas) e insolúveis (ex.: ácido ferúlico ligado a parede celular) (SHAHIDI; YEO, 2016). A maioria dos compostos fenólicos insolúveis formam ligações covalentes com substâncias da parede celular, tais como pectina, celulose, arabinoxilana, e proteínas estruturais. Os compostos fenólicos insolúveis ligados a parede celular representam uma grande quantidade (cerca de 20-60% em vegetais, frutas e leguminosas – sementes) em comparação com os compostos fenólicos solúveis (livres, glicosilados e esterificados) em alimentos (NAYAK; LIU; TANG, 2015; SHAHIDI; YEO, 2016).

Os compostos fenólicos apresentam uma grande variedade de bioatividades, tais como efeito antialérgico (BENAVENTE-GARCIA et al., 1997), anti-inflamatório (MIDDLETON; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000), antiaterogênico (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006), antimicrobiano (PUUPPONEN-PIMIA et al., 2001), antioxidante (BENAVENTE-GARCIA et al., 2000), antitrombótico, cardioprotetor e vasodilatador (MANACH; MAZUR; SCALBERT, 2005; SAMMAN; LYONS WALL; COOK, 1998).

Os efeitos benéficos derivados dos compostos fenólicos podem ser atribuídos, em parte, a sua atividade antioxidante (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002). Alimentos com alto conteúdo de compostos fenólicos geralmente apresentam elevado potencial antioxidante (PARR; BOLWELL, 2000), portanto, alimentos ricos em fenólicos podem ser uma importante fonte natural de antioxidantes (HAMINIUK et al., 2012).

A capacidade antioxidante dos compostos fenólicos é atribuída pelo sequestro radicais livres, doar átomos de hidrogênio ou elétrons e quelar cátions metálicos (AFANAS’EV et al., 1989; AMAROWICZ et al., 2004). A estrutura química dos compostos fenólicos é um fator determinante na sua capacidade de eliminar radicais livres e de quelar íons metálicos (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006). A capacidade antioxidante dos ácidos fenólicos depende do número e posições dos grupos hidroxílicos em relação ao grupo funcional carboxil, assim a atividade antioxidante aumenta com o grau de hidroxilação, por exemplo, o

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ácido gálico trihidrolixado apresenta alta atividade antioxidante. No entanto, a substituição do grupo hidroxila na posição 3 e 5 com grupos metoxil reduz a atividade do ácido siríngico (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; ROBARDS et al., 1999).

3.4 - Capacidade antioxidante

A oxidação é um processo metabólico natural de organismos vivos na produção de energia necessária para atividades vitais das células. No entanto, o metabolismo do oxigênio nas células vivas causa a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e/ou nitrogênio (ERN) (ROESLER et al., 2006). De acordo com Davies (1995), a oxidação consiste na transferência de elétrons a partir de um átomo para outro e representa uma parte essencial do metabolismo e da vida aeróbica, pois o oxigênio é o aceptor final de elétrons no sistema de fluxo de elétrons que produz energia na forma de ATP. Dessa forma, o estresse oxidativo é um resultado inevitável da vida em um ambiente rico em oxigênio (DAVIES, 2001).

Radicais livres ou espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio são átomos, moléculas ou íons altamente instáveis e reativos devido à presença de um ou mais elétrons desemparelhados (SITTA et al., 2014), que favorece a reação de oxidação de outras moléculas, como lipídios, proteínas e DNA, com o intuito de promover a estabilidade da molécula (GOMES et al., 2012).

Espécies reativas de oxigênio (ERO) na forma de ânion superóxido (O2•‾), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO•) são subprodutos naturais do metabolismo humano (AMAROWICZ et al., 2004). Quando em excesso no organismo, podem atacar as moléculas biológicas, como lipídios, proteínas, enzimas, DNA e RNA, levando a lesão de células ou dos tecidos associados a doenças degenerativas (JUNG et al., 1999; PIERGIORGIO PIETTA; SIMONETTI; MAURI, 1998; VALENTÃO et al., 2002). Embora o organismo apresente mecanismos de defesa no combate e redução do dano oxidativo, evidências epidemiológicas indicam que o consumo de alimentos que contêm antioxidantes, principalmente flavonoides e outros polifenóis, associado a um estilo de vida saudável podem auxiliar o organismo no combate e redução dos danos oxidativos (CAO et al., 1998; PULIDO; BRAVO; FULGENCIO, 2000).

