Ensaios com animais

3.18.1. Animais, desenho experimental e recolha de amostras

O ensaio com animais foi conduzido em concordância com a regulamentação bioética para ensaios com animais segundo o regulamento da Direcção de Serviços de Meios de Defesa da Saúde, Bem-estar e Alimentação Animal, D.G.V., ref. 2682/99.

O trabalho experimental decorreu na Secção de Produção Animal do Instituto Superior de Agronomia e teve como objectivo o estudo do efeito da suplementação enzimática na digestibilidade fecal e ileal de dietas à base de Lupinus albus (cultivar Àres) por leitões desmamados precocemente. Para tal, utilizaram-se 24 leitões (machos) cruzados (Duroc x Landrace), desmamados aos 21 dias de idade, vacinados e desparasitados, cedidos pela empresa Suinopor, sedeada em Montemor-o-Novo. Os animais foram repartidos em função do seu peso vivo em quatro blocos homogéneos de 6 animais cada. Os leitões foram instalados individualmente em gaiolas metabólicas (1,00 m x 0,80 m) equipadas com dois tabuleiros em inox de forma a possibilitar a separação e recolha das fezes ou conteúdos ileais e urina (Figura 3.9).

Materiais e Métodos

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Os leitões de cada bloco receberam, durante um período de adaptação de 4 dias, uma alimentação igualizada de um regime base (Rb). Após este período de adaptação, seguiu-se um primeiro período experimental de 5 dias, no qual foi fornecido aos animais o regime base suplementado ou não com enzimas exógenas (Quadro 3.16). Durante este período foram efectuadas recolhas diárias de fezes para posterior cálculo da digestibilidade fecal aparente (DFA) (Figura 3.10).

Adaptação DFA DIA

Desmame 21 Dias 25 30 32 Recuperação 42 47 DIV 51 56 AIR

Adaptação DFA DIA

Desmame 21 Dias 25 30 32 Recuperação 42 47 DIV 51 56 AIR

Figura 3.10. Esquema representativo do ensaio realizado. Todo o ensaio decorreu nas instalações do Instituto Superior de Agronomia, da Universidade Técnica de Lisboa, excepto a intervenção cirúrgica que ocorreu na Faculdade de Medicina Veterinária pertencente à mesma Universidade.

Os alimentos foram fornecidos duas vezes por dia, uma de manhã, às 8h 30m e outra às 18h, e a água foi fornecida ad libitum, através de um bebedouro disposto na parte frontal da gaiola metabólica. Durante este período a ingestão de alimento foi controlada diariamente através da pesagem do alimento distribuído e da recolha e pesagem do alimento refugado, o qual foi conservado a -20 ºC para posterior análise do teor de matéria seca. Além disso, durante o ensaio os animais foram pesados no início e no fim de cada período de recolhas.

Findo o primeiro período experimental, os animais foram submetidos a uma anastomose ileo-rectal termino-lateral (Laplace et al., 1985), realizada na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa pela equipa do Professor António Ferreira. Esta prática cirúrgica foi realizada com o objectivo de permitir o acesso aos conteúdos ileais.

Figura 3.9. Leitões e gaiolas metabólicas utilizadas durante o ensaio. Cada gaiola possui um leitão e existiam seis gaiolas por cada tratamento.

Materiais e Métodos

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Após a cirurgia, os animais regressaram às gaiolas metabólicas e foram privados de alimento até à primeira refeição do dia seguinte. O consumo alimentar foi então retomado (cerca de 60 % do consumo normal) e gradualmente aumentado até ao terceiro dia pós-operatório, altura em que se atingiu o valor pré-definido (50 g kg-1 PV). O período de recuperação foi de 10 dias, dos quais 5 dias de um programa profilático, baseado em anti-inflamatório (Devan, Hoechst Veterinär, GmbH, Munique, Alemanha, 3 ml por animal e por dia, durante os primeiros 5 dias) e antibiótico (Omnaflopen, Hoechst Veterinär, GmbH, Munique, Alemanha, 3,5 ml por animal nos primeiros 3 dias do programa).

