Terapia gênica ex vivo e in vivo em modelo murino de
mucopolissacaridose do tipo I: potencialidade de vetores
retrovirais aplicados pela via intraventricular
Flávia Helena da Silva
Orientadora: Nance Beyer Nardi (PhD)
Co-orientador: Sang Won Han (PhD)
Porto Alegre, abril de 2009.
Tes e sub metida a o prog ra ma d e
Pós-Gradua çã o em Gen éti ca e Biol o gia
Mol ecula r da UFRGS co mo requis ito parcial p ara a o bten çã o do g rau de Douto r em Ci ên cias .
Est e t rabalho fo i d es env olvi do no Labo ratóri o d e Imu no gen éti ca do Depart am ento d e Genéti ca (UFR GS) e no Labo rató rio de Terapia Gêni ca (C INTERGEN/ UNIF ESP) e co nto u com apoio fi nancei ro d a R ed e d e Terapi a Gênica/ In sti tutos do Mil êni o/MC T, d o Co ns elh o Naci onal d e Desenvol vim ento Ci entí fi co e Tecnol ó gi co (C NPq ), da Fun dação Coordenação d e Ap erfei ço am ent o d e P ess oal em Ní vel Su perio r (CAP ES), da Fund ação de Am p aro à P esq uis a d o Es tad o d o Rio Grand e do Sul (FAP ERGS ) e d a Fu ndação d e Amp aro à Pesq uis a d o Est ado d e S ão P au lo (FAP ESP).
Dedico esse capítulo da minha vida a “
2008 – o ano
fantástico” e a todos seus participantes. Sem o amor de
vocês isso teria sido “bem mais cimento e bem menos grama”.“… you shall ab o ve all thi ngs b e g lad an d youn g/ For if yo u'r e you ng, what ever lif e you wear”
E.E Cummi n gs (Y ou shall all abo ve t hing s b e Glad an d Y oung )
Agradecimentos
Sumário
Li st a d e ab revi atu ras .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... viii Li st a d e fi guras ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... x i Li st a d e t abel as ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... x iii Resum o.. ... .. ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... x vi Abst ract ... ... ... ... .. ... . .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... x viii In t rod ução.. ... ... ... ... . .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... 20
A mu co poli ss acarido se do t ipo I. .. ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... 21 Terapi a gên ica para MPS I: bus cand o alt ern ativ as p ara o
tratam ento em nív el pré-clí nico.. ... .. ... ... . .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... 23 A TG in vi vo e ex vi vo para MPS I. ... ... ... . .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... 30 Obj etiv os. ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... 32 Arti go 1
Injection of mesenchymal stem cells modified with IDUA in adult MPSI mice
brains decreases GAGs deposits and improves exploratory behavior ... ... ... .... .. 3 4
Arti go 2
Ret rovi ral v ecto rs tri lo g y: eval u atin g t ran s gene ex p ressio n an d its effects o n GAGs dep osits aft er in vi vo gene th erap y to treat
mucopol ys acch arid o sis in adult mi ce wi t h H IV, M LV and MS CV
vecto rs ..… …… …… ………… ….. ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... . 71 Dis cuss ão.. ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... 115 Bib lio grafia... ... ... ... . .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... 137 An ex os.. ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .... .. 157
Lista de abreviaturas e termos relevantes
4MU – 4 -meth yl umb ellif er yl
4MU-I – 4-meth ylu mbelli feryl -al pha -L -id uroni de
AAV – v eto r ad en oasso ciado ou ad en oas soci at ed vir us vector
AAV5 -IDUA – ad eno ass oci at ed vecto r sor ot yp e 5 cont ainin g IDUA
trans gene
Ad - ad eno vírus
ADA - ad eno sin a deaminase
BS – bl asti cid in S d eamin as e g en e CFU – colon y for mat ing u nit
CMV – citom egal ovi rus ou cyto mega lo vir us CNS – centr al n er vo us s yst em
CTM - Célul as -tron co m esenq uimais DAL - Do en ças d e acúm ulo l isos som al DS/HS – d er mata n a nd h ep ara n s ulfat e
DME M - Dul becco's Mo difi ed Ea gle's Medi um ERT – enz yme repla cement th era py
Ex vivo – n as célul as -al vo p ara post erio r rei nt rod ução d as m es mas no organi smo al vo
FIV – Felin e Immun odefici ency vir us
GAGs – glicos amin o gl ican os ou glycosa mino gli can s Gen e exó gen o – v er “Trans gen e”
GFP - gr een fl uor es cent prot ein
gfp – gr een fl uor es cent pro tei n g en e
HIV - Hu man Immun odefici ency Viru s
HIV GFP – v et or retrovi ral b as eado em Hu man Immu nod efici en cy Vir us
con tendo o t rans gene gfp ou HIV vector contai ning gf p tr ansg en e
HIV IDUA - v eto r ret ro vi ral b as ead o em Human Immuno d efici en cy Viru s
IDUA – enzim a alfa-L-i duroni dase ou alp ha-L -id uro nida se en zyme
IDUA - gen e da al fa-L-i duroni dase ou alp ha-L -id uro nida se g ene In situ – n o lo cal
In vi vo – no organis mo alvo
IRES - i nternal ri bo soma l entr y sit e iv - int ra venou s
KO – kn ocko ut
KO/ GFP – anim al knocko ut trat ad o com CMT transd uzid as com M LV GFP
ou kno cko ut mice tr eated with ML V GFP trans du ced MSC
KO/ IDUA – anim al kn ocko ut t rat ado com CMT trans duzid as com M LV
IDUA ou kno ckout mice tr eat ed with ML V IDUA tr ansd u ced MSC
LSD – lysos oma l st o rag e di sor ders LTR - lo ng termi nal rep eat es
MLV I DUA – vet or ret ro vi ral basead o n o Mur in e Leukemia Virus co nt end o
o tran s gen e IDUA ou Mu rin e L eu kemi a Vi rus co ntain ing IDUA tran sg en e
MLV – v eto r ret ro viral b as eado no Murin e Leu kemia Vir us ou Mu rin e
Leu kemia Vi rus
MLV GFP – v eto r retrov iral b as ead o no Muri ne L eu kemia Vir us cont en do o
trans gen e gfp ou Mu rine Leu kemia Vir us con taini ng gfp tra ns gen e
MOI – m ultipl ici dad e d e in fecção o u mul tipli city of inf ectio n MPS – M ucopo liss acari dos e ou Mu copol ysacch arid osis
MPSI - Mu co polis sacari dos e I o u Mu co p olys acchari dosi s t yp e I MPSI MS C – mes en ch ymal s tem cells fro m MPS I mi ce
MPSI IIB – M ucopol issacaridos e tipo IIIB
MPS VII - Mu co pol issacaridos e tip o VII o u Mu co pol ysa cch arido sis type
VII
MSC – mesen ch ymal stem cells
MSC IDUA – cél ulas-t ron co mesenqui mais gen eti cam en te m o difi cad as com
o gen e t erap êuti co IDUA o u g eneti c modif ied mesenchymal st em cells expr essi ng th era peut ic gene IDUA
MSCV BS - vet or retrov iral basead o n o Muri ne St em Cell Vi rus co ntendo o
trans gen e bl asti cidi n S dea min as e ou Muri ne S tem Cel l Virus cont ainin g the bla sti cidin S d ea mina se tra nsg en e
MSCV I DUA – vetor retrovi ral b as eado no Mu rin e St em Cel l Vir us
con tendo o t rans gene IDUA o u Mu rin e St em C ell Vi rus con taini ng th e IDUA tra nsg en e
MSCV – v et or ret roviral b as eado no Muri ne St em C ell Virus ou Murin e
Stem C ell Vir us
PBS – pho sph at e b uf fer ed sali ne PCL - pa ckagi ng cel l lin e
PCR - p olymeras e chain rea ction PGK – ph osp hogl icerate kina se RE - R epo sição enzi máti ca
SCID – i mun od efi ci ên ci a s ev era combi n ad a SNC – si st ema n ervo so central
Síndro me d e Hu rl er – form a grave de MPS I, com com prom eti mento
neu rol ó gi co p ro gress ivo
Síndro me de Hu rler-Sch ei e e S ch eie – form as bran d a d e MP S I
Terapia ex vi vo co m CTM I DUA in sit u - terapi a bas ead a n a reint rod ução
de cél ulas-t ro nco mes enq uim ais gen et icament e modi fi cad as cont end o o gen e ex ó geno/t rans gen e IDUA no lo cal des ej ado (ó rgão especí fi co ) do organi smo al vo
TG - terapi a gênica
Trans gen e – gen e ex ó geno trans ferido vi a v et or TU – tra nsd uci ng un it
UI - u nid ad e de in fecção o u u nit o f inf ect ion WT – w ild t ype
Lista de Figuras
Artig o 1
Fi gure 1 (p. 67 )…… ………… …. Molecu lar anal ys is of tran sdu ced MSC and treat ed mice.
