Clonagem de fragmentos de DNA

3.6.1. Digestão de fragmentos de DNA utilizando enzimas de restrição

A digestão de DNA com endonucleases de restrição foi utilizada quer para a linearização de vectores, de modo a permitir a posterior ligação a outras sequências de DNA com extremidades compatíveis, quer para a determinação relativa das posições reconhecidas pelas diversas endonucleases (mapas de restrição) para confirmação da clonagem ou sentido

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de orientação da sequência de DNA clonada, quer ainda para a realização de subclonagens com objectivos diversos.

O Quadro 3.5 mostra os locais de reconhecimento para cada uma das enzimas utilizadas neste trabalho. As digestões decorreram no tampão e às temperaturas recomendadas pelo fabricante (GE Healthcare). A composição dos tampões utilizados nas reacções de restrição encontra-se descrita no Quadro 3.6.

Quadro 3.5. Sequência de reconhecimento das enzimas de restrição utilizadas neste trabalho, respectivo tampão e temperatura óptima de acção. O local onde o enzima cliva a sequência de DNA está marcado por ↓.

Enzima Sequência de reconhecimento Tampão Temperatura

BamH I 5’ G↓GATCC 3’

3’ CCTAG↓G 3’ K 30 ºC

Hind III 5’ A↓AGCTT 3’

3’ TTCGA↓A 3’ M 37 ºC Nde I 5’ CA↓TATG 3’ 3’ GTAT↓AC 3’ H 37 ºC Nhe I 5’ G↓CTAGC 3’ 3’ CGATC↓G 3’ M 37 ºC Xho I 5’ C↓TCGAG 3’ 3’GAGCT↓C 3’ H 37 ºC

Quadro 3.6. Soluções tampão para as enzimas de restrição. Estas soluções tampão são fornecidas, pelo fabricante (GE Healthcare), juntamente com a enzima de restrição.

Solução Tampão Concentração Composição

M

(médio força iónica) 10×

100 mmol/l Tris-HCL. pH 7,5 100 mmol/l MgCl2

10 mmol/l Ditiotreitol 500 mmol/l NaCl

H

(alta força iónica) 10×

500 mmol/l Tris-HCL. pH 7,5 100 mmol/l MgCl2 10 mmol/l Ditiotreitol 1000 mmol/l NaCl K (tampão de potássio) 10× 200 mmol/l Tris-HCL. pH 8,5 100 mmol/l MgCl2 10 mmol/l Ditiotreitol 1000 mmol/l KCl

Numa reacção de digestão típica, cerca de 0,5 ou 1 µg de DNA foram digeridos com 10 unidades de enzima, durante pelo menos uma hora à temperatura recomendada, num volume final de 20 µl (Quadro 3.7). A reacção foi proporcionalmente escalonada para quantidades inferiores ou superiores de DNA. Nas reacções de restrição dupla, a digestão do fragmento

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pelas enzimas envolvidas processou-se em simultâneo, sempre que o tampão requerido para a actividade enzimática de ambas era o mesmo. Quando estes tampões eram diferentes, a primeira reacção iniciou-se com a enzima que actuava em tampão contendo as mais baixas concentrações de sais. Só após terminar esta digestão é que se passou à segunda reacção, sendo devidamente ajustado o tampão anterior, de forma a satisfazer as exigências de reacção da segunda enzima.

Quadro 3.7- Reacção típica de uma digestão simples de DNA, para um volume final de reacção de 20 µl. O volume de DNA (X) a usar, depende da sua concentração, sendo normalmente necessário perfazer o volume final com água Sigma (Y).

Componentes Volume

DNA (0,5 µg) X

10× Solução Tampão da Enzima 2 µl

Enzima de restrição (10 U) 1 µl

Água Sigma (Sigma-W4502) Y

Volume final da reacção 20 µl

3.6.2. Vectores

3.6.2.1. Vectores de clonagem

Os plasmídeos são por excelência vectores para a clonagem de genes ou sequências específicas de DNA, servindo de veículo transportador do gene para o interior da célula hospedeira, no caso concreto deste trabalho a E. coli. Estes plasmídeos são derivados de plasmídeos que ocorrem naturalmente e foram modificados, por engenharia genética, de forma a incorporarem um certo número de características desejáveis, tais como, marcadores de selecção e um local de clonagem múltipla que pode ser flanqueado por um promotor.

Os vectores utilizados para transformar E. coli possuem marcas genéticas, ou marcadores de selecção, que permitem identificar numa população de células bacterianas quais as que foram transformadas. Para tal, os plasmídeos, possuem normalmente um gene que confere às células resistência a um determinado antibiótico.

