Capítulo II
Figura 2.1. Estrutura da parede celular primária ...11 Figura 2.2. Estrutura molecular da celulose, em que uma unidade de celobiose se
encontra destacada...12 Figura 2.3. Elementos que compõem a microfibrilha de celulose da parede celular
vegetal...13 Figura 2.4. Estruturas dos diferentes domínios catalíticos ...23 Figura 2.5. Representação teórica da estrutura do xilano e dos locais onde as enzimas actuam...27 Figura 2.6. Estruturas de CBMs dependendo do seu tipo funcional ...35 Figura 2.7. Estrutura modular de proteínas de integração celulossomal de vários
microrganismos ...47 Figura 2.8. Representação esquemática do celulossoma do Clostridium thermocellum e sua organização...49 Figura 2.9. Representação do modelo do celulossoma do Acetivibrio cellullyticus ...52
Capítulo III
Figura 3.1. Marcador molecular HyperLadder I (Bioline) ...89 Figura 3.2. No painel A estão representadas as diferentes formas de DNA, que podem ser visualizadas em gel de agarose. O painel B, representa o padrão de migração em géis de diferentes concentrações de agarose, encontram-se exemplificados géis de
agarose de 0,7%, 1% e 1,5%. ...89 Figura 3.3. Detecção por electroforese desnaturante em géis de poliacrilamida, da
expressão de uma proteína recombinante...101 Figura 3.4. Representação esquemática das diferentes fases de dessalinização...110 Figura 3.5. Exemplos de curvas padrão utilizadas para determinar a concentração de proteínas em solução. ...113 Figura 3.6. Determinação da massa molecular em SDS PAGE ...117 Figura 3.7. Representação esquemática das operações efectuadas até ao processo de
cristalização de uma proteína recombinante...119 Figura 3.8. Representação de forma resumida do método utilizado para cristalização de proteínas recombinantes ...120 Figura 3.9. Leitões e gaiolas metabólicas utilizadas durante o ensaio ...125 Figura 3.10. Esquema representativo do ensaio realizado ...125 Capítulo IV
Figura 4.1. Arquitectura modular da celulase 5B do C. mixtus...138 Figura 4.2. Sequência nucleotídica da região codificadora da CmCBM6-2 do C. mixtus .139 Figura 4.3. Fragmentos de DNA resultantes da digestão do plasmídeo pCF1-Gem com NdeI e BamHI, após electroforese em gel de agarose a 1 % (p/v). ...140 Figura 4.4. SDS-PAGE em géis de 12% (v/v) de poliacrilamida, de polipéptidos presentes nos extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (Painel A) e Tuner (DE3) (Painel B) a
Índice de Fíguras
XX
Figura 4.5. Cromatograma correspondente à purificação da CmCBM6-2, por
cromatografia de afinidade com metal imobilizado... 144 Figura 4.6. SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12,5 % (p/v) e electroforese nativa em gel de 5 % (p/v) de poliacrilamida de várias fracções representativas da proteína
CmCBM6-2 recolhidas durante a cromatografia de afinidade... 144 Figura 4.7. Alinhamento da sequência primária deduzida da CmCBM6-2 com a
sequência primária da CmCBM6-1, da CsCBM6-3 e da CtCBM6 ... 146 Figura 4.8. Exemplificação da avaliação da interacção da proteína CmCBM6-2 com
diferentes ligandos solúveis, apenas se exemplifica o β-glucano de cevada ... 148 Figura 4.9. Calorimetria Isotérmica de Titulação da CmCBM6-2 na forma nativa e seus mutantes com celo-oligossacáridos e β-glucano de cevada... 150 Figura 4.10. Avaliação qualitativa da CmCBM6-2 à celulose insolúvel (Avicel)... 153 Figura 4.11. Ensaios qualitativos da ligação da CmCBM6-2 à ASC... 153 Figura 4.12. Avaliação quantitativa da ligação da proteína nativa e dos seus mutantes à celulose insolúvel... 154 Figura 4.13. Representação esquemática dos ligandos que interagem com a
CmCBM6-2... 158 Figura 4.14. Representação da fenda B e dos resíduos que a decoram da CmCBM6-2, CtCBM6 e da CsCBM6-3. ... 160 Figura 4.15. Localização dos aminoácidos no local de ligação da fenda A da