Fi gure 2 (p. 69 )…… ………… ... . Elet ro pho reti c p ro files obt ai ned aft er den sitom et r y of GAGs s ampl es anal yz ed thro u gh elect ro pho resis
Artig o 2
Fi gure 1 (p. 105 )… … ………… … Effi cienc y o f t rans d ucti on o f co ncen trat ed MSCV v ecto r i n NIH 3T3 cell s
Fi gure 2 (p. 107 ). ... ... .... ... ... ... .. Val id ation o f con cen trated MSCV b at ch es in N IH 3 T3 cells ( IDUA activ it y)
Fi gure 3 (p. 109 ). ... ... .... ... ... ... .. Effi cienc y o f t rans d ucti on o f co ncen trat ed MSCV v ect ors in M SC from normal mi ce (IDUA +/+) (left ) an d MPS I MSC (IDUA -/-) (ri ght )
Fi gure 4 (p. 111 ). ... ... .... ... ... ... .. Val id ation o f con cen trated MSCV b at ch es in MSC cells ( IDUA activit y)
Fi gure 5 (p. 113 ). ... ... .... ... ... ... .. IDUA and GAG ev al uati on in b rain tiss u e from i n sit u in ject ed mice.
Anexos
Fi gura I (p .16 3)…… ………… … Diagram a esqu em át ico d a hi pót es e d e ad equ ação do tip o de terapi a gêni ca à fas e da patolo gi a
Fi gura II (p. 164 ). ... .. .... ... ... ... ... Im agens rep resent ativas do s esto qu es con cent rado s HIV IDUA e P LL 3 .7 em micros co pia d e flu ores cência.
Lista de Tabelas
Introdu ção
Tab el a 1 (p. 24 )…… ………… .. Compil ação de proto colo s in vi vo de terapia gêni ca p ara MPS I
Tab el a 2 (p. 26 )…… ………… .. Méto do emp regado para aval iação d e GAGs em proto col o s in vi vo d e t erapi a gên ica para MPS I
Artig o 1
Tab le 1 (p .60 )… …… ………… . Trans du ctio n effi ci en c y an d gen e ex pressi on an al ys is of MPS I MSC an d NIH 3 T3 cells wi th M LV- IDUA and M LV-GFP v ecto rs
Tab le 2 (p .61 )… …… ………. ... Pre t ri al b eh avi oral ev alu atio n o f wil d t yp e (WT) and kno cko ut (KO) mi ce in open fi eld
Tab le 3 (p .62 )… …… ………. ... . Pre trial b eh avi oral eval uati on of wi ld t yp e (WT) and kn ockout (KO) mi ce i n elev ated
zero m aze
Tab le 4 (p .63 )… …… ………… . Post t ri al behavio ral eval uation o f wil d t yp e (WT), kno ck out (KO), kn ocko ut mice inj ected wit h M LV-GFP -t ransd uced MPS I MSC (KO/ GFP) an d kn ockout mi ce inject ed wi th M LV- IDUA-tran sdu ced MPS I MSC (KO/ IDUA)
Tab le 5 (p .65 )… …… .……… … Post t ri al behavio ral eval uation o f wil d t yp e (WT), kno ck out (KO), kn ocko ut mice inj ected wit h M LV-GFP -t ransd uced MPS I MSC (KO/ GFP) an d kn ockout mi ce inject ed wi th M LV- IDUA-tran sdu ced MPS I MSC (KO/ IDUA)
Artig o 2
Tab le 1 (p .10 3)…… ………… .. Titers and effi ciency o f trans du ctio n o f con cent rat ed HIV an d M LV vecto rs
Tab le 2 (p .10 4)…… ………… .. Titers obt ain ed fro m fo ur con centrat ed bat ch es o f MSC V vecto rs in N IH 3T3 cells after selecti on with bl asti cidi n
Anexos
Tab el a I (p .15 8)…… ………… . Resum o d as caract erísticas prin cip ais do s vet ores vi rais em pregado s na t erap ia gên ica
gên ica para MPS I
Tab el a III (p.1 60 )… …... .…… ... Compil ação d e p roto colo s d e t erapi a gên ica em mo d elo murino p ara DAL env olv en do o v eto r MSCV
Tab el a IV (p. 161 ). . ………… …. Dados repres ent at ivos referent es à vali dação dos est oqu es co ncen trad o s (b as eados em H IV)
Tab el a V (p .16 2)…. ….…… …… Compil ação de p rot oco los d e do sagem de GAGs em mod elo ani mal d e MPS I, agrup ad os p or ti po de m etod olo gia e cap aci dade d e disti nção entre fenó tip o norm al e afet ado
Resumo
A mu co polis sacarid ose tipo I (MPS I) é um a do en ça mono gêni ca
aut ossôm ica reces si va, d evid o a mut ações no gene d a alfa-L-idu ro nid as e
(IDUA). S eu carát er sind rômi co comp ro met e to das as fun ções vit ais d o
organi smo , in clusi ve a n eu ro co gni ção. Atu alm ent e, com o fo rm as
dispo nív eis d e t rat am ento ex ist em ap en as os t rans plant es d e m edu la
óss ea/ célul a tron co hematop oiética e a repo sição enzim ática (RE). Os
transp lantes d ep en d em da di spo nibili dade dos do ad ores e d a id ad e em qu e o
diagnós tico é comp rovado. A RE é um pro cedim en to seman al e contí nuo
por t od a a vid a do paci ent e, i nv asiv o e d e alto cu sto. Ess e m elho ra
con sid eravelm ente as do en ças vis ceral e arti cul ar/ós sea; co ntu do, n ão
ap resent a o mesm o efeit o sob re a neuro pat olo gi a, p rin ci pal ment e n a fase
mais avançad a. No p resente t rabal h o, célul as -tron co mes enq uim ais
transd uzid as com o vet or M LV con tendo o t rans gen e IDUA foram i njetadas
intrav ent ri cul arm ent e no céreb ro de camundo n go s MPS I adulto s de du as
faix as et ári as (12 e 25 semanas). O estu do fo i co ncluíd o qu ando os anim ai s
atin giram 2 0 e 29 s eman as, resp ectiv am ente. Ess a met odo lo gi a resul tou n a
diminui ção dos n ív eis d e GAGs acum ulados n o cérebro dos anim ais
afet ad os. Tend ên ci a de m elh ora l ocomot ora foi d et ectada, at ravés d e t est e
de camp o ab erto d e ex posi ção úni ca, m esmo n os anim ais t ratad os em fas e
mais av an çad a d a neu ro patolo gi a. A q ued a d e ex pres são do trans gen e,
obs ervada com freq uên ci a n est e ti po d e abo rd agem, pod e ter sid o um
durad ou ra. Bas eand o-s e ness a ex peri ên ci a, nós d es env olv emos u m n ovo
vet or ret rovi ral (MS CV IDUA) para s er avali ad o in vitro com ferram enta d e
trans ferên ci a gêni ca p ara célul as -t ro nco mesenqui mai s. Ess e v eto r
prom ov eu ex pres são sust ent áv el do t rans gen e e rapi d ez d e s el eção d as
célul as gen eti camente mo dificad as , v ia resis tênci a à b lasti ci din a. A
admi nist ração in vi vo d ess e v eto r, at rav és d e inj eção in trav ent ricul ar
bilat eral no céreb ro de cam und on gos MP S I j ov ens , levou à p rod ução l ocal
de ní vei s det ect áv ei s de IDUA ao térmi no do ex p erimento (30 di as). Ess e
estu do i n vi vo d e terapi a gêni ca (TG) p ara m ucopo liss acari dos e d o tip o I
muri na t am bém avali ou a pot en ci alid ade de o ut ros d ois vet ores vi rais (H IV
e M LV), nes sas mes mas cond ições ex periment ai s. O v eto r baseado em H IV
tamb ém foi capaz d e prom ov er a ex p ress ão in si tu d a enzima, enq uanto q ue
o M LV n ão . Red ução no co nt eúd o total de GAGs ex traíd os do céreb ro d os
anim ais foi d et ect ad a ap en as p ara o s gru pos trat ad os co m os vet ores MSC V
e H IV. In tens a red u ção n a p rop orção d e dermatan/h ep aran s ulfato n es sas
amos tras tamb ém foi detect ad a. Con cl uin do, o vet or MSC V m ostrou -s e u ma
boa ferram enta d e t rans ferên ci a gênica in vitr o e in vi vo , favo recendo a
pro du ção in situ d a enzim a d e form a sustent áv el, o q ue é alt am ent e
des ej áv el n a realiz ação de TG i n vi vo. Devido à p ossi bilid ade d e s el eção