Após a fase de recuperação, os leitões foram sujeitos a um novo período de 5 dias de recolhas de efluentes ileais, para cálculo da digestibilidade ileal aparente (DIA). Depois da intervenção cirúrgica, foi fornecido diariamente aos animais, juntamente com o alimento, um suplemento mineral e vitamínico composto por 6 g de NaCl, 3 g de bicarbonato de sódio e 1,5 g de Sanimix, cuja composição se apresenta no Quadro 3.16, tendo em conta que a ausência funcional do ceco e do cólon origina uma menor absorção mineral (Fuller, 1991).

As recolhas dos efluentes ileais foram realizadas de 4 em 4 horas, sendo que cada fracção recolhida foi misturada com benzoato de sódio (10 g por kg de efluente) e com fenilmetilsulfonil fluorido (PMSF) (0,37 g por kg de efluente) para minimizar a deterioração proteica. As amostras assim preparadas foram conservadas a -20 ºC para posterior análise laboratorial.

Em seguida, para a determinação das perdas endógenas ileais dos aminoácidos e de forma a calcular a digestibilidade ileal verdadeira (DIV) forneceu-se aos animais um regime isento de proteína (RIP) (Quadro 3.17). Após 4 dias de adaptação a este regime, os animais foram sujeitos a um novo período de 5 dias de recolhas ileais, obdecendo ao mesmo protocolo descrito no parágrafo anterior.

3.18.2. Regimes experimentais

Os regimes experimentais consistiram numa dieta base formulada obedecendo às recomendações do INRA (1984) para os regimes de primeira idade dos leitões, suplementada ou não com um conjunto de diferentes enzimas exógenas. Os seus ingredientes foram adquiridos a várias empresas e misturados nas instalações do Instituto Superior de Agronomia, Lisboa. Assim, os regimes 2, 3 e 4 foram preparados a partir do regime base ao qual se incorporaram as enzimas exógenas estudadas neste trabalho, de forma a constituir os seguintes tratamentos: Rb) dieta basal, sem suplementação enzimática; Rb+Sf) dieta basal

Materiais e Métodos

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suplementada com 500 unidades kg-1 de um preparado enzimático com alfa-galactosidases (Safizym-GP-SAF-ISIS); Rb+α-gal) dieta basal suplementada com um preparado enzimático comercial de alfa-galactosidases (Alpha-Gal1000-Novozymes) com 500 unidades de enzima kg-1 e Rb+Cpx) a dieta Rb+α-gal suplementada com uma mistura comercial de celulases e hemicelulases contendo 800 unidades kg-1 de uma endo-1,4-β- celulase, 1800 unidades kg-1 de uma endo-1,3(4)-β-D-glucanase e 2600 unidades kg-1 de uma endo-1,4-β-xilanase (Roxazyme G200-Roche Vitamines), respectivamente. A inclusão de L. albus (tremoço branco) de variedade Àres (doce) nas dietas foi cerca de 30 % e os regimes foram equilibrados com lisina, metionina, treonina e triptofano totais pelo recurso a aminoácidos de síntese (Quadro 3.15).

Quadro 3.15. Composição centesimal dos regimes experimentais.

Composição centesimal Rb Rb+Sf Rb+αααα-gal Rb+Cpx

Trigo 44,5 44 43,5 43,49 Sêmea de Trigo 5 5 5 5 Lupinus albus 30 30 30 30 Soro de leite 8 8 8 8 Farinha de peixe 70 4,5 4,5 4,5 4,5 Óleo de milho 4 4 4 4 Lisina 0,6 0,6 0,6 0,6 Metionina 0,25 0,25 0,25 0,25 Treonina 0,2 0,2 0,2 0,2 Triptofano 0,1 0,1 0,1 0,1 Carbonato de cálcio 1,1 1,1 1,1 1,1 Fosfato de cálcio 1 1 1 1 Sal 0,5 0,5 0,5 0,5 Enzima Safizym-GP 0 0,5 0 0 Enzima Alpha-GAL 0 0 1 1 Roxazyme G 0 0 0 0,01 Sanimix (1) 0,25 0,25 0,25 0,25

