GUSTAVO PEREIRA DE ALMEIDA
“ANÁLISE DO PAPEL DA VIA DE SINALIZAÇÃO SENSÍVEL À
RAPAMICINA NA EXPRESSÃO GÊNICA E MULTIPLICAÇÃO
CELULAR DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII”
“ANALYSIS OF THE RAPAMYCIN-SENSITIVE SIGNALING
PATHWAY ROLE IN GENE EXPRESSION AND CELL
MULTIPLICATION OF CHLAMYDOMONAS REINHARDTII”
CAMPINAS
2012
Agradecimentos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
à Braskem S/A e à ETH Bioenergia pelo apoio financeiro de todos.
RESUMO
A produção de energia por meio de fontes renováveis é uma exigência atual para se atingir uma economia sustentável. Os organismos fotossintetizantes surgem nesse contexto como ferramentas importantes na produção de compostos carbônicos ricos em energia, com destaque para microalgas em que tais compostos podem atingir até 80% do peso seco. Entretanto, um fator ainda desfavorável para sua utilização é o seu baixo rendimento na produção de biomassa. A espécie Chlamydomonas reinhardtii, por exemplo, é capaz de duplicar apenas algumas vezes durante 24 horas. As vias que controlam o crescimento celular, portanto, são alvos promissores para modificação genética. Dentre essas vias, à via de sinalização sensível à rapamicina aparece como um controlador central. Com o intuito de entender melhor como esse controle é exercido ao nível da expressão gênica global, foi utilizado a ferramenta de sequenciamento de RNA em larga escala para obtenção dos transcriptomas de culturas (sincronizadas) sob inibição dessa via e na condição controle, em oito momentos ao longo de um ciclo celular de 24h. O controle exercido por essa via sobre o metabolismo e sobre o ciclo celular foi o foco das análises. Foi encontrado que a inibição da via da TOR é capaz de gerar uma resposta de direcionamento parcial do metabolismo para a produção de TAG em detrimento de moléculas complexas como proteínas. Esse direcionamento foi considerado parcial devido à ocorrência concomitante de reações catabólicas. Outros dados obtidos sugerem que a via da TOR, além de regular o metabolismo de uma maneira geral e diversas funções celulares, também exerce influência sobre o progresso do ciclo celular e sua inibição resulta no atraso do desenvolvimento das fases do ciclo. Diversos fatores reguladores da transcrição envolvidos no desenvolvimento, no crescimento e na regulação do ciclo celular, foram encontrados diferencialmente expressos e constituem possíveis genes chave no controle do crescimento. Eles representam alvos em potencial para modificação genética com intuito de otimizar as taxas de crescimento na primeira etapa do sistema de produção. Na busca de alternativas aos processos atuais de indução do acúmulo de cadeias carbônicas, os efeitos da combinação rapamicina e via da TOR representam uma abordagem interessante para pesquisas futuras para viabilização da utilização de microalgas como fonte de energia. Este estudo possibilitou um melhor entendimento da atuação da via da TOR no crescimento e progresso do ciclo celular em C. reinhardtii ao nível de expressão gênica.
Palavras-chave: Microalga; Chlamydomonas reinhardtii; Serina-treonina quinase TOR; Transcriptoma;
ABSTRACT
The energy production through renewable sources is an actual demand for achieving a sustainable economy. In this context, photosynthesizing organisms come to light as important tools for the production of energy-rich carbonic compounds, especially the microalgae, in which these compounds can reach up to 80% of the dry weight. However, an unfavorable factor for its utilization is the low yield of biomass production. The species Chlamydomonas reinhardtii, for instance, is capable of achieving only some duplication after 24 hours. The pathways that control cell growth are therefore promising targets for genetic modification. Among them, the rapamycin-sensitive signaling pathway emerges as a central controller. With the aim of better understanding how this control is fulfilled by the means of global gene expression, the high throughput RNA sequencing technology was used. With it, the synchronized cultures transcriptome under the inhibition of this pathway and in the control condition, of eight points during a cellular cycle of 24 hours, were obtained. The metabolism and the cell cycle control by the TOR pathway was the main focus of the analysis. It was found that the inhibition of this pathway is capable to partially draw the metabolism towards TAG production to the detriment of producing more complex chains as proteins. This directing was considered partial due to the concomitant occurrence of catabolic reactions. Other data suggested that the TOR pathway, apart from the metabolism regulation in a general way and regulation of many other cellular functions, also influence the cell cycle progression and its inhibition retards the development of cell phases. Several transcription regulators involved in development, growth and cell cycle regulation were found out to be differentially expressed and are likely to constitute key genes in growth control. They represent potential targets for genetic modification aiming the optimization of growth rate in the first step of the production system. In the search for alternatives to the current process of inducing carbon chain accumulation, the effects of the combination between rapamycin and TOR pathway represent an interesting approach for future research intending to turn the utilization of microalgae as an energy source into a feasible option. This study enabled a better understanding of the role of the TOR pathway in growth and cell cycle progression of C. reinhardtii at the level of gene expression.
Key words: Microalgae, Chlamydomonas reinhardtii, TOR serine-threonine kinases, Transcriptome,
ÍNDICE
ABREVIAÇÕES ... ix
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS... x
INTRODUÇÃO ... 1
1. Do combustível fóssil às fontes renováveis de energia ... 1
2. O ciclo de vida de C. reinhardtii ... 3
3. A Via de Sinalização Sensível à Rapamicina ... 7
4. A Via da TOR em organismos fotossintetizantes ... 10
5. A Via da TOR em C. reinhardtii ... 13
6. Obtenção de transcriptomas por tecnologias de sequenciamento ... 14
OBJETIVOS ... 15
MÉTODOS ... 15
1. Cultura de células ... 15
2. Extração de RNA total ... 16
3. Síntese de cDNA ... 17
4. PCR Quantitativo ... 17
5. Preparo das bibliotecas para RNA-Seq ... 18
6. Sequenciamento de mRNA total em larga escala ... 18
7. Processamento dos reads ... 19
8. Anotação dos genes preditos de C. reinhardtii ... 19
RESULTADOS ... 20
1. A linhagem CC-1009 wild type é sincronizável e responsiva à rapamicina ... 20
2. O protocolo de extração de RNA total foi padronizado ... 24
3. Foram construídas e sequenciadas 32 bibliotecas de cDNA ... 26
4. Os dados de qPCR validam os resultados obtidos nos transcriptomas ... 31
Padronização dos ensaios de qPCR... 32
4.a. Análise comparativa entre os dados de qPCR e os oriundos do RNA-Seq ... 39
4.b. 5. Uma análise geral dos transcriptomas revela os processos celulares alterados ... 42
Estabelecimento de um cut-off para o FPKM ... 42
5.a. Correlação entre réplicas biológicas e tratamento ... 43
5.b. Enriquecimento de termos de GO ao longo do tratamento com rapamicina ... 44
5.c. 6. A síntese de TAGs é estimulada durante todo o tratamento com rapamicina ... 49
7. A rapamicina inibe a síntese de nucleotídeos e estimula a fosforilação oxidativa ... 57
8. A síntese de transcritos de proteínas ribossômicas é reprimida ... 63
9. A progressão na fase G1 do ciclo celular é comprometida pelo tratamento com rapamicina ... 67
10.A maioria dos reguladores da transcrição sofre alteração significativa na expressão ... 68
DISCUSSÃO ... 71
1. Questões centrais dirigidas neste estudo de transcriptoma ... 71
2. Genes chave no controle do crescimento celular ... 75
3. Rapamicina como alternativa à privação de nitrogênio no processo de produção em 3 etapas ... 77
CONCLUSÕES ... 79
DIRECIONAMENTOS FUTUROS ... 80
ABREVIAÇÕES
C. reinhardtii Chlamydomonas reinhardtii
CoA Coenzima A
Cq Ciclo de quantificação
FPKM Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped
FDR false discovery rate
GO Gene Ontology
h hora
kb kilobases
M molar
meio TAP meio tris-acetato-fosfato
min minutos