rápid a d as célul as gen eti camente modi fi cad as após a t ransd ução com ess e
vet or, a realiz ação d e u m n ovo p roto co lo pré clí ni co de TG ex vi vo basead a
em célul as -t ron co m es enq uim ais oriun das d ess e mod elo mu rino de MPS I
Abstract
Mucopol ys accharid o sis t yp e I (MPS I) is an autos om al recess i ve dis eas e du e
to mut ati ons in t he al ph a- L-idu ro ni das e gen e (IDUA). MPS I is a
multis ys t emic di so rder, in whi ch all vital fun cti ons are comp romis ed,
incl udin g n eu ro co gn ition. C urrentl y, th e onl y two opti ons of treatm ent
av ail abl e are bo ne marro w/h em ato po et ic st em cell t ransp lant ati on and
enz ym e repl acem ent th erap y (ERT). Transpl ant ati ons dep end o n
av ail abili t y o f comp atibl e d ono rs an d th e age at d iagno sis. ER is a weekl y
and li fe-tim e p ro ced ure, inv asi ve and a hi gh cost treatm ent . It am elio rat es
visceral and join t /bon e d is eas es , h owev er, th e sam e effect o n
neu ro pathol o g y is n ot achiev ed, mainl y in m ost adv an ced stages o f t he
diseas e. M es en ch ym al st em cells t ransd uced wi th M LV vector cont ain in g
the IDUA t rans gen e were in ject ed int raven tri cul arl y in th e brain o f MPS I
adu lt mi ce (1 2 and 2 5 weeks ). Th e stu d y was con clu ded when anim als were
20 and 29 weeks ol d , resp ectiv el y. Thi s prot ocol res ult ed in a red uct ion of
GAGs accumu lat ed in the b rain. Lo com otion imp ro vement was obs erved
thro u gh o pen field anal ys is, ev en in ani mals treat ed at adv anced st ages of
neu ro pathol o g y. The decreas e of trans gene ex pres sion , whi ch is frequ entl y
obs erved in this t yp e o f app ro ach , m a y hav e rest rain ed t he mech anism o f
cross -co rrectio n. Based o n that , we d evel op ed a n ew ret roviral v ecto r
(MSCV IDUA) to be anal yzed in vitro as a gen e t ransfer to ol t o
of th e t rans gen e and en abled a fast selection of gen eti call y modi fied cells
thro u gh bl asti cidi n resist ance. In vi vo ad minist ration of t he v ecto r, th ro u gh
bilat eral int ravent ricular inj ectio n in th e brain o f yo un g MPS I mice, led to
the produ cti on of det ectabl e lo cal l ev els of IDUA 3 0 d a ys aft er th e
pro cedu re. This in vivo stud y of gen e th erap y fo r mu ri ne MPS I als o
ev alu at ed th e pot ent i alit y o f two oth er vi ral v ecto rs (H IV and M LV), at th e
sam e ex perim ent al conditi ons . H IV b as ed v ect or was also ab le to ind uce i n
situ produ cti on of t he enz yme, whil st M LV was not . A reduction o f t otal
GAGs ex tracted fro m mi ce b rai ns was det ected onl y in th e group s t reat ed
with MSC V and HIV, as well as an int ens e redu ctio n of dermatan/h ep aran
sulfat e propo rti on. Therefore, MSC V v ecto r was s hown t o be an effi ci ent
gen e tran sfer t ool in vitro and in vi vo, en abli n g i n sit u su stain abl e
pro du ctio n o f th e enz ym e, which is hi ghl y desirab le fo r in vi vo gen e
therap y. Du e to th e possibil it y o f fast sel ection o f gen eti call y mo dified
cells after t rans du ct ion with t his vect or, the accom plish ment of a new ex
vi vo p re clini cal gen e th erap y protocol based on mesenchymal stem cells from the
“Certa inl y, an imp or tant t heme t hat recu r red thr oug hou t th e meeting was a nal ysis of th e chromoso mal int eg rat ion s ites of g en e t ran sfer vecto rs. The qu esti on of h ow rand om is r et ro viral integrati on has b een addr ess ed numer ous times in pr ior years , b ut w e ar e learni ng t hat th e a n swer d ep end s on wh at t he mea ning of “h ow r and om is” is. N ew tech niq ues f or in tegrati on site r ecover y and g enomi c ana lysis ar e p rodu cin g a w ealth of info rma tion on in tegrati on patt er ns of r etro vi ral, lent ivir al a nd AAV-bas ed vecto rs, as well as t ran spos ons . We ar e l earni ng abo ut th e rel ati ve fr eq uency o f vect or integrati on, th e ca tegor y of pr ef err ed int egr atio n sit es an d t h e i ntera ctio ns betw een genetic elements of th e vect or an d ju xta pos ed cell ular sequ en ces. Und ers tan ding th es e prop erti es of each s p ecifi c g en e t ran sfer vect or s hou ld allow mor e info rmed est ima tion s of th eir rela tive ris ks and b enefit s in clini ca l a ppli cati ons .”
Don B. Ko hn (Gen e Ther ap y:Br eadt h and vi gor, 20 03 ).
Introdução
Introdução
A mu copolis sa ca rid ose do tipo I
A perd a d a fun ção l isoss omal para o m etab olismo celul ar o casio na o
acúmul o d e gli cos amino gli can os (GAGs ), o q ue caract eriz a as d oenças d e
acúmul o liso ssom al (DAL). O tipo de GAGs acumu lado em deco rrên ci a d a
perd a p arcial o u to tal da fun ção d e u ma enzim a l isos sôm ica esp ecífica
det ermin a um tip o esp ecí fico d e DA L. Assim, a mu co poli ssacari dos e d o
tipo I (MPS I) é um a DAL deco rrent e da perd a d e fun ção d a enzima
alfa-L-iduroni dase (IDUA), lev and o ao acúm ulo de d erm at an e h ep aran sul fato. É
uma do en ça m ono gênica reces siv a, cuj a freqü ên ci a estim ada é d e 1: 100 .00 0
nas cid os viv os (Neu fel d an d M uenzer, 2 001 ). Devi do à su a vari abili dade
clíni ca, à p ro gress ão e à idade d a manifestação de al gu ns sint omas , a MPS I
é atu alm ent e clas si ficad a em du as fo rm as: a form a grav e (Síndrom e d e
Hu rler) e a fo rm a at enu ad a (Sín drome d e Hu rler-Scheie e S ch ei e) (M uenzer
et al., 20 09 ).
Os paci ent es MPS I, de um a fo rm a geral, apres ent am espl eno megali a,
disost os es, m al fu n cio nam en to cardi orrespi rató rio , ent re o utro s sin tom as
(Neu feld an d Mu enz er, 2 001 ). A fo rm a aten uada d e MPS I apres ent a im en sa
vari abili dade em termos d e p erda d e fun ção neuroló gica, morbid ad e e
outros sint om as. A form a grav e (Sí nd ro me de Hu rler) é as si m clas sificad a
dev ido ao s eu int en s o comp rom etim en to neu rol ó gi co , q ue o corre d e fo rm a
pro gres siv a e l ev a à mort e ai nd a n a in fân ci a. Doi s ti pos d e t ratam ento est ão
célul as t ron co h em ato poi éti cas) são li mitad os p el os po u cos do ado res
com patí v eis, p el a al ta mortal id ad e e p el o alto custo d o pro cedim ent o. A
segund a alt ern ativ a é a repo sição enzim ática (RE), b ast ant e efet iv a p ara as
doenças vis ceral e articul ar/ós sea, o qu e con tri bui p ara a qu al idade d e vi d a
do paci ent e. Nem o transpl ante n em a repo sição enzim ática, contu do ,
evit am o p ro cess o neu ro degen erativ o (Pond er and Haskin s , 2007 ). S e a
terapia con venci on al é ini ci ad a cedo , po rt anto , el a p od e retard ar a
mani fest ação d os s intom as d a p ato lo gia, mas não d a n euro pat olo gia.