(1) Sanimix fornece por cada kg de alimento: 12.000 UI de vitamina A; 2000 UI de Vitamina; 20,0 mg de Vitamina E; 1,0 mg de Vitamina B1; 4,0 mg de Vitamina B2; 1,5 mg de Vitamina B6; 0,020 mg de Vitamina B12; 2,0 mg de Vitamina K3; 0,10 mg de Vitamina H2; 25,0 mg de Ácido Nicotínico; 0,50 mg de Ácido Fólico; 15,0 mg de ácido Pantoténico; 400,0 mg de Colina (cloreto); 0,60 mg de Iodo (iodeto); 40,0 mg de Manganês (óxido); 125,0 mg de Ferro (sulfato); 100,0 mg de Zinco (óxido); 160,0 mg de Cobre (sulfato); 0,150 mg de Selénio (selenito); 0,400 mg de Cobalto (sulfato); 100,0 mg de Bacillus Toyoi; 50,0 mg de Carbadox; 500,0 mg de Aromatizante; 60,0 mg de Antioxidante (Bht); 1050,0 mg de Ácido Fosfórico e 150,0 mg de Ácido Cítrico.

Para a preparação das dietas, o trigo e o tremoço foram previamente moídos (num moinho de martelos equipado com um crivo de 3 mm) e colocados numa misturadora horizontal de duas espirais. Ao fim de uma mistura de 7 minutos, os restantes componentes (também eles moídos) (Quadro 3.15) foram adicionados aos ingredientes anteriores,

Materiais e Métodos

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procedendo-se à sua total incorporação na misturadora por mais 7 minutos. Foram adicionados para cada tratamento excipientes de trigo moído contendo as quantidades calculadas de enzimas, sujeitando cada alimento suplementado a uma nova mistura de 7 minutos.

O alimento foi fornecido aos leitões em duas refeições diárias de acordo com o peso vivo dos animais, sendo ajustado diariamente em função das quantidades refugadas, de modo a se igualizarem as ingestões, não se ultrapassando as 50 g/kg peso vivo.

Posteriormente foi oferecido um regime privado de proteína (RIP) (Quadro 3.16) de forma a determinar as perdas endógenas ileais de azoto e de aminoácidos.

Quadro 3.16. Composição centesimal da dieta livre de proteína oferecida aos leitões utilizados neste trabalho.

Composição centesimal RIP

Amido de milho 83,34 Óleo de milho 3,26 Celulose 4,2 Glucose 5 Fosfato bicálcico 2,86 Carbonato de cálcio 0,39 Sulfato de magnésio 0,2 Sal 0,5 Sanimix (1) 0,25

(1) Sanimix fornece por cada kg de alimento: ver Quadro 3.15.

3.18.3. Preparação e Análises Laboratorial das Amostras

As análises laboratoriais descritas neste trabalho foram realizadas com a colaboração do Laboratório Professor Pais de Azevedo, da Secção de Produção Animal do Instituto Superior de Agronomia, Universidade Técnica de Lisboa. No final de cada período de recolhas, procedeu-se à descongelação das amostras e prepararam-se amostras representativas (600 g) das fezes e dos efluentes ileais de cada leitão. As amostras foram colocadas em caixas de alumínio, pesadas e liofilizadas, após o que foram novamente pesadas e moídas num moinho Retch 5657 (Haan, Alemanha) equipado com crivo de 1 mm de diâmetro e homogeneizadas para posterior análise.

No que diz respeito aos regimes, colheram-se amostras representativas de cada regime experimental, as quais foram posteriormente moídas num moinho Retch 5657 (Haan, Alemanha) equipado com crivo de 1 mm de diâmetro.

