Os indivíduos da espécie C. reinhardtii são conhecidos pela capacidade de sincronização da divisão celular por toda a cultura quando a mesma é submetida a um fotoperíodo (24). Para reproduzir esse fenômeno em laboratório, foram inoculadas 1,0x105 cél/mL em 100mL de meio TAP em triplicata. A cultura fonte do inóculo apresentava 5,0x106 cél/mL e foi mantida sob fotoperíodo de 12h/12h de claro/escuro por pelo menos 3 dias. As três culturas foram incubadas a 30°C, 100rpm e fotoperíodo de 12h/12h de claro/escuro com iluminação de 100µmol fótons.m-2s-1 no período de luz. Após 0h, 12h, 24h, 36h e 48h, foram retiradas alíquotas dessas culturas para contagem de células utilizando o Countess®
Automated Cell Counter (Invitrogen). Para cada medição foi construído um gráfico com a distribuição do
número de células com tamanho de 1 a 20µm (Figura 10). Ao lado do gráfico está representado a concentração celular no momento específico e um quadrante da foto analisada pelo programa Countess
0h 12h 24h 36h 48h 1,2x105 cél/mL 1,3x105 cél/mL 5,3x105 cél/mL 6,3x105 cél/mL 1,7x107 cél/mL Figura 10 | Reprodução da sincronização da divisão celular na linhagem CC- 1009 wild type de C. reinhardtii. Alíquotas de três culturas sob fotoperíodo de 12h/12h de claro/escuro foram analisadas no contador de células Countess (Invitrogen) após 0h, 12h, 24h, 36h e 48h do inóculo. À esquerda se encontram as distribuições do número de células para cada tamanho. Uma linha vermelha foi traçada acima do tamanho médio das células na cultura. À direita está representado um quadrante da foto analisada na contagem e a concentração celular no momento.
Durante as 12h de iluminação em ambos os dias de experimento ocorre um aumento do tamanho médio das células sem haver, no entanto, aumento significativo do número de células. Em seguida, durante as 12h sem iluminação ocorre divisão celular por toda a cultura, aumentando a quantidade de células e, consequentemente, gerando células de tamanho menor. Pode-se notar pelas fotos que as células após 12h e 36h se encontram no fim da fase de crescimento devido à parede celular mais espessa e uma maior opacidade quando comparadas às células recém-geradas após 0h, 24h e 48h. Portanto, um ciclo celular decorre em 24h, ocorrendo captação de energia da luz e aumento de volume nas primeiras 12h e divisão celular em algum momento das 12h seguintes seguidas de um período de intérfase.
Em seguida, a atividade do antibiótico rapamicina foi testada utilizando culturas de C. reinhardtii em meio sólido. Cinco placas de Petri contendo meio TAP sólido foram preparadas. A primeira constituiu o controle, a segunda representou uma tentativa de estimular o crescimento utilizando 10µg/mL do aminoácido leucina (101) no meio de cultura e as outras três fizeram parte do grupo tratamento, em que foram utilizados 100nM, 200nM e 500nM de rapamicina. Em cada uma delas foram inoculadas 10µL de duas diluições diferentes de uma cultura com concentração de 1,0x107 cél/mL: uma diluição de 100x e outra de 1000x. As placas foram incubadas a 30°C sob luz constante por um período de 7 dias.
O crescimento das culturas foi registrado com uma câmera fotográfica depois de decorridos 4 e 7 dias do inóculo (Figura 11). Foi possível observar atividade do antibiótico, já que o crescimento foi diferente da cultura controle, sendo mais acentuado à medida que a concentração de rapamicina aumentou. O resultado também corrobora o fato de que a rapamicina não mata ou inviabiliza as células, mas apenas retarda seu crescimento. Quanto ao estímulo com leucina não foi observada alteração do crescimento da cultura em comparação ao controle. Caso esse aminoácido exerça algum tipo de influência no crescimento das células, ele o faz em um nível que não pode ser captado nesse tipo de teste.
O desenvolvimento de culturas tanto em meio TAP quanto em meio TAP contendo rapamicina (RAP) foi analisado também em meio líquido. O intuito foi de encontrar o momento certo para iniciar o tratamento com o antibiótico de tal forma que a quantidade de células tratadas permitisse a obtenção de material suficiente para extração de RNA. Além disso, esse experimento permitiu observar se haveria inibição do estímulo da rapamicina devido a uma quantidade muito grande de células, que poderia resultar em uma ação insuficiente do antibiótico.
Para isso, foram retiradas alíquotas de uma cultura de referência após intervalos de tempo distintos que foram em seguida submetidas ao tratamento com o antibiótico. Mais especificamente, células C.
reinhardtii sincronizadas foram inoculadas em 240mL de meio TAP a uma concentração final de 4,0x104
cél/mL e incubadas a 30°C, 100rpm e iluminação constante de 100µmol fótons.m-2s-1. Após 1,5; 2,5 e 3,5 dias foram extraídos 60mL da cultura e esse volume foi tratado com 500nM de rapamicina, enquanto o restante permaneceu como cultura controle. Alíquotas de 1mL foram retiradas de todas as 4 culturas a cada 12h até que se completassem 6 dias do inóculo inicial. Imediatamente depois de retiradas essas alíquotas, a absorbância a 750nm foi determinada por espectrofotometria e o número de células foi contado em Câmara de Neubauer. Todo o experimento foi feito em triplicata e os dados de concentração celular e de absorbância (Figura 12) foram plotados em função do tempo.
Figura 11 | Averiguação da atividade do antibiótico rapamicina na linhagem CC-1009 wild type de C. reinhardtii. Alíquotas de uma cultura foram submetidas a diluições de 100 e 1000 vezes e foram inoculadas em placas com meio TAP sólido contendo as concentrações indicadas de leucina ou rapamicina. As placas foram fotografadas 4 e 7 dias após o início da incubação sob iluminação contínua. 4 dias :10 :100 7 dias :10 :100 Rapa 100nM Referência Leu 10g/mL Rapa 200nM Rapa 500nM
Figura 12 | Curvas de crescimento de C. reinhardtii em meio de cultura tratado e não tratado com rapamicina. O desenvolvimento da cultura de referência e de três alíquotas dessa cultura, retiradas após 1,5 dias, 2,5 dias e 3,5 dias e tratadas com rapamicina, foi analisado em triplicata biológica. O número de células foi contado em Câmara de Neubauer a cada a cada 12h durante 6 dias (esquerda) juntamente com a medição densidade óptica a 750nm em espectrofotômetro (direita).
A mudança no número de células é bem abrupta na cultura controle e isso ocorre devido à sincronização, pois todas se dividem aproximadamente no mesmo tempo. Mesmo com a eliminação do fotoperíodo a sincronização persiste por alguns dias. No entanto, as culturas tratadas parecem ter perdido a sincronização, à medida que o aumento do número de células passa a ser linear. Nas culturas tratadas após 3,5 dias; apesar de a concentração celular ser próxima da condição controle, a densidade óptica é bem maior, indicando alguma alteração na morfologia das células. Essa alteração provavelmente é resultado do aumento do volume do vacúolo no interior da célula, provocado pela ativação da via de autofagia como consequência do estímulo com o antibiótico rapamicina. Como em tais culturas a quantidade de células não se altera muito com relação à cultura controle, mas a diminuição do crescimento é clara, esse parece ser o momento ideal para realizar o tratamento com rapamicina. Dessa forma, o momento em que a cultura atinge a concentração de 2,0x106 cél/mL foi utilizado nas análises posteriores como ponto inicial do tratamento.