In fel izmen te, o di agnósti co p ara MPS I através d e tri agem neo natal aind a
não é ro tin a e a m ai ori a d as cri an ças afetad as é diagno sti cad a tardi am ent e
(Pon der and Haski n s, 20 07 ). É impo rt ante l em brar qu e ap rox imad am ent e
50-80 % d ess es p aci entes apres ent am a fo rma grave d a d oença (Mu enz er et
al., 20 09 ); con seqü entem ent e, h á necess i dad e urgent e d e bus ca p or no vas
alt ernat iv as t erap êut icas p ara ess a p atol o gi a, volt ad as esp eci alment e p ara o
céreb ro. Um est udo de caso foi pub li cado recent em ent e sob re RE vi a
injeção i ntrat ecal po r p un ção lum bar (M unoz-R oj as et a l., 2 008 ); cont ud o,
a RE s egui ri a s end o um proced imento sem an al d e alt o custo (P ast ores ,
2008 ), o qu e refo rça ai nd a mai s es sa n eces sid ad e. Baseand o-se n a
introdu ção feit a aci ma p ara a fisio patol o gi a da MPS I, fi ca evi dente q ue o
tratam ento do sist em a nerv oso cen tral p recis a ser um a pri ori dade. A t erapia
gên ica (TG), qu e s e b as ei a na t ransferên ci a d e gen es t erapêu ticos para
Terapia g êni ca pa ra MPSI : buscando al terna tiv as pa ra o trata mento em nível pré-cl ínico
A ex press ão in situ do gene IDUA atrav és d a trans ferên ci a gên ica in
vi vo ou ex vivo po derá t raz er um gran de b en efíci o clí nico , mesmo q ue
ap en as u ma pequ ena p opu lação d e célul as lo cais sej a modi ficad a
gen eti cam ent e. Iss o porqu e a enzim a IDUA s ecret ad a pel as célul as
modi ficad as geneticam ent e é capt ad a p or cél ul as vizin has, através de um
pro cess o con h eci do por correção cruzada – m esm o m ecanism o ex plorad o n a
reposi ção enzimát ica ou nos transpl ant es . A capt ação d a enzima é realizad a
através d e um pro cess o medi ado po r recepto res d e m ano s e-6-fo sfato . É
impo rtant e ress alt ar que a ati vid ad e d a IDUA ocorre ap en as em pH ácido , o
que t amb ém co ntri b ui para qu e a ativ i dad e d a enzim a est ej a rest rit a ao
lisoss omo. Ess e é o dest ino fin al d a tran slocação d a IDUA após a capt ação
via recepto r (Neu fel d and Mu enz er, 20 01 ).
Os estu dos de TG para MPS I têm sid o realizados com d iferent es
mod elos anim ais (cão, camun don go ou g ato ), tran s gen es sel ecio nados (gene
repó rt er ou t erap êu t ico ), vet or em pregado (viral ou n ão viral) e desenho
Tabel a 1: C ompil ação de protocolos in vi vo de t erapi a gêni ca para MPS I
Referência Vetor Transgene Modelo animal Especificação Tempo de análise Via de administração Benefício clínico
Shull & Lu, 1996 retro MLV cDNA canino canino adulto infusão de céls transduzidas não (RI) Lutzko et al ., 1999 retro MLV cDNA canino canino adulto infusão de céls transduzidas não Lutzko et al ., 1999 retro MLV cDNA canino canino prenatal - intrauterina injeção intravenosa de céls transduzidas não Hartung et al. , 2004 AAV cDNA humano murino neonatal 5 meses depois injeção intravenosa (veia temporal) sim (total) Camassola et al ., 2005 plasmidial cDNA humano murino adulto injeção hidrodinâmica sim (cérebro também) Di Domenico et al ., 2005 lenti HIV cDNA humano murino adulto 1 e 6 meses depois injeção intravenosa (veia caudal) sim (fígado, baço; RI tardia)
Kobayashi et al ., 2005 lenti HIV cDNA humano murino neonatal e adulto 20 semanas de idade injeção intravenosa (veia temporal e caudal) sim (parcial) Liu et al ., 2005 retro MLV cDNA canino murino neonatal 8 meses depois injeção intravenosa (veia temporal) sim (total) Ciron et al ., 2006 AAV cDNA canino canino adulto 3, 5, 7 meses depois injeção intratecal não (RI) Di Domenico et al ., 2006 lenti HIV cDNA humano murino adulto 6 meses depois injeção intravenosa (veia caudal) sim (fígado, baço; RI tardia)
Ponder et al ., 2006 retro MLV cDNA canino felino neonatal 3 meses depois injeção intravenosa (veia temporal) sim (parcial) Watson et al , 2006 AAV cDNA humano murino adulto 6-10 semanas depois injeção intratecal sim (parcial) Aranovich et al ., 2007 transposon SB cDNA humano murino adulto injeção hidrodinâmica não (RI)
Chung et al ., 2007 retro MLV cDNA canino murino neonatal 8 meses depois injeção intravenosa (veia temporal) sim (na alta dose do vetor) Ma et al. , 2007 retro MLV cDNA canino murino adulto 8 meses depois injeção intravenosa sim (imunomodulação) Traas et al., 2007 retro MLV cDNA canino canino neonatal 1 ano, aprox. injeção intravenosa sim (total) Herati et al. , 2008 retro MLV cDNA canino murino adulto 6.5 meses depois injeção intravenosa sim (menos aorta)
As referênci as assinaladas referem-se aos prot ocolos ex vi vo ou in vi vo envolvendo vetores não-vi rais. Legenda: retro – ret rovetor; M LV – Murine L eukemi a Vi rus; AAV – Adenoass ociat ed Vir us; lenti – lenti vetor; HIV – Human
A maioria dess es trab alho s focou n a admi nist ração i ntrav eno sa,
repres ent ando a mesma rot a d e ad mini stração at ualm ente emp regad a n a
terapia d e respos ição enzim áti ca. P ro tocolos d e t rans ferên ci a gêni ca
intrav en os a em fas e neo natal resu ltaram em p ro du ção d e n ív eis de enzim a
det ectáv eis n o cérebro de camu ndo n gos M PS I, com co rreção d a m aio ria dos
sintom as d a d o en ça (Li u et al. , 2 005 ; Chun g et al. , 2 0 07). Inj eçõ es
sistêmicas d e v et ores pl asmi di ais, lenti vi rai s ou ret rovirai s com
imuno ssup ress ores em anim ais adul t os tam bém produ ziram nív eis
det ectáv eis d e enzima n o céreb ro, co m diferent es t ax as de redu ção de
GAGs to tai s (Cam assol a et al ., 2 005; Di Dom eni co et al., 200 5; Di
Dom eni co et al ., 2 006; M a et al ., 2 00 7; Herati et al ., 2 00 8). Um estu do
com parativ o p ara fase d e admi nist ração do v eto r m ost rou q ue a co rreção
met aból ica d a do en ça foi at in gi da ap en as p ara o grupo d e camu ndo n go s
neo natos t ratados (Ko ba yas hi et a l., 20 05 ). Co rreção met ab ólica,
cran io faci al e n eu ro l ó gi ca foi rep ortada em um prot ocolo d e administ ração
intrav en os a d e veto r AAV em fas e n eo nat al (Hartu n g et al. , 2 0 04).
Terapi a gêni ca in si tu volt ad a ao si stem a nerv oso central em model o
anim al de MPS I foi po uco ex plo rada. Para cães MPS I as inj eçõ es
intracereb rais fo ram combi nadas a u m regi me d e imun ossu press ão –
inefi cient e p ara evi tar a en cefalit e s ub agu da (C iron et al ., 2 006 ). Em
mod elo mu rin o ad u lto, a admi nist ração intrat ecal l ev ou a redu ção d a
pat olo gi a v acuo lar q uan do alt as do ses de veto r AAV fo ram empregad as – o
Como o acúmul o d e GAGs é a con sequ ênci a p rim ári a d a d oença, s ua
dos agem t raz in fo rm ação rel ev ant e ap ós a in terv en ção t erap êutica. Po r iss o
os trab alh os acim a cit ado s bus caram q uan tifi car de al gum a form a ess es
GAGs t ot ais. En tret ant o, é m uito imp ort ant e l em brar q ue os GAGs d e u m
tecido po dem s er co mpost os p or v ári os tipos , e no cas o d a MPS I o co rre
acúmul o esp ecí fico de d erm at an e hep aran s ulfat o n o s liso ssom os.