Materiais e Métodos

- 129 - 3.18.3.1. Determinações analíticas gerais

Nas amostras dos regimes, fezes e efluentes ileais determinou-se a matéria seca (MS) por secagem em estuga a 103-105 ºC de cerca de 2 g de amostra até peso constante e as cinzas por incineração completa da quantidade de matéria seca obtida, em mufla a 550 ºC durante uma noite.

A proteína bruta (PB) (N x 6,25) dos alimentos e das fezes foi doseada pelo método de Kjeldahl, utilizando os aparelhos Tecator, Digestor System 2020 Digester e Kjeltec System 1026 Distiling Unit.

A energia bruta foi obtida por combustão completa das amostras em bomba calorimétrica modelo Parr 1261 (Paar, Illinois, EUA). Para tal procedeu-se à pesagem de 0,9- 1,0 g de cada amostra, e em seguida colocou-se numa prensa própria, obtendo deste modo uma pastilha. Esta pastilha em seguida foi inserida no aparelho, sofrendo uma combustão completa.

A determinação das fracções fibra neutro detergente (NDF), fibra ácido detergente (ADF) e lenhina ácido detergente (ADL) foi efectuada pelo método de Van Soest et. al. (1991), utilizando-se o aparelho Fibertec System 1020 da Tecator, com unidade de extracção a quente (1020) e a frio (1021).

O teor em celulose foi determinado através do cálculo da diferença entre o teor em ADF e o teor em ADL, enquanto que o teor em hemiceluloses foi obtido através do cálculo da diferença entre o teor em NDF e o teor em ADF.

A determinação da gordura bruta (GB) foi efectuada através do sistema HT Soxtec (Tecator) com unidade de extracção 1043 e o sistema de hidrólise 1047. Antes da extracção procedeu-se a uma hidrólise ácida (HCl 3N) e para a extracção foi utilizado éter de petróleo.

Todas estas determinações foram realizadas em duplicado.

Os aminoácidos dos regimes foram determinados de acordo com a Directiva Comunitária 98/64/EC (EC, 1998) nos laboratórios da Degussa AG (Hanan, Alemanha).

3.18.4. Parâmetros Estudados

3.18.4.1. Digestibilidade aparente fecal e ileal

A digestibilidade aparente fecal (DFA) e a digestibilidade aparente ileal (DIA) foram calculadas pelo método das colectas totais tendo-se procedido aos seguintes cálculos:

Materiais e Métodos - 130 - 100 ) ( × − = ingerida Quantidade fezes nas excretada Quantidade ingerida Quantidade DFA 100 ) ( × − = ingerida Quantidade ileais efluentes nos excretada Quantidade ingerida Quantidade DIA

Em que a digestibilidade fecal aparente é, por definição, a percentagem de nutriente ingerido não excretada nas fezes, e a digestibilidade ileal aparente é, por definição, a percentagem de nutriente ingerido não excretada nos efluentes ileais.

3.18.4.2. Digestibilidade ileal verdadeira

100 ) ( ) ( ×       + = regime do AA AA dos específico não endógeno aparente ileal idade Digestibil DIV

A digestibilidade ileal verdadeira (DIV), por sua vez, é definida como uma correcção das medidas de digestibilidade aparente pelas perdas endógenas basais, de azoto e de aminoácidos, considerando que estas são constantes e independentes da dieta, ou seja, da excreção endógena não específica. A composição em aminoácidos do endógeno não específico é expressa em g/kg de matéria seca ingerida. A composição em aminoácidos do regime é expressa em g/kg de matéria seca.

3.18.5 Análise estatística dos resultados

Os resultados foram analisados pelo programa SAS procedimento GLM (Statistical Analysis System [SAS], 1989). Os valores da digestibilidade aparente total e ileal foram comparados por análise de variância de acordo com um desenho em blocos completo. Sempre que os valores de F da análise da variância foram significativos as médias dos regimes foram comparadas pelo teste de Duncan (Steel e Torrie, 1980).

Materiais e Métodos

- 131 - Em que:

µ - média central;

ai – efeito associado ao bloco i;

bj – efeito associado ao regime j;

- 133 -

Capítulo IV