mTOR TOR de mamíferos
NADP Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato
OD densidade óptica
Ponto A ponto de arresto primário
Ponto T ponto de transição
pb pares de bases
qPCR PCR quantitativo
RAP condição tratada com rapamicina
RNA-Seq High throughput RNA Sequencing
rpm rotações por minuto
Ta temperatura de anelamento
TAG triacilglicerídeo
TAP condição controle não tratada com rapamicina
TF fator de transcrição
Tm Temperatura de melting
TOR Target of Rapamycin
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS
Figuras:
Figura 1 | Esquema de optimização da produção de cadeias carbônicas em microalgas. ... 3
Figura 2 | Diagrama do ciclo celular durante a divisão por múltipla fissão em C. reinhardtii crescidas em ciclos de luz/escuro de 12h/12h. ... 4
Figura 3 | Influência da taxa de crescimento no comprometimento com a divisão celular. ... 5
Figura 4 | Ciclo celular de C. reinhardtii e influência da taxa de crescimento. ... 6
Figura 5 | Fenômeno de sincronização da divisão celular em C. reinhardtii. ... 7
Figura 6 | Cascatas de fosforilação envolvidas na Via de Sinalização da TOR. ... 8
Figura 7 | Interação entre TOR e rapamicina e estrutura do gene mTOR. ... 9
Figura 8 | Complexos TOR em S. cerevisae. ... 10
Figura 9 | Árvore filogenética das proteínas TOR de diferentes espécies. ... 12
Figura 10 | Reprodução da sincronização da divisão celular na linhagem CC-1009 wild type de C. reinhardtii. ... 21
Figura 11 | Averiguação da atividade do antibiótico rapamicina na linhagem CC-1009 wild type de C. reinhardtii. ... 23
Figura 12 | Curvas de crescimento de C. reinhardtii em meio de cultura tratado e não tratado com rapamicina. ... 23
Figura 13 | Avaliação da quantidade de RNA obtida durante a padronização da extração. ... 25
Figura 14 | Curvas de crescimento de C. reinhardtii. ... 25
Figura 15 | Análise por eletroforese das amostras de RNA obtidas durante a padronização do protocolo de extração de RNA. ... 26
Figura 16 | Análise por eletroforese das amostras de RNA obtidas para análise da expressão gênica. .... 28
Figura 17 | Análise por eletroforese das amostras de RNA obtidas para a padronização dos ensaios de qPCR. ... 34
Figura 18 | Otimização da temperatura de anelamento dos ensaios de qPCR. ... 34
Figura 19 | Verificação da produção de banda específica de tamanho esperado no qPCR para otimização da Ta em cada ensaio. ... 35
Figura 20 | Otimização da temperatura de anelamento dos ensaios de qPCR. ... 36
Figura 21 | Verificação da produção de banda específica de tamanho esperado no qPCR para otimização da concentração de primers em cada ensaio. ... 37
Figura 22 | Curvas padrões de cada um dos ensaios de qPCR. ... 38
Figura 23 | Verificação da produção de banda específica de tamanho esperado no qPCR para obtenção da curva padrão de cada ensaio. ... 39
Figura 24 | Variação da expressão relativa dos genes de referência CrTUB1 e CrTUB2 avaliados por RNA-Seq. ... 40
Figura 25 | Comparação entre dados de expressão do gene CrAPG8 obtido por qPCR e por RNA-Seq. . 41
Figura 26 | Correlação entre os dados de qPCR e de RNA-Seq para o gene CrAPG8. ... 41
Figura 27 | Distribuição de frequências para cada FPKM obtido em cada biblioteca sequenciada por RNA-Seq. ... 42
Figura 28 | Correlação entre os dados obtidos por RNA-Seq. ... 44
Figura 29 | Níveis de expressão dos genes envolvidos na fixação de carbono ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 52
Figura 30 | Variação da expressão dos genes responsáveis pela síntese de proteínas envolvidas no
processo de fotossíntese. ... 53
Figura 31 | Níveis de expressão dos genes envolvidos na síntese de amido ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 54
Figura 32 | Níveis de expressão dos genes envolvidos na síntese de ácidos graxos ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 55
Figura 33 | Níveis de expressão dos genes envolvidos na síntese de TAGs ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 56
Figura 34 | Níveis de expressão dos genes envolvidos na degradação de ácidos graxos ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 57
Figura 35 | Níveis de expressão dos genes envolvidos na via da pentose-fosfato ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 60
Figura 36 | Níveis de expressão dos genes envolvidos no ciclo do ácido cítrico ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 61
Figura 37 | Níveis de expressão dos genes envolvidos na glicólise ao longo do time course nas condições tratada e não tratada com rapamicina. ... 63
Figura 38 | Variação da expressão dos genes envolvidas no processo de fosforilação oxidativa. ... 63
Figura 39 | Variação da expressão dos genes codificadores de proteínas ribossômicas ao longo do time course nas condições tratadas e não tratadas com rapamicina. ... 66
Figura 40 | Variação da expressão dos genes codificadores de proteínas envolvidas na biogênese de ribossomos ao longo do time course nas condições tratadas e não tratadas com rapamicina. ... 66
Figura 41 | Variação da expressão dos genes codificadores de fatores de tradução ao longo do time course nas condições tratadas e não tratadas com rapamicina. ... 67
Figura 42 | Variação da expressão de fatores envolvidos no progresso do ciclo celular ao longo do time course nas condições tratadas e não tratadas com rapamicina. ... 68
Figura 43 | Modulação das principais vias metabólicas na condição controle e durante a inibição da via da TOR. ... 73
Figura 44 | Sítios das mutações ativadoras na TOR2p e resíduos conservados. ... 82
Figura 45 | Sítios passíveis de mutação ativadora na proteína TOR em C. reinhardtii. ... 82
Tabelas: Tabela 1 | Análise por espectrofotometria das amostras de RNA obtidas para análise da expressão gênica. ... 27
Tabela 2 | Análise das bibliotecas de cDNA obtidas para sequenciamento por RNA-Seq. ... 29
Tabela 3 | Sequência dos adaptadores inseridos em cada biblioteca de RNA-Seq. ... 30
Tabela 4 | Quantidade de reads gerados no RNA-Seq e alinhados contra a referência. ... 31
Tabela 5 | Primers de qPCR para validação dos transcriptomas. ... 32
Tabela 6 | Análise por espectrofotometria das amostras de RNA obtidas para a padronização dos ensaios de qPCR. ... 33
Tabela 7 | Eficiência da reação de qPCR para cada um dos ensaios. ... 38
Tabela 8 | Termos de GO enriquecidos durante o time course do tratamento com rapamicina. ... 45
Tabela 9 | Quantidade de genes de cada família de fatores reguladores da transcrição que sofreram alteração ao longo do tratamento com rapamicina. ... 69
INTRODUÇÃO
1. Do combustível fóssil às fontes renováveis de energia
O aquecimento global, causado pelo crescente acúmulo de gases intensificadores do efeito estufa na atmosfera, configura uma grande problemática no quadro mundial nos dias de hoje (1). O dióxido de carbono (CO2) é o gás estufa de maior importância no agravamento deste fenômeno (2) e sua liberação
pela queima de combustíveis fósseis é calculada em 7,9Gt de carbono por ano (3,4). A formação desse tipo de combustível requer milhões de anos e seu consumo tem sido tão rápido a ponto da liberação de carbono atingir um nível 600 vezes maior que seu retorno para reservas fósseis (5).
O emprego de vias biológicas na tentativa de abrandar o acúmulo atmosférico de CO2 tem atraído
atenção por ser uma tecnologia sustentável capaz de integrar a produção de energia e biomassa com a fixação rápida desse gás em um ciclo curto de emissão/fixação de carbono. Vários países passaram a investir nos cultivares de soja, mamona, palma e cana-de-açúcar com intuito de produzir biocombustível e amenizar as emissões de carbono (6,7). Essa forma de combustível também é vantajosa pelo nível reduzido de emissão de partículas como monóxido de carbono e compostos sulfúricos durante sua queima. No entanto, plantas filogeneticamente mais derivadas apresentam rendimento energético pouco satisfatório (8,9). Estima-se que o potencial de captura de CO2 na agricultura contribui com apenas 6% do
abatimento das emissões fósseis (10), tornando uma alternativa inviável para esse propósito. Além disso, a agricultura de fins alimentares passa a competir com o cultivo de plantas oleaginosas resultando no deslocamento das atuais fronteiras agrícolas (11).