Histo ri cament e, ess a redu ção d e GAGs tot ais t em sid o quanti ficada
bioqu ími ca ou hi stol o gi cam en te, po r m ét odo colo rim ét ri co o u por co ntagem
de v acúolo s o ri und o s do s d ep ósit os (Tabel a 2). Nenhum a d ess as técnicas ,
con tud o, dis crimi na esp eci ficam ent e o t eor d e d ermat an e h eparan sul fato
acumul ad os d os d emais GAGs caract erísti co s do t ecid o em an ális e. A
con tagem d e v acúol o s é uma m edi da relacio nada aos d ep ósito s lisoss omais
de GAGs e, po rt ant o, u ma m edid a rel acion ad a aos GAGs acumul ado s em
cad a tip o d e MPS.
Tab el a 2: M étod o em pregado p ara av ali ação d e GAGs em p rot oco los i n
vi vo de terapi a gêni ca p ara MPS I
Referência Vetor Modelo animal Fase
colorimetria histologia
Hartung et al ., 2004 AAV murino neonatal X Camassola et al ., 2005 plasmidial murino adulto X
Di Domenico et al ., 2005 lenti HIV murino adulto X
Kobayashi et al ., 2005 lenti HIV murino neonatal e adulto X Liu et al. , 2005 retro MLV murino neonatal X Chung et al ., 2007 retro MLV murino neonatal X X
Ciron et al ., 2006 AAV canino adulto X Di Domenico et al ., 2006 lenti HIV murino adulto X
Watson et al ., 2006 AAV murino adulto X Ma et al ., 2007 retro MLV murino adulto X X Traas et al ., 2007 retro MLV canino neonatal X X Herati et al ., 2008 retro MLV murino adulto X
A respo st a imun e parece ser um out ro obs tácul o na b usca po r
tratam entos altern at ivos p ara MPS I. P ara o mo del o canin o de MPS I, a
respo sta imun e co nt ra a proteí n a ex ó gena e/o u as cél ulas gen eti cam ent e
modi ficad as bloq ueo u a correção cruz ad a (Shull et al ., 19 96; Lu tzko et al .,
1999 a). Qu and o um prot ocolo s imil ar b aseado no v eto r Sl eep in g Beau t y foi
realiz ado , a p rod ução e man ut en ção da enzima du rant e 6 mes es foi ati n gid a
soment e com o uso de im uno ssu press or. Ness as con dições, apen as o fí gado
ap resento u redu ção de GAGs tot ais depo sit ados , e o s hep ató cit os
ap resent aram si nai s cl aros d e ap opt os e 1 0-1 4 di as após a ad minist ração d o
vet or, como cons eq üên ci a de res post a infl am at óri a (Aro n ovi ch et al.,
2007 ). Foi prop osto qu e o mo delo felin o é capaz d e mo nt ar um a pot en te
respo sta imun e co nt ra o v eto r M LV em pregado no proto col o de terapi a
gên ica em fas e neon at al (Pon der et al. , 2 006 ). É im po rt ant e ress alt ar q ue o
trans gen e in troduzid o no v eto r referi a-s e ao IDUA cani no. Fin alm en te, a
imunom odu lação favoreceu a t erapi a gêni ca vi a veto r M LV em mo d elo
muri no ad ulto d e MP S I (M a et a l., 20 07 ).
Coleti v ament e, ess as in fo rmaçõ es no s mostram qu e m odi fi cações no
desi gn do est udo , alterando v ari áv eis como tipo e qu anti d ad e do v eto r
admi nist rado ou id ade do anim al s el ecio nad o p ara realiz ação do proto col o,
pod em con tri bui r p ara a eficáci a d o t rat am en to. P ro cu ran do av ali ar a
efi ci ên ci a de um p roto co lo de terapi a gênica b aseado em veto r vi ral,
camun don gos MPS I fo ram trat ad os em fase n eon at al e adult a. Nív eis
sup eri ores d e enzim a circul an te e ex pres s ão su stent áv el do t rans gen e fo ram
et al. , 2005 ). Iss o est á de acordo com a tend ên ci a at u al de ant eci par o
diagnós tico p ara fav orecer a i nterv en ção preco ce (Karol ews k i an d Wol fe,
2006 ); co ntu do, a maio ri a d os diagnó sticos, ai nd a é fei t a t ardi am ent e
(Pon der an d Haskin s , 20 07 ).
Uma vez q ue as terapias at uai s n ão são capaz es d e evit ar a
neu ro patolo gi a, seri a im po rt ant e av ali ar a pot enci ali dade d e um proto col o
in situ de t erap ia gêni ca vi sando redução d e GAGs , rest au ração d a
ativi dad e da IDUA e mel ho ra l ocomot o ra e co gni tiv a. Estu dos ant eri ores
são mo stram qu e n em todos ess es as pect os são av ali ado s ap ó s TG em ní vel
pré-clí nico. Inj eção neon at al d e vet ores adeno -asso ci ado s em m od elo de
MPSVII res ulto u em nívei s det ect áv eis d e enzim a no céreb ro (Pass ini and
Wolfe, 200 1). C am undo n go s adul tos MPS I t ratados , t am bém em fas e
neo natal com do ses meno res dess e mesmo tipo d e v eto r, apres ent aram
redu ção parcial d os dep ósit os de GAGs e n ív eis detect áv eis de enzima no
céreb ro (W atso n et a l., 200 6). Em um mo del o canin o d e MSP I, ess a m esm a
abo rd agem res ultou em redu ção su bst an ci al d e GAGs n o cérebro d os
anim ais , m as m esm o com a admini stração d e um imun o ssup resso r a
respo sta imu ne gerada cont ra o v et or e cont ra a p roteí na IDUA
des en cad earam encefal ite su bagud a no s an imais (Ci ron et al. , 2 006 ).
Nenhum dess es estu dos, ent ret anto , aval iou a fu nção lo como tora/ co gnitiv a
dos ani mai s apó s a TG.
Ess e cenário most ra que o p rot ocolo de TG vo ltado ao cérebro precis a
atin gir nív eis l ocai s de enzim a su fi ci ent es p ara reduzi r GAGs d ep osit ado s
interv en ção n ão m u ito agressi v a, d e p referên cia úni ca e s em o casio nar
efeit os col at erais i n des ej áv eis . Al ém di s so, é de fu nd am ent al impo rtância
que a av ali ação d a fu nção lo co moto ra/ co gnitiv a faça p arte das an ális es
post erio res à int erv enção t erap êuti ca v olt ad a ao céreb ro – em nív el clín ico
e p ré-clí nico. J á ex i ste rel ato de apli cação clí nica d e TG v iral v olt ad a ao
céreb ro d e dez crian ças com li po fus cin ose com m elho ra d e fun ção
neu rol ó gi ca; i nfeliz ment e, al gum as reaçõ es ad vers as foram rel atadas
(Worgall et a l., 20 08 ).
Para o s p aci en tes MPS I d e qu al qu er t ipo, a fun ção n eu ro co gnitiv a
pod e v ariar eno rm ement e, e ess e p arâmet ro av ali ativ o é incl uído no
al gorit mo d e es col h a de t ratamento p ro posto , em conj unt o com a id ad e
(Mu enz er et al ., 2 00 9). O obj eti vo d es se al gorit mo é aux ili ar na s el eção d e
uma abo rd agem t erapêu tica q ue co ntri bu a d e fo rm a m ais con sistent e p ara a
at enu ação d a n eu ro pat olo gi a, al ém da doença sist êmi ca. Em nív el p
ré-clíni co , p ou cos trab alhos av ali an do a fun ção co gnitiv a ap ós a ex ecu ção d e
um p rot ocolo in vi vo d e TG p ara DAL fo ram realiz ado s, a maio ri a del es
volt ado s para o cérebro de camun don gos adult os em d iferen tes faix as
et ári as d e o ut ros tip os d e DAL (C ress an t et al ., 200 4; Liu et al. , 2 005; Fu
et al., 20 07 ). Um es tudo compo rt am ent al pós t erapi a gêni ca volt ad o p ara
MPS I foi realiz ado com camun don gos trat ado s em fas e n eon at al e com
redu ção do s GAGs (por co ntagem d e vacúolos ) (Hartun g et a l., 20 04 ). Os
aut ores rel at aram melho ra si gni fi cativ a da fun ção co gnitiv a.