CmCBM6-2... 162 Figura 4.16. Representação esquemática dos ligandos que interagem com a fenda A da CmCBM6-2... 163 Figura 4.17. Localização dos aminoácidos que decoram a fenda B da CmCBM6-2... 164 Figura 4.18. Representação esquemática dos oligossacáridos que interagem com a
fenda B da CmCBM6-2... 165 Figura 4.19. Perspectiva estéreo da sobreposição da fenda A das três proteínas,
CmCBM6-2 ligada à xilotetrose, a CsCBM6-3 com xilotriose e por fim, a CtCBM6
com xilopentose ... 166 Figura 4.20. Estrutura tridimensional de complexos obtidos entre a CmCBM6-2 e
tetrassacáridos com ligações β-1,3-1,4. ... 167 Figura 4.21. No Painel A está representado o mapa de densidade electrónica da
xilopentose que se ligou à fenda A do CtCBM6. No Painel B encontramos a xilopentose a ligar-se à CtCBM6. No Painel C, encontramos representada o esqueleto das pontes de hidrogénio estabelecidas entre a proteína e o ligando e as interacções dentro dos cinco sublocais de ligação ... 171
Capítulo V
Figura 5.1. Arquitectura modular da CtLic26A-Cel5E do C. thermocellum (A) e da
versão truncada CtCBM11 (B).. ... 181 Figura 5.2. Fragmentos de DNA resultantes da digestão do plasmídeo pAG1-Gem com NheI e XhoI, após electroforese em gel de agarose a 1 % (p/v)... 182 Figura 5.3. Análise por SDS-PAGE dos extractos proteicos de E. coli durante a
purificação da CtCBM11 por cromatografia de afinidade... 184 Figura 5.4. Alinhamento da sequência secundária da CtCBM11 com as sequências
secundárias da CcCBM11 do Clostridium cellulolyticum, da SaCBM11 do
Streptomyces avermitilis e da FsCBM11 do Fibrobacter succinogenes ... 185 Figura 5.5. Avaliação da interacção da proteína CtCBM11 com diferentes ligandos
Índice de Fíguras
XXI
Figura 5.6. Calorimetria isotérmica de titulação da proteína nativa CtCBM11 com
oligossacáridos e polissacáridos ...188 Figura 5.7. Ligação da CtCBM11 a polissacáridos insolúveis avaliada por SDS-PAGE..191 Figura 5.8. Cromatograma correspondente à purificação da CtCBM11, por
cromatografia de afinidade com metal imobilizado ...192 Figura 5.9. Análise electroforética em géis de poliacrilamida desnaturante
(10 % T, 3 % C) (Painel A) e não desnaturante (10 % T, 3 % C) (Painel B) da proteína recombinate CtCBM11...193 Figura 5.10. Representação da estrutura tridimensional da CtCBM11. ...195 Figura 5.11. Coordenação dos dois iões cálcio da CtCBM11...196 Figura 5.12. Determinação das constantes de afinidade da CtCBM11 e seus mutantes para o ligando solúvel β-glucano de cevada...200 Figura 5.13. Ligação da CtCBM11 e seus mutantes a polissacáridos insolúveis avaliada por SDS-PAGE...202
Capítulo VI
Figura 6.1. Representação esquemática do policelulossoma adaptado da figura original publicada por Pereira et al., 2007 ...208 Figura 6.2. Sequência nucleotídica e aminoacídica da CtCohII do C. thermocellum ...211 Figura 6.3. Análise por SDS-PAGE dos extractos celulares da estirpe de E. coli
recombinante a expressar a CtCohII...213 Figura 6.4. Fracções da coesina II recolhidas após cromatografia de permuta aniónica.. .214 Figura 6.5. Estruturas tridimensionais das coesinas do C. thermocellum ...217 Figura 6.6. Visão ortogonal das potenciais superfícies electrostáticas da sétima coesina da CipA do tipo I do C. thermocellum (Carvalho et al., 2003), da coesina do tipo II
resolvida neste trabalho e a coesina do tipo II do A. cellulolyticus (Noach et al., 2003)....219 Figura 6.7. Alinhamento da sequência primária das coesinas do tipo II do C.
thermocellum, da coesina tipo II N-terminal do A. cellulolyticus (Ac) e a décima
primeira coesina do tipo II do B. cellulosolvens (Bc)...220 Figura 6.8. Imagem em estéreo divergente da sobreposição da coesina do tipo II do C. thermocelum a verde e a coesina do tipo II do A. cellulolyticus, a verde mostarda. ...222 Figura 6.9. Estrutura tridimensional do complexo coesina-doquerina do tipo II...224