Um antioxidante é uma molécula capaz de retardar ou reduzir a oxidação de outras moléculas (HALLIWELL, 1996; GULCIN, 2012). Os compostos antioxidantes podem neutralizar os radicais livres e indiretamente aumentar a vida útil de um alimento, retardando o processo de peroxidação lipídica, que é um dos principais mecanismos de deterioração dos

alimentos durante o processamento e armazenamento (HALLIWELL, 1996). Os antioxidantes protegem o organismo humano dos efeitos deletérios dos EROs (quando em excesso), retardando o desenvolvimento de diversas doenças crônicas bem como a peroxidação lipídica. Eles são frequentemente adicionados aos alimentos para prevenir e/ou evitar reações em cadeia provocadas pelos radicais durante o processo oxidativo (BREWER, 2011; GULCIN, 2012).

O interesse por antioxidantes naturais também está relacionado com a possibilidade destes compostos serem utilizados como substitutos aos antioxidantes sintéticos utilizados pela indústria farmacêutica, cosmética e, principalmente, alimentícia (ALMEIDA et al., 2011). Dessa forma, diversas técnicas têm sido desenvolvidas e aperfeiçoadas para avaliação e identificação de antioxidantes em matrizes vegetais.

A capacidade de um composto antioxidante em sequestrar radicais livres pode ser investigada por meio do uso de radicais estáveis de referência ou por métodos de competição empregando espectrofotômetro convencional operando no UV/Visível. Nestes métodos, o antioxidante reduz o composto cromogênico de natureza radical e, consequentemente, ocorre o desaparecimento ou modificação da região cromófora, ou seja, perda da intensidade de coloração do meio reacional. Assim, o grau de mudança de cor (mensurado por meio da absorbância a um determinado comprimento de onda) está correlacionado com a concentração de antioxidantes na matriz alimentar (THATOI; PATRA; DAS, 2014). Os métodos utilizados para avaliar a atividade antioxidante podem ser classificados de acordo com o mecanismo de reação, como métodos de transferência de átomos de hidrogênio ou métodos de transferência de elétrons (APAK et al., 2007).

De acordo com Apak et al. (2007), os métodos baseados na transferência de átomos de hidrogênio medem a capacidade que um antioxidante (AH) tem em sequestrar radicais livres (R•) pela doação de átomo de hidrogênio (H•). Nestes métodos, tanto o indicador fluorescente quanto os antioxidantes presentes reagem diretamente com o radical, dessa forma a atividade antioxidante é determinada através da competição, onde é necessário medir a curva de decaimento da fluorescência do indicador na presença e ausência de antioxidantes e integrando a área sob a curva. Dentre os métodos está a Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio (ORAC).

R• + AH → RH + A•

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Os métodos baseados na transferência de elétrons medem a capacidade de um antioxidante (AH) em reduzir qualquer composto, normalmente íons metálicos, grupos carbonila e radicais (R•), por meio da transferência de um elétron. Na maioria destes ensaios, os antioxidantes reagem com um indicador fluorescente ou colorimétrico (agente oxidante). Os ensaios espectrofotométricos baseados na transferência de elétrons medem a capacidade de um antioxidante em reduzir um agente oxidante, o qual muda de cor quando reduzido, sendo que o grau de mudança de cor (um aumento ou redução da absorbância a um dado comprimento de onda) é correlacionado à concentração de antioxidantes presentes na amostra (APAK et al., 2007). Dentre os métodos incluem-se o método de Capacidade Antioxidante Equivalente ao

Trolox (TEAC) e de Atividade Sequestradora do Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH•);

R• + AH → R‾+ AH•+ AH•+ _{+ H}

2O → A• + H3O+ R‾ + H3O+ → RH + H2O AH + M3+ → AH+ + M2+ Equação 2. Equação de transferência de elétrons (APAK et al., 2007).

No entanto, não há procedimento padronizado para avaliar a capacidade antioxidante, por isso, é necessário realizar diferentes ensaios, com fundamentos e mecanismos de ação diferentes (OLIVEIRA et al., 2009). DPPH, TEAC e ORAC estão entre as técnicas mais utilizadas para avaliação da capacidade antioxidante de extratos de plantas e alimentos. Na Tabela 3 estão apresentados os métodos mais utilizados para determinação da capacidade antioxidante in vitro de matrizes vegetais.