In t eres sant ement e, j á ex istem relat os na lit eratu ra com prov ando qu e es ses
(Reolo n et al. , 20 06; Pan et al ., 2 008 ). Essas janelas d e d éfi cit, no m od elo
muri no, s ão d e ex trema impo rt ân ci a, um a vez qu e el as po deri am mim etizar
os diferent es nív eis de comp rom etim en to ment al ev id en ciados nos paci ent es
MPS I, simu lando al gum as s itu açõ es des cri tas n o al gori tmo de trat am ento .
Em co nclus ão , a TG para MPS I em m odelo anim ais t em sido ex plorad a
através do em prego de v eto res vi rais e n ão-virais e m uitas qu es tõ es
rel acio nad as ao d esi gn d o v eto r, a su a vi a d e ad minis tração, a p ro du ção d a
enzim a ex ó gen a nas cél ul as al vo e as cons eqü ên cias dessa rep osi ção
perm an ecem em ab ert o (p ara u ma rev isão sob re os mes mos cons ult ar
Pond er and Haski ns, 2007 ).
A T G in vivo e ex vi vo p ara MPSI
A TG p ara MPS I bu sca a rest auração da ativid ad e d e IDUA, mesmo
que p arci alm ent e. Fo i propo sto qu e um n í vel resi du al (1 -5 % em rel ação ao
norm al ) p od eri a faz er um a tran sição d e fen ótip o: d e form a grave para
brand a – ou d a fo rma neurop áti ca p ara a n ão -n eu rop áti ca. Ess e p ro cess o
seria depend ent e d e uma no va t ecno lo gia vol tada esp eci ficam ent e p ara o
sistema nerv oso cent ral ( Io ann ou 2 000 ; Ioan nou et al., 200 3). Trat am ent os
sistêmicos p ara M PS I n ão con segu em at in gi r o céreb ro, con fo rm e
men cio nado ant erio rment e. A rup tu ra de barrei ra h em ato en cefáli ca n ão é
reco mend áv el a cad a RE (Bos ch et a l., 2 000 ). Assim s en do, de fat o um a
nov a alt ernativ a t erapêu tica faz-s e n ecess ári a p ara a clí nica.
A TG t em sid o pro post a como um a terapi a al tern ati va p ara a MPS I
(Pon der and Haski ns , 200 7). A TG ex vi vo em n ív el clíni co v oltada a o utro
hem ato poi éti cas h u man as e p ost erio r rein fus ão d as m esm as ao p aci ente
(Ch en g an d Smith, 2 003 ). Es se estu do mo stra qu e a apli cação da TG ex vi vo
para DAL po de s er um a alt ern ati v a cl ínica factív el, consi derando -s e a
exp ertis e acum ul ad a com os p rot ocolos para im uno defi ci ên ci a co mbin ad a
(SC ID) e gen otox ici dad e d e t rans ferên ci a gênica em cél ulas pro genit oras
(Hav en ga et al ., 1 99 7; Bus hm an, 200 7). Out ra p rop ost a s eria a com bin ação
de p rot ocolos – sist êmi co e in situ – p ara obt en ção d e correção glo bal ou
parcial da pat olo gia. É poss ív el qu e ess a nov a terapi a p oss a ser som ad a às
con ven cion ais , pro mov end o uma at en uação d a do en ça n eu roló gi ca em
con co mit ân cia à do en ça sist êmi ca. Tem-s e dis cut ido d e fo rma pou co
intens a, ain da, os b en efíci os q ue po deriam s er ob tido s atrav és d e uma
pro post a d ess e tipo . Para tan to, é necessário q ue n ov as ferram ent as d e
trans ferên ci a gêni ca efici en tes p ara as célul as do si st ema nervo so central
sej am d es env olvi das e bem caracteriz ad as. M ais um a v ez a pesq uis a
Objeti vos
O p resent e p roj et o d e p esq uis a t eve po r ob jeti vo geral o
est ab el ecimento d e prot ocolo s de terap ia gêni ca ex vivo e in vi vo em
mod elo mu rino d e Mucopol iss acarid os e do tip o I (MPS I) em pregan do
vet ores ret rovi rais. Os o bj etiv os esp ecí fi cos comp reend eram:
Terapia g ênica ex vi vo:
• Trans du ção de célul as -tron co mesen quim ais o riun d as de camun don gos MPS I com v eto r b as eado em M LV (Ví ru s d a Leu cemia
Muri na – Mol on ey Leu kemia Vi rus ) co ntendo o t rans gen e IDUA e
av ali ação dos nív eis enzim áti co s obt i dos apó s a t rans fo rmação
gen éti ca.
• In j eção d as cél ulas transd uzid as at rav és da vi a int raventricular em camun don gos MPS I de d uas faix as et ári as (12 e 25 sem an as ), com o
intuito de av ali ar a efi ci ên ci a do p ro to col o para fas es di st intas da
neu ro patolo gi a já es tab el ecid a, at rav és d a co rrel ação d e parâmet ros
bioqu ími cos e compo rtament ais.
Terapia g ênica in vi vo
• Const ru ção d e um n ovo v eto r retrovi ral bas eado no MSC V (Vírus d a Célul a Tro nco Mu rin a – Murin e St em C el l Virus ) como ferram ent a d e
trans ferên ci a gêni ca mais ad equ ad a às células pro genito ras e/ ou com
• In t rod ução de u m gen e d e resist ênci a à blasti ci din a como meio d e sel eção ráp id a p ara en riq uecim en to da fração de célul as
gen eti cam ent e m odi ficad as.
• Caract eriz ação in vit ro d o v eto r em cél ul as -tron co mesenqui m ais. • Av ali ação comp arat i va de três v eto res retrov irais dist into s (b as eados
em M LV, HIV e M SCV) sob as m esm as co ndi çõ es ex p eri ment ais
com o v eto res d e t ransferênci a gêni ca p ara o si stema n ervoso cent ral
de camu ndo n go s MP S I, at rav és d e inj eção int rav ent ri cul ar bil at eral. • Av ali ação d e su stent abili dad e d a ex press ão do t rans gen e e da redu ção
dos d epó sitos d e GAGs n o cérebro dos anim ais trat ad os ao térmi no
34
“ (...) We have s een t he mat urat ion of ge ne tr ansf er t ec hnol ogy, th e d esi gn of exc ell ent cli ni cal res earc h st udi es, and, of cour se, t he therape uti c suc cesses in t h e X-SCID an d A DA -SC ID studi es, pr omi sing cl inic al res ults in a bro ad se t of cancer g en e th era py stu dies , e xci ting ef f ects of g eneti c corre cti on i n anim al models of bl indn ess and i mmin ent hu man cli nical studi es of genetic for ms of bl ind ne ss, and eve n so me h opeful fi nding s i n neurod eg en er ati ve , o rthop ae di c, and c ard iov ascular di se ase, a mong ot hers. (...)”
T. Fri edm ann , “H app y A nniv ers ar y” M ol Ther 20 07, 15 (6).
Injection of mesenchymal stem cells modified with IDUA
in adult MPSI mice brains decreases GAGs deposits and
improves exploratory behavior
Injection of mesenchymal stem cells modified with IDUA in adult MPSI mice brains decreases GAGs deposits and improves exploratory behavior
Flávia Helena da Silvaa, b, Vanessa Gonçalves Pereirac , Eduardo G. Yasumurab, Lígia Zacchi Tenóriob, Leonardo Pinto de Carvalhob , Bianca Cristina Garcia Lisboab , Bruno Frederico Aguilar Calegared, Letícia Campos Brandãod, Vânia D’Almeidae, Thaís R.M. Filippof, Marimélia Porcionattof, Leny Tomaf,
Helena Bonciani Naderf, , Valderez Bastos Valerob , Melissa Camassolag, Nance Beyer Nardia,g, Sang Won Hanb, h
a
Department of Genetics, UFRGS
b
CINTERGEN, UNIFESP
c
Department of Pediatrics, UNIFESP
d
Department of Psychobiology, UNIFESP
e
Department of Biosciences, UNIFESP
f
Department of Biochemistry, UNIFESP
g
ULBRA CANOAS
h
Department of Biophysics, UNIFESP
Correspondence should be addressed to S.W.H (sang@biofis.epm.br)
CINTERGEN, UNIFESP
Rua Mirassol, 207 São Paulo-SP, Brazil CEP 04044-010
Abstract
Mucopolysaccharidosis type I (MPSI) is caused by the deficiency of alpha-L iduronidase (IDUA), which leads to lysosomal accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) dermatan and heparan sulfate. Unfortunately, currently available therapies are not able to prevent neuropathology. In this study we hypothesized that mesenchymal stem cells (MSC)
transduced with MLV-IDUA vector and injected in KO adult mice brain could reduce brain
GAG deposits and improve mice exploratory activity. After 1 or 2 months of follow-up, the
presence of transgene in the mice brain tissues was confirmed by PCR in almost all treated mice, in addition to an intense reduction of total GAGs. Despite that, IDUA activity was undetectable in these samples. These results indicate that the initial level of IDUA was not sustainable for a month, but they were enough to reduce GAGs content in the treated mice. An important consequence of this treatment was seen in the behavioral tests, which showed a tendency of exploratory behavior improvement. These results indicate a significant improvement in motility of adult KO animals, at least in a part, due to the brain GAGs reduction. By this study we suggest that the IDUA gene therapy associated with MSC and injected directly in the brain could be an efficient way to ameliorate neuropathology.