A versatilidade das microalgas para esse propósito é superior, uma vez que as condições de cultivo podem ser mais facilmente controladas de modo a estimular seu metabolismo e enriquecer a biomassa com metabólitos desejados (12). Esses organismos combinam a eficiência fotossintética pela estrutura celular simplificada (13) com o alto rendimento do cultivo controlado (12), elevada taxa de crescimento (14) e ciclo de vida relativamente curto quando comparados com espécies mais derivadas evolutivamente. Além disso, existem espécies cujo conteúdo lipídico atinge 80% da biomassa seca (15,16). A biomassa das microalgas é formada de vários compostos de interesse comercial como pigmentos, vitaminas, carboidratos e proteínas (17). Após a extração de lipídeos, o aproveitamento da biomassa residual consiste em um processo economicamente viável e vantajoso (18) e pode ser aplicada na indústria alimentícia para produção de suplementos alimentares com a fração proteica (19) e ração
animal. Os resíduos também podem ser utilizados na produção de etanol via fermentação da biomassa ou através da produção de metano na digestão anaeróbica (20).
Mesmo sendo um potencial em produção de lipídeos, a viabilidade da utilização das microalgas dependerá da competitividade de custo de produção e visão estratégica de mercados. A prospecção de microalgas viáveis para a produção de cadeias carbônicas lipídicas por meio de screening de espécies é essencial, no entanto, consiste em um processo bastante laborioso. Como muito pouco se conhece sobre a biologia molecular desse grupo, um estudo mais aprofundado é fundamental para transformá-los em importantes produtores de cadeias carbônicas e aparece como uma alternativa para permitir o aperfeiçoamento da produção de lipídios. O objetivo seria gerar um conhecimento passível de aplicação em outras espécies futuramente avaliadas como mais viáveis para produção em larga escala.
Para algumas das espécies mais estudadas e com melhor potencial, verifica-se alguns empecilhos na indústria como as taxas reduzidas de crescimento pelo fato de ocorrer concomitantemente com a produção do bioproduto propriamente dito. Uma estratégia para a produção de cadeias carbônicas em microalgas proposta dentro da linha de pesquisa na qual este trabalho se insere (Figura 1), é capaz de contornar esse tipo de problema, consiste na divisão do processo em três etapas subsequentes: a primeira etapa dedicada ao aumento da quantidade de células na cultura por divisão celular, a segunda consistindo na acumulação efetiva do composto de interesse por privação de nutrientes (21) e a terceira dedicada à expulsão dos lipídeos da microalga de forma não invasiva. A combinação das duas propriedades envolvidas no processo (fotossíntese e metabolismo) em um só organismo seria uma situação mais vantajosa se comparada, por exemplo, à conversão de sacarose em etanol por fermentação microbiana.
Apesar de poucos estudos acerca desse grupo de microrganismos terem sido desenvolvidos até o momento, uma espécie de microalga merece destaque quanto ao conhecimento já produzido.
Chlamydomonas reinhardtii tem sido usada como organismo modelo para estudo da fotossíntese e
estrutura do flagelo (22) há mais de duas décadas. Isso implica na existência de uma variedade de protocolos disponíveis para manipulação a nível celular e molecular, tornando-o o organismo mais indicado para ser tomado como ponto de partida para o desenvolvimento de tecnologias de produção de biocombustível baseadas em microalgas. O propósito deste trabalho é estudar o crescimento celular para o aperfeiçoamento da primeira etapa de produção, que envolve o aumento do número de células na cultura, e traz consigo a necessidade de entender melhor o ciclo de vida da microalga objeto de estudo.
2. O ciclo de vida de C. reinhardtii
O ciclo celular das microalgas pertencentes à espécie C. reinhardtii pode ser dividido em dois períodos: um de pré-comprometimento e outro de pós-comprometimento (23). O início do ciclo de uma célula em condições autotróficas é marcado pela necessidade de luz para que haja o prosseguimento no ciclo. Caso esse pré-requisito não seja cumprido, o ciclo fica interrompido num ponto denominado ponto de arresto primário ou ponto A (24). Quando em presença de luz a célula é capaz de crescer e esse crescimento é monitorado de tal forma que ao atingir um tamanho mínimo específico correspondente ao dobro do volume inicial, ela se compromete a dividir (24-27). A partir desse ponto, conhecido como ponto de transição ou ponto T, o ciclo se torna independente da luz. Isso implica que os eventos seguintes não requerem energia externa e o ciclo pode ser completado mesmo na ausência da luz, não sendo facilmente interrompido por adaptações metabólicas a mudanças no ambiente (28). Essas algas são capazes de dobrar várias vezes seu tamanho (Figura 2), o que as permite alcançar vários pontos de comprometimento sequencialmente na fase de divisão. Como resultado, ocorrem múltiplas fissões, duplicando duas, três ou mais vezes o número de indivíduos de uma população num período de 24h (26,27).
Figura 1 | Esquema de optimização da produção de cadeias carbônicas em microalgas. Proposta da linha de pesquisa do Laboratório de Genômica e Expressão da UNICAMP para aperfeiçoar o processo de obtenção de biocombustíveis em microalgas. A ideia principal consiste em dividir todo o processo de produção em três etapas: rápida multiplicação celular, seguida de uma fase de acúmulo de lipídeos e indução da extrusão dessas moléculas.
Todas as divisões se sucedem rapidamente durante o período de escuro. Cada rodada de síntese de DNA é imediatamente seguida de mitose e citocinese, de forma que nenhuma célula tenha mais que duas vezes o lote haploide de cromossomos. Essa etapa segue um intervalo de tempo fixo e independente da iluminação ou do crescimento (28), com duração de aproximadamente 1-1.5h (25). As células filhas são retidas dentro da parede celular da célula mãe até que todo o período de divisão se complete. Elas então são liberadas simultaneamente pela ação da enzima lítica vegetativa de forma imediata quando há iluminação prévia (25) ou logo antes do fim do período de escuro (27). No último caso, o período compreendido entre a divisão e a liberação das células é chamado de G0, já que o crescimento só é retomado em G1, quando a luz é restabelecida.
A capacidade das células de monitorar o tamanho mínimo para divisão indica existência de um mecanismo sensor de tamanho, que determina o momento em que a célula está apta a se comprometer com a divisão. O alcance do primeiro comprometimento celular com a divisão depende da intensidade luminosa e da temperatura (25) e, portanto, da taxa de crescimento (Figura 3). Células crescidas sob maiores temperaturas e maior intensidade luminosa atingem mais pontos de comprometimento e culminam na formação de um maior número de células filhas ao final do período de divisão.
Figura 2 | Diagrama do ciclo celular durante a divisão por múltipla fissão em C. reinhardtii crescidas em ciclos de luz/escuro de 12h/12h. Células na fase G1 se comprometem com uma futura divisão quando alcançam um tamanho crítico, mas continuam crescendo até o começo da fase de escuro. No fim de G1, uma rápida série de ciclos alternando entre as fases S e M geram 2n células filhas de tamanho uniforme, confinadas dentro da parede da célula mãe. O valor de n varia e está relacionado com o tamanho da célula mãe. Células filhas são liberadas de forma sincronizada durante o fim da fase de escuro e entram novamente em G1 quando a luz é restabelecida. As múltiplas divisões estão destacadas na imagem de microscopia de luz ao lado direito. Figura modificada (27).
Os tempos transcorridos para os comprometimentos com as etapas seguintes de divisão também dependem da taxa de crescimento (26) e quanto mais propensos ao crescimento celular esses fatores são, mais rapidamente ocorre o comprometimento. A síntese de DNA só ocorre posteriormente no ciclo (27,29). A divisão celular e a liberação das células ocorrem após um período de duração constante em uma dada temperatura, depois do início da exposição à luz (Figura 4). O mesmo ocorre para o início da síntese de DNA e, em ambos os casos, não há dependência da intensidade luminosa. A duração do ciclo, portanto, é determinada por dois períodos de tempo constantes, cada um começando após o término do outro (28,30).