Tabela 3 - Principais métodos e seus princípios de ação utilizados na determinação da atividade antioxidante de componentes alimentares.

Método Princípio Referências

Capacidade de Absorção do Radical

Oxigênio (ORAC)

O método ORAC mede a habilidade que um antioxidante tem contra o radical peroxila, onde o antioxidante e um marcador fluorescente (normalmente fluoresceína) competem cineticamente por radicais peroxila gerados através da decomposição de compostos nitrogenados tais como AAPH (2,2’-azobis-(2-metilpropionamidina)-dihidroclorado) a 37 °C e pH fisiológico. A atividade antioxidante pode ser determinada calculando a curva de decaimento da fluorescência de um indicador na presença e ausência de antioxidantes, integrando a área sob essas curvas (emissão 520 nm e excitação 485 nm). Apak et al. (2007) Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC)

No método TEAC, o composto ABTS é oxidado por oxidantes (normalmente K2S2O8) à sua correspondente forma radical cátion

(ABTS•+_{), que absorve a 734 nm (coloração verde-azulado), por}

meio da perda de um elétron pelo átomo de nitrogênio do ABTS. Na presença de qualquer antioxidante ocorre descoloração da solução acompanhada pelo decréscimo da absorbância que é proporcional à concentração de sequestradores de radicais adicionados na solução reagente de ABTS.

Gülçin (2012); Thatoi, Patra & Das (2014) Atividade Sequestradora do Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH•)

Este método é baseado na redução do radical DPPH• em solução alcoólica na presença de um antioxidante doador de elétrons devido à formação da forma não-radical DPPH-H na reação. Neste ensaio, o radical cromogênio púrpura (DPPH•), que absorve em um comprimento de onda de 516 nm, é reduzido por compostos sequestradores de radicais (antioxidantes) à sua correspondente forma reduzida (DPPH-H), de coloração amarela, com consequente desaparecimento da banda de absorção, sendo a mesma acompanhada pelo decréscimo da absorbância que é proporcional à concentração de sequestradores de radicais adicionados à solução reagente de DPPH.

Haminiuk et al. (2012); Thatoi, Patra & Das (2014)

3.5 - Extração assistida por enzimas

A extração é o estágio inicial e um dos passos mais importantes em estudo de obtenção de compostos bioativos a partir de plantas, pois desempenha um papel significativo e crucial no rendimento do processo de extração (AZMIR et al., 2013). Ao longo dos anos, diversas técnicas foram criadas e melhoradas para facilitar a recuperação de compostos bioativos de matrizes alimentares. Dentre eles, métodos não convencionais, como a extração assistida por enzimas têm ganhado destaque.

As enzimas, catalisadores de alta especificidade, podem ser empregados na extração, modificação ou síntese de compostos bioativos de origem natural (PURI; SHARMA; BARROW, 2012). As enzimas hidrolisam os componentes da parede celular de vegetais e, consequentemente, ocorre a liberação de compostos bioativos, o que promove o aumento na

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recuperação destes compostos a partir da matriz vegetal (PINELO; ARNOUS; MEYER, 2006). O processo de extração assistida por enzima (EAE) consiste em um método inovador para o uso de enzimas. Primeiramente, essa técnica foi utilizada para facilitar a extração de lipídios e proteínas a partir de sementes oleaginosas (LIU et al., 2016). A água é utilizada como meio reacional na EAE, assim, essa técnica é uma alternativa promissora aos métodos convencionais de extração que empregam solventes orgânicos (BAIANO, 2014). A EAE baseia-se na capacidade das enzimas de catalisar reações com especificidade e regiosseletividade em condições de processamento suave e em meio aquoso (GARDOSSI et al., 2010)

A EAE apresenta mais vantagens em relação aos métodos de extração convencionais por possuir apelo ecológico já que nessa técnica não são utilizados solventes orgânicos, apresenta maior rendimento e menor gasto de tempo na extração, o produto final apresenta maior qualidade devido à ausência de resíduos de solventes e baixo consumo de energia. Para a eficiência do processo, é necessário compreender parâmetros bioquímicos relacionados às enzimas, como modo de ação, propriedade catalítica, condições ótimas de atuação e quais enzimas ou combinação delas são mais adequadas para a obtenção dos compostos de interesse (PURI; SHARMA; BARROW, 2012).