Keywords: MPSI, gene therapy, retrovectors, lysosomal storage disorder, mesenchymal
stem cell
Abbreviations: GAGs - glycosaminoglycans; LSD - lysosomal storage disorders; MPSI - mucopolysaccharidosis type I; ERT - enzyme replacement therapy; CNS - central nervous system; MSC - mesenchymal stem cells; MOI - multiplicity of infection; IDUA - alpha-L-iduronidase; CS - chondroitin sulfate; DS - dermatan sulfate; HS - heparan sulfate; WT - wild type; KO – knockout; KO/GFP - KO mice injected with MSC transduced with the
GFP construct; KO/IDUA - KO mice injected with MSC transduced with the MLV-IDUA construct
1. Introduction
The disruption of lysosomal competence in cellular metabolism results in accumulation of
glycosaminoglycans (GAGs), which leads to a group of inherited diseases called lysosomal
storage disorders (LSD). Mucopolysaccharidosis I (MPSI) is a type of LSD in which the
GAGs dermatan and heparan sulfate accumulate due to deficiency of alpha-L iduronidase
(IDUA - EC 3.2.1.76). The frequency of MPS I is 1:100,000 living births and it presents
itself as a syndrome with three phenotypes: Hurler (OMIM #607014), Hurler-Scheie (OMIM
#607015) and Scheie (OMIM # 607016). Recently it has been suggested that MPSI patients
should be classified into two forms: attenuated (Hurler-Scheie and Scheie) and severe
(Hurler) [1]. MPS I patients develop splenomegaly, bone/articular diseases and
cardiorespiratory malfunctioning, among other problems. Hurler syndrome also results in
progressive and irreversible neurodegeneration, which leads to death in early childhood [2].
Two types of treatment are currently available for MPSI. Bone marrow or stem cell
transplantation is efficient, but limited by the scarcity of compatible donors, high mortality
due to the procedure and high financial cost. The second alternative is enzyme replacement
therapy (ERT), which is effective for visceral disease, diminishing hepatosplenomegaly and
also improving articular movements. However, neither transplantation nor ERT can avoid the
neurodegenerative process [3]. Although preclinical studies have shown that infusion of high
levels of enzyme may reach the central nervous system (CNS) with therapeutic benefits [4],
these levels are not attainable at the clinical level, since more frequent infusions and higher
amount of enzyme would be necessary. Therefore, even initiating ERT in early childhood, it
will not bring a significant benefit to the CNS despite improving visceral disease. In
children are diagnosed much later in life [3]. These observations force to search for
alternative procedures aiming specifically to treat CNS.
Intravenous gene transfer of viral vectors to reach the brain of LSD animals is feasible at
neonatal stage with AAV, lentivector or retrovetor [5-8]. In adult MPSI mice, systemic
injection of AAV and MLV vectors have been shown to produce significant level of enzyme
in blood, but much less activity was detectable in brains [6, 8-11]. It is important to note that
the correction of neurological abnormalities, seen by behavioral tests, was evaluated only
after neonatal AAV viral gene transfer in this murine MPSI model [5]. Brain gene therapy
for MPSI models with viral vectors results in local IDUA production and GAGs reduction
for mice and dogs [9, 12], but unfortunately these works have not employed behavior tests.
In the literature, there are no gene therapy studies comparing adult mice in different stages of
advanced illness, which is a more interesting model if we consider the future implementation
of clinical trials. In MPSI mice, a progressive and temporal evolution of behavioral
malfunction is detected according to age onset [13], which should be the consequence of
accumulation of GAGs in the brain. How GAGs deposits affect neurocognition, even in
patients, is still under investigation [1]. Thus, it will be of great importance to include
behavioral tests and correlate such results with GAGs quantification, especially in brain gene
therapy studies for MPSI. Behavioral tests have already been performed in other types of
MPS [7, 14-17].
Mesenchymal stem cells (MSC) present the potential to differentiate into various cell types
of mesenchymal origin such as osteoblasts, chondrocytes and adipocytes [18, 19]. These
cells have shown the ability to respond to guidance cues in the brain, and may be used as
the preclinical study of different pathologies [21, 22], and has also shown success in terms of
cognitive gain of function in MPS VII mice [23].
In this paper, based on the characteristics of MSC and the necessity to provide additional
neurotrophic factors in situ, we hypothesized that MSC modified with IDUA delivered
directly into the ventricular brains of MPSI mice can bring a synergistic therapeutic effect,
especially in adult MPSI animals. To validate our hypothesis, adult MPSI mice were used
2. Material and methods
2.1. IDUA -/- mice
IDUA -/- (knockout – KO) mice were produced by targeted disruption of the IDUA gene
[24]. The colony (kindly provided by Dr Elizabeth Neufeld, UCLA, Los Angeles, CA, USA)
was maintained by breeding heterozygous animals. Maintenance conditions and
experimental protocols were approved by the Research Ethics Committee of the Federal
University of São Paulo (CEP 1201/07). In our experiments, 12-week old (12w) and 25-week
old (25w) KO mice were used. At the end of experiments, these mice were 20 (20w) and
29-week old (29w), respectively.
2.2. MLV vectors and mesenchymal stem cell culture and transduction
Two PT67 PCLs cell lines were used in our experiments: one containing the human IDUA
cDNA (NM_000203.3) (MLV-IDUA) and another gfp reporter gene (MLV-GFP) in the
same backbone, described by M Camassola et al. (unpublished results). Vectors were
collected as described elsewhere [25, 26] and were concentrated in a Sorvall centrifuge (rotor
SS34) at 16000 rpm for 2 hours. For each 20 mL of viral vector, 4 mL of 20% sucrose in
water were added. After centrifugation, the supernatant was drained off and the pellet was
ressuspended in the desired volume of serum-free DMEM medium without antibiotics and
glutamine and incubated overnight at 4oC. Vectors were titrated using NIH 3T3 cells with 8 µg/ml of polybrene [25, 26]. G418 sulfate and cell culture reagents were purchased from Gibco/Invitrogen Canada Inc (Burlington, ON, Canada); protamine sulfate and polybrene
from SIGMA (St Louis, MO, USA).
Mesenchymal stem cell (MSC) cultures were established from the bone marrow of 8
(multiplicity of infection) as indicated in the Results section, always using 5 x 104 cells
plated on 25 cm2 dishes. The transduction proceeded for 24 hours in the presence of 10 µg/mL of protamine sulfate. The medium was then replaced with a fresh one and the cells were cultivated for 7 days at 37oC in 5% CO2, when they were screened for IDUA activity.
MSC cultures positive for IDUA activity were then split and allowed to expand for
additional 3 days in 75 cm2 dishes for the in vivo experiments. Cells with the passage 3/4
were used for in vivo experiments.
For transduction of NIH3T3 mouse fibroblast cell line, the same procedure from MSC
transduction was used. After transduction, the cells were selected with G418 (1 mg/ml final
concentration) for at least 15 days. To determine transduction efficiency of MSC with gfp
reporter gene, GFP fluorescence positive cells were counted using fluorescence microscope.