A dependência de luz a partir do ponto A e a independência dela a partir do ponto T são responsáveis por regular o fenômeno de sincronização da divisão celular de C. reinhardtii em condições autotróficas (Figura 5A). Uma população dessincronizada é consistida de células em momentos distintos do ciclo e de forma independente das outras células. Após uma incubação prolongada no escuro, toda a população tem o ciclo interrompido no ponto A. Uma nova exposição à luz permite que as células atinjam o comprometimento, completem o ciclo, se dividam e parem no ponto A do ciclo seguinte devido a uma segunda interrupção da iluminação (24). Inicialmente, a média de volume celular aumenta enquanto a concentração celular permanece inalterada (Figura 5B). A liberação simultânea das células filhas é evidente com o aumento brusco do número de células menores (Figura 5C). Esse tipo de exposição a
Figura 3 | Influência da taxa de crescimento no comprometimento com a divisão celular. Em ambos os gráficos estão representadas a quantidade de células filhas gerada por célula mãe quando essas últimas são incubadas no escuro após um determinado período de exposição à luz (○,●). Está representado também a porcentagem de células que já atingiu a divisão celular ao longo do tempo (□,■). Culturas sincronizadas de C. reinhardtii foram expostas a 25°C (A) e 30°C (B) e 75 µmol.m-2.s-1 (●,■) ou 150 µmol.m-2.s-1 (○,□). A linha pontilhada ilustra a curva extrapolada para o tempo de divisão celular para cada temperatura de incubação. Figura modificada (26).
ciclos de claro/escuro é usado como técnica para sincronização em muitas espécies de algas crescidas de modo autotrófico (24,27). Estudos mostram que a sincronização induzida por ciclos claro/escuro pode ser mimetizada com precisão em células em regime de autotrofia ou sob iluminação contínua através da inibição da cadeia fotossintética de transporte de elétrons pelo inibidor DCMU (24) e pela remoção do CO2 da cultura (30), respectivamente. Dessa forma, a sincronização por claro/escuro resulta da
periodicidade na disponibilidade de metabólitos de alta energia da cadeia de transporte de elétrons (24). Como é possível observar, a divisão celular em C. reinhardtii, assim como em diversas microalgas, é bastante peculiar. É evidente a existência de uma correlação entre maior número de divisões e maior tamanho no momento do comprometimento, com altas taxas de crescimento celular nesses organismos (28). Isso revela a importância de se trabalhar com a elevação da taxa de crescimento celular objetivando um maior tamanho e um consequente aumento no número de divisões. Com essa finalidade, é introduzida a ideia de se empregar artifícios envolvendo as vias de sinalização diretamente relacionadas ao crescimento das células.
Figura 4 | Ciclo celular de C. reinhardtii e influência da taxa de crescimento. Culturas crescidas a 25°C (A,B) ou 30°C (C,D) a 75 µmol.m-2.s-1 (A,C) ou 150 µmol.m-2.s-1 (B,D). O volume celular em função do tempo está plotada como medida para crescimento celular (losangos); as barras marcadas indicam crescimento durante G1; os pontos de comprometimento estão indicados como barras pretas; tempo para síntese de DNA, mitose e citocinese estão marcadas como S, M e C, respectivamente; a linha pontilhada vertical mais a direita indica o tempo em que as células filhas foram liberadas; as barras superiores ilustram crescimento que não resultou em comprometimentos adicionais. Figura modificada (26).
3. A Via de Sinalização Sensível à Rapamicina
Uma das características mais notáveis comum a todos os organismos é a capacidade de comunicação com o meio e entre si, através de vários caminhos de recebimento e processamento de sinais internos ou externos à célula, formando verdadeiras redes de sinalização celular (31). Nessas redes, a informação é transferida por mecanismos de modificação pós-traducional (32) ao nível das proteínas quinases reguladas por eventos de fosforilação em resposta a sinais upstream nas vias (31).
O crescimento não é um processo passivo regulado pela disponibilidade de nutrientes, mas um acúmulo de massa controlado por vias de sinalização que atuam na fisiologia da célula para estimular um anabolismo balanceado (33). A Via de Sinalização Sensível à Rapamicina (Figura 6) se insere nesse contexto como controladora central do crescimento celular mediada pela quinase Target Of Rapamycin (TOR; 34). A proteína TOR foi identificada primeiramente em leveduras (Saccharomyces cerevisiae) num
screening por mutantes resistentes ao antibiótico rapamicina. Ela atua no controle e integração das vias
que determinam ou limitam o crescimento e a sobrevivência celular em resposta à disponibilidade de nutrientes (nitrogênio em leveduras e aminoácidos em mamíferos), a sinais mitogênicos ou fatores de crescimento (via PI3K/PDK1/Akt), a níveis de energia (quinase AMPK) e a estresses (34-37). Portanto, a quinase TOR é um regulador central conservado que integra energia, nutrientes, fatores de crescimento e estresse para promover a sobrevivência e o crescimento em todos os eucariotos (38).
Figura 5 | Fenômeno de sincronização da divisão celular em C. reinhardtii. Células crescidas em cultura sincronizada (A) sob um regime de claro/escuro de 12h/12h (27). Distribuição dos volumes celulares a cada duas horas em uma cultura sincronizada a 30°C, 150 µmolm-2.s-1 e regime de claro/escuro de 16h/8h. As células foram irradiadas (B) durante 4h, 6h, 8h, 10h e 12h e, em seguida, mantidas no escuro (C) por 0h, 2h, 4h e 6h. Figura modificada (26). 10µ Claro Escuro 4h 6h 8h 10h 12h 4h 6h 8h 10h
Algumas das funções da TOR podem ser inibidas in vivo e in vitro por um complexo envolvendo a rapamicina e a proteína FKBP12 (FK506 binding protein 1A; Figura 7A), a qual ela se liga quando adentra a célula (39-42). A rapamicina, produzida pela bactéria Streptomyces hygroscopicus, possui propriedades imunossupressoras (43,44) e é capaz de inibir o crescimento de células de mamífero (34) e levedura (45). O estado de células de levedura após tratamento com rapamicina se assemelha ao de depleção de nutrientes (33) ou perda do gene TOR1, que não é letal à célula (46) como a perda de TOR2 (47).
As leveduras apresentam genes codificadores das proteínas TOR1 e TOR2, com 70% de identidade e massa molecular de 280kDa, pertencentes à família das PIKK (Phosphoinositide kinase-related kinases). Os membros dessa família contêm um domínio quinase que se assemelha ao domínio catalítico das fosfoinositol quinases (PI3Ks e PI4Ks), embora fosforilem resíduos de serina/treonina. Em sua estrutura (Figura 7B), a quinase TOR apresenta imediatamente após a região amino-terminal do domínio catalítico, um domínio de ligação ao complexo FKBP12-rapamicina (FRB), onde mutações pontuais conferem resistência à droga (34). Antes da região carboxi-terminal do domínio catalítico estão localizados os
Figura 6 | Cascatas de fosforilação envolvidas na Via de Sinalização da TOR. De verde estão marcadas as proteínas envolvidas na via que estão presentes em C. reinhardtii e de vermelho estão destacados fatores aos quais a via responde. Foto modificada do KEGG Pathway Database (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html).
domínios regulatórios FAT e FATC, que estão sempre em combinação, indicando uma possível modulação da atividade da quinase. Na extremidade amino-terminal encontra-se ainda uma série de 20 domínios HEAT (tandem HEAT repeats), responsáveis por estabelecer as interações com outras proteínas (33,34).
As proteínas TOR1 e TOR2 formam complexos distintos com funções celulares diferentes (Figura 8). TORC1 contém KOG1, TCO89, LST8 e TOR1 ou TOR2, já TORC2 contém AVO1, AVO2, AVO3, BIT61, LST8 e TOR2, mas não TOR1 (34). Enquanto TORC1 está relacionado diretamente com o crescimento celular, TORC2 está envolvido com a polimerização de actina e adesão celular (3,41). Foi relatado que esses complexos estão parcialmente associados a membranas internas como reticulo endoplasmático e complexo de Golgi ou membranas plasmáticas em leveduras e mamíferos (48,49).