O local de clonagem múltipla é uma região que não é essencial para a viabilidade do plasmídeo e onde ocorrem sequências de reconhecimento únicas para várias enzimas de restrição. Isto confere uma grande flexibilidade ao processo de clonagem, uma vez que se

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torna possível clonar fragmentos de DNA cortado com qualquer uma dessas enzimas ou enzimas compatíveis.

Neste trabalho, foram utilizados como vectores de clonagem os seguintes plasmídeos: pGEM® -T Easy Vector Systems (Promega); pET-21a-d(+) e o pET-28a-c(+) (Novagen®). Os mapas de restrição dos vectores utilizados neste trabalho encontram-se representados no Anexo B.

O pGEM® -T e o pGEM® -T Easy

Os vectores pGEM® -T e pGEM® -T Easy Vector Systems (Promega) permitem a clonagem de produtos de PCR amplificados por DNA polimerase, como a BIOTAQ™ DNA Polymerase (Bioline), que gerem terminações poli-A (cauda de resíduos de adenina) nas extremidades 3’. Permitem também a clonagem dos produtos de PCR com terminações rombas, desde que seja efectuada uma poliadenilação aos produtos de PCR (A-tailing). São vectores que apresentam o gene de resistência à ampicilina e permitem utilizar a actividade da β-galactosidase para confirmar o fenómeno da recombinação. O local de clonagem múltipla possui uma vasta gama de locais de restrição, encontrando-se flanqueado pelos locais de restrição EcoRI, BstZI e NotI, facultando desta forma, por uma simples digestão enzimática, a libertação do fragmento clonado.

3.6.2.2. Vectores de expressão de proteína

Os vectores pET-21a-d(+) e pET-28a-c(+) fazem parte do designado sistema pET (Novagen). Foram desenvolvidos para expressão de proteínas recombinantes a níveis elevados e em fusão com um vasto reportório de marcadores. Estes vectores possuem promotores T7 reguláveis que, quando induzidos, permitem uma grande produção de RNA mensageiro (RNAm) a partir do gene clonado. O gene codificador da T7 RNA polimerase encontra-se no genoma de um grupo restrito de estirpes de E. coli que em exclusivo podem expressar as proteínas recombinantes. A possibilidade de utilizar várias estratégias para potenciar a estabilidade, solubilidade e níveis de expressão das proteínas recombinantes é uma das mais valias destes vectores. Estes vectores permitem ainda expressar as proteínas recombinantes com pequenas caudas de seis histidinas (His6-Tag) nas extremidades C- ou N-

terminal, que possibilitam a posterior purificação da proteína por cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Os mapas de restrição dos locais de clonagem destes vectores encontram-se no Anexo B.

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- 87 - Vector pET-21a-d

O vector pET21a (5443 pb)possui como marcador de selecção o gene de resistência à ampicilina e possibilita a produção de proteínas recombinantes contendo uma sequência de seis histidinas (His6-Tag®)na sua terminação carboxilada. Para além do promotor T7, possui o

gene lacI. Este gene produz uma proteína, que ao ligar-se ao promotor T7 impede a ligação da enzima T7 RNApolimerase das células de E. coli BL21(DE3) (Quadro 3.1). A adição de IPTG

(isopropil-β-D-tiogalactopiranosido) ao meio de cultura promove o deslocamento do repressor permitindo que a T7RNA polimerase transcreva o gene a jusante (Novagen).

Vector pET-28a-c

O vector de expressão pET-28a (5369 pb) possui como marcador de selecção o gene de resistência à canamicina. O gene clonado encontra-se sob o controlo do promotor T7. A sequenciação pode ser efectuada através do iniciador T7 terminal ou T7 promotor. Possui uma sequencia interna codificadora de uma proteína de fusão designada de T7•Tag e uma sequencia His•Tag (seis histidinas) na extremidade N- e C-, permitindo assim a possibilidade de escolher a localização das caudas de histidina para a purificação da proteína por cromatografia de afinidade (Novagen).

3.6.3. Ligação de moléculas de DNA

A ligação de moléculas de DNA para a obtenção de uma molécula recombinante requer, para além do DNA a clonar e do DNA do vector, a presença de uma enzima de ligação, a T4 DNA ligase.

As reacções de ligação foram efectuadas utilizando três vezes mais moléculas de fragmento de DNA a clonar que de vector. As reacções de ligação utilizaram 1 µl de enzima T4 DNAligase (10 U) (Promega), sendo efectuadas num volume final de 10 µl, no tampão constituído por: 30 mmol/l de Tris-HCl a pH 8,0; 10 mmol/l de MgCl2; 10 mmol/l de DTT e 1

mmol/l de ATP. Para controlar as reacções de ligação, foram também executadas reacções de autoligação usando exclusivamente o vector, nas mesmas condições e com idênticas quantidades, enzima e tampão, mas sem o fragmento de DNA. As ligações prolongaram-se por duas horas à temperatura ambiente ou a 16 ºC, durante 16 horas.

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