2.3. Alpha-L-iduronidase activity
Cells were collected after tripsinization and the pellet was ressuspended in homogenization
buffer (10 mM NaPO4 pH 5.8, 0.1 mM DTT, 0.1% Triton X-100). IDUA dosage protocol is
described in M Camassola et al. (submitted manuscript). Briefly, in a microplate, 10 µL of the samples were mixed with 10 µL of 2.85 mM 4-methylumbelliferyl-alpha-L-iduronide (4MU-I, Toronto Research Chemicals Inc., North York, ON, Canada) and 40 µL of formate buffer 0.2 M pH 2.8. The plate was incubated at 37oC for 1 h and the reaction was stopped
by the addition of 175 µL of stop buffer (0.5 M glycine-NaOH, pH 10.3). Fluorescence of the 4MU product was determined using a Spectramax M2 fluorimeter (Molecular Devices
Inc., Sunnyvale, CA, USA) using 365 and 455 nm of wavelength for excitation and emission,
Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). IDUA activity is expressed in units (U), representing
nmols/h/mg ptn.
2.4. GAGs measurement
One third of mice brain tissue was cut and grounded in 10 volumes of acetone. After
standing overnight at room temperature, acetone was changed during five days. Afterwards,
acetone was discarded and the sample was completely dried at 50oC. The dry weight was
taken, and the sample incubated twice with maxatase 4 mg/mL (Tris HCl 0.05M pH8.0 NaCl
0.15M) for 24 h at 60oC. Trichloroacetic acid was added (10% of final volume) and allowed
to stand for 20 minutes at 4oC. The precipitate formed was removed by centrifugation at
5000 g for 20 minutes at room temperature. The GAGs from supernatant were precipitated
with two volumes of ethanol. After overnight incubation at -20oC, GAGs were collected by
centrifugation, vacuum dried, and submitted to deoxyribonuclease I treatment (Sigma, Saint
Louis, EUA). The GAGs were analyzed by agarose gel electrophoresis [28] and quantified
by densitometry with Quick Scan 2000 Software and using standard known concentration of
chondroitin sulfate (CS), dermatan sulfate and heparan sulfate (DS-HS). Each sample for
electrophoresis represents the minimal of one third of all GAGs extracted from brain tissue
destined to this analysis. We have not used less brain tissue to extract GAGs, neither less
sample to load the gel. GAGs are expressed in µg/g of dry tissue (total GAG) or percentual
of GAGs composition depicted in eletrophoretic profiles (% DS-HS and CS).
2.5. In vivo injection of transduced MSC
This protocol is a modification of [29]. IDUA KO mice were anesthetized as specified in the
mentioned reference and treated with 106 MLV-transduced MSCs, previously screened for
ventricule of the brain with a 30-gauge needle. Five minutes after injection, the needle was
removed and the incision was sutured. Mice were allowed to recover on a heating pad before
returned to microisolators. At different times after treatment, mice were sacrificed and the
brain was collected. Fractions (1/3) of the tissue were kept at -80oC for genomic DNA
extraction and GAGS determination. One third of the brain was directly processed in 1mL of
homogenization buffer with the help of a Potter device, for determination of IDUA activity.
2.6. Behavioral tests
All behavioral tests were conducted in the same room, at controlled temperature and
luminosity. Mice were separated into four cohort groups, based on treatment: wild type -
control mice (IDUA +/+, WT), knockout MPSI control mice (IDUA -/-, KO), KO mice
injected with MSC transduced with the MLV-GFP construct (KO/GFP) and KO mice
injected with MSC transduced with the MLV-IDUA construct (KO/IDUA). Animals were
tested before and after treatment, to evaluate the effect of treatment with transduced MSC on
motor function and anxiety in each group, by two behavioral tests. The elevated plus maze
test was conducted as previously described [17]. The number of entries in closed/open arms,
fecal pellets and urine foci were counted. The time spent in closed/open arms was registered,
in seconds. For the open field test, we used a circular arena, and the one trial exposition was
conducted similarly as previously described [30], except for the second exposition. The time
of freezing and grooming, and numbers of rearings, crossings (internal, external and total),
fecal pellets and urine foci were counted. Data are presented as mean and standard deviation
values for the pre trial test, when KO mice were compared to WT ones through the
nonparametric Mann-Whitney. The threshold for statistical significance was established at
P< 0.05. Results obtained after MSC treatment are presented as individual scores for each
2.7. Molecular analyses
Genomic DNA (gDNA) was extracted from the brain with the QIAamp DNA extraction kit
(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). PCR reactions for IDUA and endogenous control were
performed as previously described [31, 32]. PCR conditions for IDUA were also employed
for gfp primers in gfp PCR (5’gag cct ggg gac ttt cca cac cc 3’ and 5’ gaa aat tgt gat gct att gc
3. Results
3.1. Transduction of NIH 3T3 and MPSI MSCs cultures
To evaluate the efficiency of the concentrated viral vectors, NIH 3T3 cells were
transduced with 5.2 MOI and IDUA activity was evaluated (Table 1). These cells were used
as internal control for IDUA activity even if these fibroblasts were not isolated from MPSI
mice, because it was possible to submit these cells to selection with G418. The endogenous
activity of IDUA in non-transduced fibroblasts was at least 245 times lower than
G418-selected cells (23.8 ± 5.8 versus 5849.1 ± 851.6 U) (Table 1).
MPSI MSC were transduced with 5.2 and 77 MOI to estimate the transduction rate. After
one week of transduction, cells transduced with 77 MOI presented a similar level of IDUA
activity in relation to NIH3T3 MLV-IDUA transduced cells. After 4 weeks, enzyme
production in these cells was decreased to basal level. On the other hand, MPSI MSC
transduced with 5.2 MOI had 40 % of activity in the 1st week, but in the 4th week enzyme
production increased to 51%, reaching 3016.5 U. However, this group also lost IDUA
activity at 6th week (around 15.0 U) (Table 1). MSC transduced with MLV-GFP vector,
which express only the reporter gfp gene useful to determine transfection rates, presented
some level of activity (Table 1). This basal and non-specific activity can be explained by the
interference of gfp fluorescence, which emits weak signal of light at 455 nm.
Transfection rate determined by gfp expression showed a similar profile from cells
transduced with MLV-IDUA vector (Table 1). G418-selected NIH3T3-GFP cells were 100%
positive for GFP, whereas MPSI MSC transduced with 5.2 and 77 MOI had 8.9 and 21.3%
transduced with 77 MOI had no signal of GFP, while cells transduced with 5.2 MOI
maintained the same percentage of GFP-positive cells detected on week one. The 5.2 MOI,
however, resulted in undetectable levels of GFP on week 6, indicating that the extension of
gfp expression time is also followed by some kind of transgene silencing.
3.2. Pre trial behavioral evaluation
Since our research focused on already established illness, wild type (WT) and knockout
(KO) mice were submitted to open field test to evaluate exploratory behavior. Thus, this pre
trial test was performed in order to determine the degree of basal exploratory capacity
(Tables 2 and 3). Results of open field test show that KO mice were less active than WT
ones. Elevated zero maze did not detect differences among phenotypes.
3.3. Pos trial behavioral evaluation
Thirty to 60 days after ex vivo gene therapy, a second round of behavioral test was
performed, after which brains were collected for enzymatic dosage, PCR analysis and GAGs
quantification. Mice treated at 12 weeks of age were analyzed when 20-week old (20w).
Mice treated at 25 weeks were analyzed when 29-week old (29w).
Open field test showed a tendency of exploratory behavior improvement after ex vivo gene
therapy for both age groups (Table 4). In the 20w group, treated mice seemed to rear more
than non treated ones. Vertical movement (internal, external and total squares crossed in
open field test) showed the same tendency, being KO/IDUA more alike to normal mice. For
the 29w group, rearings were greatly improved in KO/IDUA mice only, and vertical
movement in this group seemed to be similar to normal mice. For KO/GFP mice belonging
to 20w group, the injection of new and low passage MSCs may explain the possible
improvement in these two parameters – which was not detected for KO/GFP mice from 29w
3.4. Quantification of IDUA and PCR analysis
Enzyme activity was undetectable in brain tissues from both study groups. PCR analyses
showed that almost all treated mice were positive for IDUA sequence, except in 3 samples
(Figure 1).
3.5. GAGs analysis
GAGs content was reduced in treated mice, as seen in Tables 4 and 5. Results, however,
point to a better outcome in 25 week-old age treated mice. Representative eletrophoretic
profiles allowed us to depict the proportion of chondroitin and dermatan-heparan sulfate in