O complexo mTORC1, em mamíferos, está envolvido no controle do metabolismo celular (biossíntese de aminoácidos, homeostase da glicólise), a biogênese de ribossomos e a regulação da taxa de síntese de componentes da maquinaria de tradução e transcrição a nível transcricional e traducional (34), de forma similar a leveduras. Além da mTOR, esse complexo é composto pelas proteínas RAPTOR e mLST8, homólogos a KOG1 e LST8 de levedura (39,40). Os principais alvos celulares incluem os fatores de iniciação da tradução eIF4G, eIF4B e 4E-BPs (34,36,50-52) e as quinases da proteína ribossomal S6 ou S6Ks (51,53).
Figura 7 | Interação entre TOR e rapamicina e estrutura do gene mTOR. (A) Estrutura da rapamicina e regiões de interação entre esse antibiótico e as proteínas TOR e FKBP (36). (B) Estrutura do gene TOR em mamíferos, destacando a região nessa proteína responsável pela interação com a rapamicina (37).
4. A Via da TOR em organismos fotossintetizantes
A via da TOR já foi identificada em plantas (54,55) e é responsável por interligar os diferentes sinais de estresse com os sinais das vias de crescimento, adequando o crescimento da planta de acordo com as diversas condições do ambiente (56). Como as plantas estão constantemente expostas a estresses, essa via exerce grande importância nesse grupo no controle do crescimento através de informações exógenas (57). No entanto, muito pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na sua regulação (55,56,58). O relato da insensibilidade à rapamicina nas plantas superiores e da letalidade do mutante tor já no estágio embrionário representou um grande impedimento na dissecação funcional da via da TOR em plantas (38,58).
Na última década, foi estabelecido um consenso de que plantas terrestres seriam resistentes à rapamicina devido a mudanças evolucionárias na AtFKBP12 (59,60). De forma consistente, a interação dependente de rapamicina entre AtFKBP12 e o domínio FRB-TOR não pôde ser demonstrada nem pelo
Figura 8 | Complexos TOR em S. cerevisae. Proteínas associadas à TOR (KOG1, TCO89, LST8, AVO1–3, e BIT61) e os respectivos domínios presentes nessa proteína (HEAT, FAT, FRB, quinase, e FATC). Tanto TORC1 quanto TORC2 são multímeros. TORC1 media a sinalização sensível à rapamicina, enquanto a sinalização de TORC2 é insensível. Estímulos que regulam positivamente o controle acúmulo de massa pela TOR estão mostrados em flechas pretas. Estímulos que regulam negativamente TORC1, impedindo a inibição dos processos de autofagia e resposta a stress estão mostrados com flechas vermelhas. Os reguladores de TORC2 não são conhecidos (34).
sistema duplo-híbrido nem por ensaios de ligação (56,59,61). Mais recentemente, essas hipóteses foram reexaminadas em um ensaio de sensibilidade celular e, de forma surpreendente, foi observada que a utilização de concentrações mais altas desse antibiótico (100-1000nM contra 10-50nM) promoviam a inativação de AtTOR revelada pela redução dos níveis de fosforilação dos resíduos de Thr-449 e Thr-455 das proteínas S6K1 e S6K2, respectivamente (38).
Como resposta aos trabalhos que falharam em encontrar a formação do complexo inibitório, um ensaio de complementação in vivo com split luciferase detectou a ocorrência de interações, mesmo que rápidas e transientes. Também foi observado um forte atraso no desenvolvimento em sementes tratadas após a germinação. Suportando o envolvimento da FKBP12 na mediação desse processo, todos esses efeitos inibitórios foram bastante reduzidos em mutantes fkbp12. Para finalizar, os resultados sugeriram claramente que a superexpressão ectópica de ScFKBP12 apenas aumenta a sensibilidade ao antibiótico, em vez de restaurá-la como proposto em trabalhos anteriores (61,62).
Apesar da disseminação da falsa premissa da resistência das plantas à rapamicina, ainda foram desenvolvidas pesquisas na área. A partir delas foi proposto que a sinalização pela TOR possui funções diferentes para cada estágio do desenvolvimento. Inicialmente, ela controla o crescimento, e durante a vida adulta essa proteína passa a atuar no controle da fisiologia relacionada a nutrientes e envelhecimento (34). Em Arabidopsis, mutantes nulos para o gene tor apresentam fenótipo letal já no estágio embrionário (59). Em contraste, quando o gene da TOR era silenciado por RNAi as plantas sobreviviam e reproduziam, embora o crescimento fosse lento e a senescência prematura (57,63). O nível de expressão de TOR em Arabidopsis está correlacionado com o tamanho da planta sem afetar a morfologia, com a quantidade de sementes produzida, a abundância de polissomos e a resistência a estresse osmótico (57). Dessa forma, a letalidade da sua ausência no embrião provavelmente se deve ao déficit de ribossomos para sustentar a síntese proteica (58), pois rRNA é o principal componente dos ribossomos e sua dosagem é limitante na taxa de biogênese dessas estruturas, na divisão celular e no crescimento (64). A proteína TOR também controla processos relacionados a autofagia em plantas, da mesma forma que em outros organismos (65).
Vários genes componentes da via da TOR foram identificados em plantas. Ortólogos da TOR e S6K foram descritos em Arabidopsis (59) e Zea mays (66-68), mostrando sua importância fundamental no desenvolvimento das plantas. Também foram encontrados um homólogo ao gene FKBP (69), dois homólogos a RAPTOR, com funções implicadas no desenvolvimento embrionário (59,63,70) e dois
homólogos a LST8, sendo apenas um deles significativamente expresso (63). Embora haja fortes evidências da existência de TORC1 em plantas e algas, ainda não está clara a presença de componentes específicos de TORC2 (56,65,71).
Com aproximadamente 280kDa, a proteína TOR em Arabidopsis apresenta todos os domínios conservados encontrados nas outras espécies: HEAT repeats e domínios FAT, FATC, FRB e quinase (56,59). O domínio quinase nesse grupo participa de forma crítica no desenvolvimento, na localização nuclear da proteína e na expressão de rRNA (58). O nível de conservação nos domínios quinase, FAT e FRB é bem alto entre os eucariotos, no entanto, tal conservação é limitada para o número de HEAT repeats (72). A árvore filogenética das proteínas TOR de diferentes espécies refletem perfeitamente a relação filogenética entre esses organismos (Figura 9).
Os domínios FAT e HEAT repeats provêm sítios de ancoragem para outras proteínas (62). Foi descrita a interação estável de AtRAPTOR1 com os HEAT repeats e com a AtS6K1 in vivo (56,73), que deve estar envolvida no controle do desenvolvimento do embrião e crescimento induzido pelo meristema em plantas (57,59,70,74). É também nos HEAT repeats que reside o motivo de ligação ao promotor do gene do rRNA 45S, como mostrado em células de humanos e ratos (75). Já os domínios FRB e quinase
Figura 9 | Árvore filogenética das proteínas TOR de diferentes espécies. Quatro grupos principais são formados pelo reino animal, fungos, algas e plantas superiores.Os números de bootstrap indicam a quantidade de vezes que o grupo contendo as sequências das proteínas à direita da bifurcaçãoocorreu nesse mesmo local nas árvores, em cem tentativas. Todos esses valores são altos, indicando uma filogenia bem robusta (68).
são responsáveis pela interação com a proteína AtLST8-1, formando o complexo responsável pelo crescimento, desenvolvimento e regulação metabólica da planta, já que mutação lst8-1 afeta tais funções (63). Foi mostrado também que a proteína TOR se associa a outra cópia dela mesma (58).
5. A Via da TOR em C. reinhardtii
Atualmente também já é conhecida a sensibilidade à rapamicina em C. reinhardtii (59,76) e em Zea mays (55). No entanto, a sensibilidade no primeiro organismo foi considerada incompleta devido à afinidade um pouco reduzida da CrFKBP12 à rapamicina. O mutante incapaz de expressar corretamente o gene CrFKBP12 não apresenta inibição do crescimento celular no tratamento com rapamicina. Isso provê uma forte evidência da presença da via da TOR controlando o crescimento nessa espécie (76).