Devido as suas vantagens, a EAE tem despertado o interesse de vários pesquisadores na busca por combinações de diferentes enzimas (carboidrases e proteases) para a degradação da parede celular de sementes e frutos (LIU et al., 2016). No entanto, essa é uma técnica que apresenta limitações, devido ao elevado custo para o processamento de grandes volumes de matéria-prima, a disponibilidade de preparações enzimáticas que não podem hidrolisar completamente as paredes celulares de vegetais, a dificuldade do uso em escala industrial já que as enzimas se comportam de forma diferente nas condições do meio ambiente (porcentagem de oxigênio, temperatura e disponibilidade de nutrientes) (BAIANO, 2014).

A liberação de compostos bioativos de células vegetais por degradação e extração pode ser otimizada usando preparações enzimáticas únicas ou combinadas (BAIANO, 2014). A combinação das enzimas amilase, celulase e protease foi mencionada (SHARMA; GUPTA, 2001; FANG; MOREAU, 2014) por melhorar o rendimento da extração de óleo a partir do farelo de arroz e do trigo. A combinação das enzimas α-amilase e celulase tem sido usada para a recuperação de ácidos fenólicos a partir da cevada (YU; VASANTHAN; TEMELLI, 2001). As enzimas podem ser de origem bacteriana, fúngica, animal e de vegetal. Para aumentar o rendimento da extração as condições operacionais, tais como temperatura, tempo, pH e relação enzima-substrato, podem ser otimizadas (BAIANO, 2014).

A enzima celulase é uma carboidrase que hidrolisa as ligações β-1,4 glicosídicas da celulose e pode romper a integridade da parede celular de plantas. As preparações de enzimas celulolíticas hidrolisam os componentes da parede celular, como a hemicelulose, celulose e lignina, aumentando o rendimento da extração (PURI; SHARMA; BARROW, 2012) de compostos, por exemplo, antioxidantes, polissacarídeos, óleos, pigmentos naturais e aromas (DE MOURA et al., 2008). Celulase de Thermobifida fusca foi empregado para a extração de compostos fenólicos a partir de casca de maçã (KIM et al., 2005). Além disso, celulase foi empregada para melhorar a extração de oligossacarideos a partir de arroz branco, no qual foi observado um rendimento de aproxidamente 40% (PATINDOL et al., 2007).

As proteases são enzimas que hidrolisam as ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas, podendo assim liberar peptídeos bioativos e outros compostos complexados às proteínas (WEIHOFEN; MARTOGLIO, 2003). O aumento na recuperação de compostos fenólicos a partir do bagaço de groselha preta foi observado com o uso de proteases (LANDBO; MEYER, 2001).

A adição de amilase durante o processo de extração melhora a recuperação de alguns compostos bioativos de interesse que estão ligados a parede celular da planta (AZMIR et al., 2013). Uma combinação de α-amilase, pectinase, protease e celulase aumentou o rendimento da extração de oleoresinas e gingerol a partir de gengibre (Zingiber officinale Roscoe) (NAGENDRA et al., 2013).

Enzimas únicas, por exemplo, celulase, pepsina, pectinase e β-glicosidase, ou combinadas (ex.: misturas comerciais) foram empregadas na extração de diferentes compostos antioxidantes, tais como naringenina, antocianinas e carotenoides e outros compostos bioativos (oligossacarídeos) a partir de diferentes partes de plantas, principalmente, casca e sementes de frutas (Tabela 4). As cascas e sementes de frutas contêm elevado conteúdo de compostos fenólicos livres e, principalmente, ligados a parede celular, material lignocelulosíco composto de celulose, hemicelulose, pectina, proteínas e outras componentes em menor quantidade. O uso de enzimas capazes de clivar parcial ou totalmente os componentes da parede celular permite liberar compostos fenólicos facilmente extraíveis com potencial antioxidante, dentre eles podemos citar o ácido ferúlico e o ácido p-coumárico. Por isso, o uso de EAE na extração de compostos antioxidantes a partir de subprodutos ou das partes não-comestíveis de plantas têm sido amplamente estudados nos últimos anos (PURI et al. 2011; KAMMERER et al. 2005; KIM et al. 2005; PATINDOL et al. 2007; FERRUZZI; GREEN 2006; RUIZ-TERAN et al. 2001; STOLL et al. 2003; MUÑOZ et al. 2004; LI et al. 2006; LANDBO; MEYER 2001).