A caracterização in vitro dos estoques virais baseados em MSC

O teste inicial do vetor MSCV nos fibroblastos NIH 3T3 analisou a eficiência da

seleção baseada na blasticidina (Kimura et al., 1994). Já havia sido chamada atenção para a

necessidade de utilização de novos genes de resistência que não fossem o da neomicina em

vetores de transferência gênica– pela dificuldade de sua utilização in vivo (Huang et al.,

1997). Para a seleção de células progenitoras geneticamente modificadas, foi proposta uma

longos períodos de cultura (Treschow et al., 2007; Yoshimitsu et al., 2007). Por fim, é

importante enriquecer a fração de células geneticamente modificadas para aumentar a

possibilidade de sucesso da terapia, o que reforça esses dois conceitos apresentados

anteriormente (Ohashi et al., 1992). As células NIH 3T3 foram facilmente transduzidas

com uma quantidade mínima de vetor, evidenciado através do ensaio de transdução em

microplaca corado com solução de Coomassie (Figura 1, p. 105).

A transdução de células progenitoras envolve uma séria de aspectos relacionados à

vetorologia viral: design do vetor, MOI, adjuvantes selecionados, genotoxicidade e

expressão sustentável (Nienhuis et al., 2006; Chang and Sadelain, 2007). Alguns dados da

literatura apontavam para o emprego de altas MOI na transdução de CTM humanas (Zhang

et al., 2004; Van Damme et al., 2006), indicando uma maior dificuldade para a

transformação genética desse tipo celular. Como nosso interesse estava voltado para CTM

murinas e não havia possibilidade de testar diferentes MOI, optamos por inferir que uma

menor eficiência de transdução seria obtida nesse tipo celular. De fato, a seleção das CTM

transduzidas com o vetor MSCV mostrou que essas células representavam um desafio

maior à transdução do que os fibroblastos NIH 3T3 (Figura 3, p. 109). Os melhores

resultados foram obtidos com o estoque de maior título, indicando que uma maior MOI de

fato renderia uma melhor taxa de transdução (Kobayashi et al., 2005). Isso, contudo, é uma

medida de avaliação atrelada ao gene de seleção e ao emprego de blasticidina como agente

seletivo.

Os níveis de IDUA nas culturas não-selecionadas foram menores do que após a

adição de blasticidina, indicando que de alguma forma a pressão seletiva estava associada

ao aumento da expressão do transgene (Figura 4, p. 111). No caso do protocolo clínico

permissivas à expressão sustentável do transgene tenham apresentado uma vantagem

seletiva em termos de expansão (Aiuti and Cassani, 2007). No caso da MPSI, foi reportado

que a pressão de seleção via agente MTX em linfócitos e células-tronco hematopoiéticas

selecionava os clones com mais produção de enzima, como se os padrões de expressão do

gene terapêutico e de resistência estivessem correlacionados, nesse vetor (Pan et al.,

2000).

Nos nossos experimentos, a expressão do IDUA aumentou consideravelmente após

a seleção, corroborando dados prévios da literatura (Pan, 2004). A dúvida remanescente

referia-se à manutenção desses níveis de expressão na completa ausência do agente

seletivo, ou seja, após a seleção ser concluída. Já havia sido demonstrado na literatura que

a remoção do agente seletivo levava à variação nos níveis de expressão do transgene,

alcançando inclusive o silenciamento (Kauffman, 2008). Nós não realizamos uma análise

dose-dependente para a concentração de blasticidina empregada na seleção e para os níveis

de expressão do transgene obtidos, o que poderia nos levar a inferir que concentrações

mais altas desse agente seletivo isolariam os clones mais produtores de enzima (Pan et al.,

2000). Interessante, no momento da seleção das linhagens empacotadoras, nós

empregamos concentrações bastante altas desse antibiótico, o que poderia ter influenciado

na coleta de estoques virais com mais potencialidade para a produção de IDUA. Essa

hipótese não foi testada diretamente, entretanto.

As conclusões finais relacionadas à transdução das CTM indicaram que uma menor

eficiência de transdução foi obtida nessas células do que em NIH 3T3; contudo, após a

seleção, as células geneticamente modificadas apresentaram sustentabilidade de expressão

até ao término do estudo (30 dias) não se detectou nenhuma queda intensa de produção de

para que se pudesse elaborar um protocolo de transdução de CTM MPSI com seleção

rápida e permissiva ao enriquecimento da fração de células geneticamente modificadas em

cultura.

As diferenças percebidas entre as linhagens de CTM normal e MPSI foram

marcantes. Mesmo com mais vetor (e por consequência, MOI maior), o número de clones

isolados no ensaio de transdução em microplaca é menor do que para as CTM normais

transduzidas nas mesmas condições (Figura 3, p. 109). Fatores que estariam dificultando a

transdução dessas células poderiam incluir componentes de matriz extracelular/GAG (Le

Doux et al., 1996; Copreni et al., 2008). Adicionalmente, GAG intracelulares também

poderiam contribuir nesse sentido, dificultando a internalização do vetor e seu acesso até o

núcleo da célula. Não foi testada diretamente uma correlação entre os níveis intracelulares

de GAG e a eficiência de transdução em fibroblastos MPSI, apesar de variações na

expressão do IDUA terem sido detectadas nessas condições (Anson et al., 1992). Fatores

adicionais como funcionalidade das proteínas de citoesqueleto, desequilíbrio nos níveis de

cálcio e de autofagia poderiam atuar sinergisticamente nesse contexto (Settembre et al.,

2008). Assim, processos dependentes de tráfego intracelular deveriam ficar

comprometidos: transdução, produção e secreção de enzima, etc. As vantagens adaptativas

relacionadas à produção da enzima nas células deficientes ficam mais evidentes nesse

contexto.

Devido aos resultados anteriores com CTM normais nos terem mostrado uma

estabilidade de expressão, as CTM MPSI transduzidas foram avaliadas apenas ao término

do experimento (Figura 4, p. 111) – o que nos impediu de avaliar se os repiques nessas

culturas poderiam ter interferido nos níveis de IDUA conforme proposto para CTM

CTM MPSI produziam níveis bastante altos de enzima, mesmo após a seleção, o que era

altamente promissor para a aplicação desses vetores in vivo. Isso excluiu totalmente a

possibilidade de pseudotransdução nessas culturas (Pan et al., 2004).