A análise do gene CrTOR revelou a existência de 41 éxons e 40 íntrons distribuídos em pelo menos 20kb de DNA genômico, cuja transcrição resulta numa proteína de 277kDa. Seus domínios quinase, FRB, FAT e FATC são altamente conservados e sua identidade é maior com AtTOR do que com a TOR de organismo não-fotossintetizantes (76). Funções da TOR sensíveis ou insensíveis à rapamicina já foram descritas em leveduras e mamíferos (3,41). Foi demonstrado que a interação de CrLST8 com o domínio quinase de CrTOR está relacionada às funções sensíveis à rapamicina e ocorrem em complexos de 2MDa associados a membranas microssomais, sendo abundantes na região do corpo peri-basal. No entanto, nenhuma correlação direta foi estabelecida entre a capacidade de CrLST8 se ligar à CrTOR e seu requerimento na promoção do crescimento celular. Além disso, a maior abundância da primeira em relação à segunda sugere que CrLST8 deve executar outras funções independentes da sinalização de CrTOR (65).
A relação íntima entre a via da TOR e metabolismo celular em mamíferos e leveduras e sua aparente conservação em organismos fotossintetizantes indica a importância da elucidação dessa relação na busca de alvos em potencial para modificação genética com o intuito de aumentar a eficiência de obtenção de biomassa. Um tipo de abordagem para atingir esse nível de compreensão é a análise global do ambiente celular, como, por exemplo, da expressão gênica diferencial entre condições contrastantes. Para tal, atualmente são disponíveis técnicas diversas e algumas delas são contrastadas a seguir.
6. Obtenção de transcriptomas por tecnologias de sequenciamento
A tecnologia de microarranjos de DNA tem sido a mais utilizada em estudos de expressão gênica de larga escala (77) e levou a importantes avanços em diversas áreas de estudo da Biologia. Apesar da grande revolução principalmente na análise de transcritos, a tecnologia dos microarranjos apresenta uma série de características metodológicas que a tornam consideravelmente complexa e laboriosa (78), tais como o uso de um chip com um número finito de sondas de sequências necessariamente conhecidas e a realização de uma série de normalizações necessárias para evitar erros sistemáticos da técnica.
As tecnologias mais modernas permitem o sequenciamento em larga escala, correspondendo a milhares de megabases de DNA em questão de dias (79). Dentre as mais conhecidas estão o pirosequenciamento (454 Life Sciences), HiSeq (Illumina/Solexa) e AB SOLID (Applied Biosystems) e vêm sendo utilizadas para investigar expressão gênica diferencial através de sequenciamento de cDNA, processo denominado Highthroughput RNA Sequencing (“RNA-Seq”; 80).
A facilidade no preparo da amostra a ser analisada aliada ao grande volume de informações obtidas e o menor custo tem feito desta técnica uma abordagem extremamente vantajosa e inovadora. Trabalhos recentes relatam o uso destas tecnologias em diferentes experimentos, incluindo a busca de mutações em tecidos cancerosos (81), a caracterização dos transcritos e confirmação de íntrons no genoma de S.
cerevisae (80) e até mesmo a análise de transcriptomas de Chlamydomonas em diversas condições de
estresse ambiental (82-85).
Trabalhos comparativos demonstram alta correlação entre os resultados de microarranjos e de sequenciamento (77,78,86). Além disso, a obtenção de transcriptomas por sequenciamento apresenta vantagens como maior precisão dos dados obtidos e facilidade de análise, maior sensibilidade a transcritos pouco abundantes permitindo detectar pequenas variações de expressão (77). Somado a isso, essas tecnologias estão se tornando mais acessíveis a cada dia, por estarem evoluindo rapidamente. Dessa forma, as novas tecnologias de sequenciamento vêm sendo apontadas como sucessoras dos microarranjos na análise de expressão gênica de forma global.
A proposta de aprofundar o entendimento da relação da Via de Sinalização Sensível à Rapamicina com o crescimento celular representa um desafio e a aplicação de técnicas de sequenciamento em larga escala para obtenção do transcriptoma de culturas sob a alteração da modulação dessa via constitui um método moderno e eficiente para analisar a fundo essa relação.
OBJETIVOS
A via de Sinalização Sensível à Rapamicina é responsável pelo controle do crescimento celular e pela sensibilidade ao nitrogênio disponível no meio e é conservada entre os diversos táxons, inclusive na espécie C. reinhardtii, Tendo em vista tal fato, esse estudo teve como principal objetivo explorar como esse controle é exercido ao nível da expressão gênica de uma forma global no ambiente celular.
O trabalho se baseou na utilização da ferramenta de sequenciamento de RNA em larga escala para obtenção dos transcriptomas em duas situações: em culturas sob inibição dessa via e em culturas controle. Através da resposta que sua inibição gerou na expressão gênica global dessa espécie, foram concentrados esforços na análise da expressão gênica diferencial dentro das principais vias metabólicas, da via de biossíntese de ribossomos, do ciclo celular e dos fatores de transcrição. Essa análise foi desenvolvida de forma a abordar três questões centrais seguintes. A inibição da via da TOR é capaz de gerar uma resposta centralizada na produção de TAG como ocorre durante a privação de nutrientes, ou a situação de estresse que ela gera resultaria na produção de diversos outros metabólitos? Essa via controla o crescimento celular apenas pela regulação do balanço entre anabolismo e catabolismo ou ela também atua no progresso no ciclo celular? A influência dela sobre os reguladores da transcrição se resume a um grupo limitado ou acaba se estendendo por todos eles?
A partir dessas análises o trabalho abordou duas questões secundárias. A primeira dessas questões envolve a busca de possíveis genes chave no controle do crescimento celular na espécie C. reinhardtii e sua utilização na otimização da obtenção de biomassa através de técnicas de biologia molecular. A segunda questão tratada é acerca da possibilidade de utilização do composto rapamicina como ferramenta de indução da parada do crescimento celular e início da produção e acúmulo de cadeias carbônicas em microalgas, dentro do esquema de produção em três etapas, já que ele provoca estímulos similares à privação de nutrientes.
MÉTODOS
1. Cultura de células
Chlamydomonas reinhardtii UTEX-89 (The Culture Collection of Algae - Universidade do Texas, EUA) foi
e agitação de 100rpm na incubadora Multitron shaker incubator (Infors HT). Quando necessário, colônias eram cultivadas em meio TAP sólido 1,5% de ágar em placas de Petri. As culturas iniciais eram geralmente inoculadas a partir de culturas em fase exponencial do crescimento e de forma que a concentração final de células fosse de 1,0x105 cél/mL. A sincronização foi atingida em incubando em fotoperíodo claro/escuro de 12h/12h. A contagem celular foi realizada em Câmara de Neubauer ou no aparelho Countess® Automated Cell Counter (Invitrogen) após tratar com 1% de lugol para impedir a movimentação das células. A turbidez do meio foi medida através da absorbância à 750nm no espectrofotômetro Biomate3 (Thermo Scientific). A rapamicina (Lote N° ASW-116) foi dissolvida em etanol absoluto de acordo com as orientações do fabricante (LC Laboratiories) de forma a obter uma solução estoque com concentração de 1mM. Nos experimentos envolvendo tratamento com esse antibiótico as amostras de referência foram tratadas com o mesmo volume de veículo (etanol absoluto). Todas as manipulações de culturas foram realizadas na capela de fluxo laminar vertical (Veco) após esterilização total do ambiente interno com álcool, seguida de exposição à radiação ultravioleta por 30min.
2. Extração de RNA total
Células em crescimento exponencial, ao atingirem a concentração de 2,0x106, foram coletadas por centrifugação a 6000rpm e 4°C por 5min, congeladas em nitrogênio líquido logo em seguida e estocadas no Ultralow Temperature Freezer (NuAire) à -80°C. As células foram posteriormente ressuspensas com 800µL da solução-tampão 10mM Tris-HCl pH 8,0; 2% SDS; 400mM NaCl, 40mM EDTA; 0,3M acetato de sódio pH 5,0 e 10% (v/v) β-mercaptoetanol em H2O Milli-Q 0,1% DEPC. Após 4 ciclos de agitação por
inversão dos tubos 10 vezes intercalados por incubação em gelo por 10s, seguiu-se com a extração de RNA baseando no protocolo padrão de extração por fenol/clorofórmio (88). Foram realizadas duas extrações com fenol/clorofórmio 1:1, em um volume igual ao da solução a ser extraída, e uma lavagem com clorofórmio, também com o mesmo volume da solução a ser lavada. No primeiro passo de extração foi utilizado 400µL de cada reagente, mas no segundo passo foram utilizados 350µL de cada, pois foram coletados 100µL a menos da fase aquosa formada após a centrifugação, de forma a evitar contaminação pela fase orgânica. No passo de lavagem foi utilizado 600µL de clorofórmio. As fases foram separadas por centrifugação a 14000rpm e 4°C por 5min. Após a precipitação com 1:1 de cloreto de lítio 8M por 2h a
4°C, o RNA precipitado foi coletado por 40min de centrifugação a 14000rpm e 4°C. Foi feita uma lavagem com etanol absoluto, seguida de uma lavagem com etanol 70%. Os RNAs foram solubilizados em H2O
Milli-Q 0,1% DEPC. Todos os procedimentos foram realizados com utilização de luvas de procedimento sem pó e ponteiras com filtro estéreis e nuclease-free. As concentrações das soluções e as razões entre as absorbâncias 260nm/280nm e 260nm/230nm (como medida de qualidade das amostras de RNA) foram obtidas no NanoDrop 2200 (Thermo Scientific). A verificação da integridade do RNA foi feita em gel de agarose desnaturante 1,5% (89). Todas as amostras foram estocadas a -80°C até o momento da utilização.
3. Síntese de cDNA
Os RNAs totais extraídos foram tratados com RQ1 RNase-free DNase (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante, a partir de 1µg de RNA. O protocolo foi adaptado para 11µL de forma que 1µL pudesse ser utilizado para avaliar a persistência de DNA contaminante e também a existência de possíveis contaminantes nas soluções a serem utilizadas. O RNA tratado foi utilizado na síntese de cDNA segundo protocolo padrão da enzima SuperScript II (Invitrogen) e utilizando primer Oligo(dT)20
(Invitrogen). Também foi utilizado RNAseOUT (Invitrogen) quando recomendado. Para o controle negativo foi seguido o protocolo da reação de síntese de cDNA na ausência da transcriptase reversa utilizando a alíquota obtida após o tratamento com DNAse. Todos os procedimentos foram realizados com utilização de luvas de procedimento sem pó e ponteiras com filtro estéreis e nuclease-free. Todas as amostras permaneceram estocadas a -80°C até o momento da utilização.
4. PCR Quantitativo
As reações foram realizadas no sistema StepOnePlus com o kit SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Os valores de expressão foram normalizados em relação aos genes escolhidos como referência. A reação de qPCR foi realizada de acordo com o MIQE (90). Antes de iniciar o experimento foram calculados todos os volumes dos reagentes a serem utilizados em cada mix. Inicialmente foi preparado um mix para cada primer. Em seguida, para cada cDNA a ser analisado e para o controle negativo, foi preparado um mix contendo também SYBR Master Mix. Primeiro foram dispensados na placa a solução de primers em todos os poços para depois serem dispensados os mix com cDNA. Todo
cuidado foi tomado durante esse procedimento para que não houvesse contaminação de algum poço com primer ou cDNA indesejados. Os procedimentos foram realizados evitando exposição à luz e em gelo. Foram utilizadas luvas de procedimento sem pó, ponteiras com filtro estéreis e nuclease-free e pipetas recém-calibradas, em um ambiente limpo onde nunca foi trabalhado com amplicons de genes de
C. reinhardtii. É importante ressaltar que cada nova ponteira foi pré-lavada aspirando e dispensando uma
vez o volume a ser utilizado antes de aspirar a alíquota e nenhuma ponteira foi utilizada mais de seis vezes.
5. Preparo das bibliotecas para RNA-Seq
As bibliotecas foram preparadas por meio do TruSeq RNA Sample Preparation kit (Illumina) segundo instruções fornecidas pelo fabricante. Basicamente, o RNA mensageiro (mRNA) foi purificado a partir de 1 a 10µg de RNA total utilizando Sera-Mag Magnetic Oligo(dT) Beads (Thermo Scientific), e então fragmentado na presença de cátions divalentes sob elevadas temperaturas. Após isso, foi sintetizada a fita complementar de cDNA a partir dos fragmentos de mRNA utilizando random hexamer primers (Invitrogen) e a enzima transcriptase reversa SuperScript II (Invitrogen). A segunda fita de cDNA foi sintetizada utilizando as enzimas DNA polimerase I e RNase H. Em seguida, as enzimas T4 DNA
polimerase e Klenow DNA polimerase foram utilizadas para obtenção de extremidades abruptas nesse
cDNA. Uma adenina foi então adicionada à extremidade 3’ dessas moléculas utilizando a enzima Klenow
exo-. Em seguida, foram ligados adaptadores com uma timina overhang para amplificação e
sequenciamento do cDNA. Os fragmentos de 200 a 300bp, correspondentes ao cDNA ligado aos adaptadores, foram separados dos adaptadores não ligados através de eletroforese em gel de agarose e posterior purificação da região referente a esses tamanhos de fragmento. Finalmente, as bibliotecas foram enriquecidas através de 15 ciclos de PCR utilizando primers complementares às sequencias dos adaptadores. A concentração e a qualidade das bibliotecas foram aferidas utilizando o fluorômetro Qubit (Invitrogen) e o sistema de eletroforese capilar Experion (Bio-Rad).
6. Sequenciamento de mRNA total em larga escala
Os sequenciamentos em larga escala para obtenção de transcriptomas (RNA-seq) foram realizados na
Norte (Carolina Center for Genome Sciences) em Chapel Hill, sob a coordenação do pesquisador Dr. Piotr Mieczkowski. Para cada biblioteca, foram realizados 36 ciclos de sequenciamento single end x 50bp, utilizando a versão 3.0 do equipamento HiSeq2000 (Illumina).
7. Processamento dos reads
A ancoragem das sequências obtidas por RNA-Seq foi realizada pela equipe de bioinformática do Laboratório de Genômica e Expressão (LGE - Instituto de Biologia/UNICAMP). Os reads foram alinhados contra a versão 4.3 da predição gênica de C. reinhardtii produzida pelo JGI (Joint Genome Institute) e disponibilizada no portal público Phytozome v8.0 (http://www.phytozome.net/chlamy). Essa predição inclui a anotação através da atualização 10.2 do Augustus a partir da montagem v4.0 do genoma e contém ao todo 17.114 loci preditos para transcritos codificadores de proteínas. O alinhamento foi feito por meio do programa SOAP2 Aligner (91), configurado de forma a permitir até dois mismatches, descartar as sequências com base nitrogenada desconhecida (“N”) e retornar todos os alinhamentos ótimos. Os reads mapeados em mais de uma posição na referência também foram descartados. O nível de expressão de cada gene foi estimado usando o valor FKPM (Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments
mapped), que corresponde à normalização da quantidade de reads mapeados com o tamanho do
transcrito sem os íntrons (em kilobases) e com o total de reads mapeados na biblioteca (92). Dessa forma, o nível de expressão de genes dentro de uma mesma biblioteca e em bibliotecas diferentes passa a ser comparável. Para comparar o número de reads alinhados a cada transcrito entre os diversos momentos do time course e o momento de referência, foi usado o script baySeq (93) para o software R (94). Esses resultados foram filtrados com um valor de cut-off de 0,01 aplicado sobre o false discovery
rate (FDR), de forma a identificar os genes diferencialmente expressos estatisticamente significativos.
8. Anotação dos genes preditos de C. reinhardtii
As sequências das proteínas de C. reinhardtii preditas com a versão 4.3 do genoma (JGI) foram anotadas com auxílio do programa Blast2GO PRO v2.5.1 (95-97), mais especificamente a opção de 3072Mb. Inicialmente, as sequências preditas foram comparadas com o banco de dados de proteínas disponível no National Center for Biotechnology Information (NCBI) do National Institutes of Health (NIH) por meio de uma busca com a ferramenta BLASTX (Basic Local Alignment Search Tool;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi; 98). O programa foi configurado para armazenar os 50 melhores hits com e-value menor ou igual a 0,001. Em seguida, o algoritmo de mapeamento realizou buscas em vários bancos de dados para identificar e recuperar Gene Ontologies (GO; 99,100) associadas aos melhores hits obtidos após o BLAST. O pool de termos de GO candidatos foi avaliado baseando na similaridade dos hits e códigos de evidência de anotação manual para designar a anotação mais específica possível para cada sequência original usando as regras de anotação padrões do programa. Adicionalmente, foram buscadas informações de domínios/motif para cada sequência e os resultados foram assimilados aos termos de GO já anotados para as mesmas. Também foram anotados os Enzyme Code numbers (EC) relativos a cada sequência, permitindo que elas fossem associadas a um mapa do KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Para finalizar, as anotações foram refinadas no Blast2GO usando a ferramenta Annex e gerando GO-Slims com base nos bancos de dados genérico e de plantas. Nas análises de enriquecimento, os termos foram filtrados pelo FDR de valor 0,05.
RESULTADOS
1. A linhagem CC-1009 wild type é sincronizável e responsiva à rapamicina
Os indivíduos da espécie C. reinhardtii são conhecidos pela capacidade de sincronização da divisão celular por toda a cultura quando a mesma é submetida a um fotoperíodo (24). Para reproduzir esse fenômeno em laboratório, foram inoculadas 1,0x105 cél/mL em 100mL de meio TAP em triplicata. A cultura fonte do inóculo apresentava 5,0x106 cél/mL e foi mantida sob fotoperíodo de 12h/12h de claro/escuro por pelo menos 3 dias. As três culturas foram incubadas a 30°C, 100rpm e fotoperíodo de 12h/12h de claro/escuro com iluminação de 100µmol fótons.m-2s-1 no período de luz. Após 0h, 12h, 24h, 36h e 48h, foram retiradas alíquotas dessas culturas para contagem de células utilizando o Countess®
Automated Cell Counter (Invitrogen). Para cada medição foi construído um gráfico com a distribuição do
número de células com tamanho de 1 a 20µm (Figura 10). Ao lado do gráfico está representado a concentração celular no momento específico e um quadrante da foto analisada pelo programa Countess
0h 12h 24h 36h 48h 1,2x105 cél/mL 1,3x105 cél/mL 5,3x105 cél/mL 6,3x105 cél/mL 1,7x107 cél/mL Figura 10 | Reprodução da sincronização da divisão celular na linhagem CC-1009 wild type de C. reinhardtii. Alíquotas de três culturas sob fotoperíodo de 12h/12h de claro/escuro foram analisadas no contador de células Countess (Invitrogen) após 0h, 12h, 24h, 36h e 48h do inóculo. À esquerda se encontram as distribuições do número de células para cada tamanho. Uma linha vermelha foi traçada acima do tamanho médio das células na cultura. À direita está representado um quadrante da foto analisada na contagem e a concentração celular no momento.
Durante as 12h de iluminação em ambos os dias de experimento ocorre um aumento do tamanho médio das células sem haver, no entanto, aumento significativo do número de células. Em seguida, durante as 12h sem iluminação ocorre divisão celular por toda a cultura, aumentando a quantidade de células e, consequentemente, gerando células de tamanho menor. Pode-se notar pelas fotos que as células após 12h e 36h se encontram no fim da fase de crescimento devido à parede celular mais espessa e uma maior opacidade quando comparadas às células recém-geradas após 0h, 24h e 48h. Portanto, um ciclo celular decorre em 24h, ocorrendo captação de energia da luz e aumento de volume nas primeiras 12h e divisão celular em algum momento das 12h seguintes seguidas de um período de intérfase.
Em seguida, a atividade do antibiótico rapamicina foi testada utilizando culturas de C. reinhardtii em meio sólido. Cinco placas de Petri contendo meio TAP sólido foram preparadas. A primeira constituiu o controle, a segunda representou uma tentativa de estimular o crescimento utilizando 10µg/mL do aminoácido leucina (101) no meio de cultura e as outras três fizeram parte do grupo tratamento, em que foram utilizados 100nM, 200nM e 500nM de rapamicina. Em cada uma delas foram inoculadas 10µL de duas diluições diferentes de uma cultura com concentração de 1,0x107 cél/mL: uma diluição de 100x e outra de 1000x. As placas foram incubadas a 30°C sob luz constante por um período de 7 dias.
O crescimento das culturas foi registrado com uma câmera fotográfica depois de decorridos 4 e 7 dias do inóculo (Figura 11). Foi possível observar atividade do antibiótico, já que o crescimento foi diferente da cultura controle, sendo mais acentuado à medida que a concentração de rapamicina aumentou. O resultado também corrobora o fato de que a rapamicina não mata ou inviabiliza as células, mas apenas retarda seu crescimento. Quanto ao estímulo com leucina não foi observada alteração do crescimento da cultura em comparação ao controle. Caso esse aminoácido exerça algum tipo de influência no crescimento das células, ele o faz em um nível que não pode ser captado nesse tipo de teste.
O desenvolvimento de culturas tanto em meio TAP quanto em meio TAP contendo rapamicina (RAP) foi analisado também em meio líquido. O intuito foi de encontrar o momento certo para iniciar o tratamento com o antibiótico de tal forma que a quantidade de células tratadas permitisse a obtenção de material suficiente para extração de RNA. Além disso, esse experimento permitiu observar se haveria inibição do estímulo da rapamicina devido a uma quantidade muito grande de células, que poderia resultar em uma ação insuficiente do antibiótico.
Para isso, foram retiradas alíquotas de uma cultura de referência após intervalos de tempo distintos que foram em seguida submetidas ao tratamento com o antibiótico. Mais especificamente, células C.
reinhardtii sincronizadas foram inoculadas em 240mL de meio TAP a uma concentração final de 4,0x104
cél/mL e incubadas a 30°C, 100rpm e iluminação constante de 100µmol fótons.m-2s-1. Após 1,5; 2,5 e 3,5 dias foram extraídos 60mL da cultura e esse volume foi tratado com 500nM de rapamicina, enquanto o restante permaneceu como cultura controle. Alíquotas de 1mL foram retiradas de todas as 4 culturas a cada 12h até que se completassem 6 dias do inóculo inicial. Imediatamente depois de retiradas essas alíquotas, a absorbância a 750nm foi determinada por espectrofotometria e o número de células foi contado em Câmara de Neubauer. Todo o experimento foi feito em triplicata e os dados de concentração celular e de absorbância (Figura 12) foram plotados em função do tempo.
Figura 11 | Averiguação da atividade do antibiótico rapamicina na linhagem CC-1009 wild type de C. reinhardtii. Alíquotas de uma cultura foram submetidas a diluições de 100 e 1000 vezes e foram inoculadas em placas com meio TAP sólido contendo as concentrações indicadas de leucina ou rapamicina. As placas foram fotografadas 4 e 7 dias após o início da incubação sob iluminação contínua. 4 dias :10 :100 7 dias :10 :100 Rapa 100nM Referência Leu 10g/mL Rapa 200nM Rapa 500nM
Figura 12 | Curvas de crescimento de C. reinhardtii em meio de cultura tratado e não tratado com rapamicina. O desenvolvimento da cultura de referência e de três alíquotas dessa cultura, retiradas após 1,5 dias, 2,5 dias e 3,5 dias e tratadas com rapamicina, foi analisado em triplicata biológica. O número de células foi contado em Câmara de Neubauer a cada a cada 12h durante 6 dias (esquerda) juntamente com a medição densidade óptica a 750nm em espectrofotômetro (direita).
