O intuito deste estudo foi compreender a regulação exercida pela Via da TOR sobre a expressão gênica global em C. reinhardtii, no direcionamento do metabolismo celular e no controle do crescimento. Foram abordados três aspectos principais: a centralização da resposta para produção de TAG após a inibição da via da TOR, a possibilidade dessa via exercer controle sobre o ciclo celular e o nível de regulação da expressão de reguladores da transcrição.
A primeira hipótese abordada é se a inibição dessa via seria capaz de gerar uma resposta centralizada na produção de TAG ou se a situação de estresse culminaria na ativação de várias outras vias resultando na produção de uma diversidade de metabólitos. Com relação à expressão gênica o quadro principal sugere que o metabolismo está direcionado para o estoque de carbono em moléculas mais simples não nitrogenadas (Figura 43). Foi visto que a regulação da via da TOR de forma negativa resulta na maior síntese de amido inicialmente (Figura 31) e na produção de TAG ao longo de todo o ciclo (Figura 33). Nessa situação, a biogênese de ribossomos (Figura 39 e Figura 40) e a expressão de fatores de iniciação e de elongação da tradução (Figura 41) se encontram inibidas, indicando que a síntese de proteínas está comprometida e que as células não estão dispendendo energia nesse sentido nem desviando a utilização de moléculas de carbono para esse fim. A síntese de nucleotídeos também é reprimida (Figura 35) e todos esses resultados são corroborados pelo enriquecimento de termos de GO
(Tabela 8), permitindo inferir que as células estão direcionando o metabolismo no sentido de produção e acúmulo de TAGs.
No entanto, ao mesmo tempo se observa um maior estímulo de atividades catabólicas com intuito de gerar energia, como no ciclo do ácido cítrico (Figura 36). A partir desse ciclo, é gerado energia na forma de poder redutor acumulada em moléculas de NADH. Essa energia é convertida em ATP através da fosforilação oxidativa (124). Assim, o maior estímulo para a síntese de proteínas envolvidas na fosforilação oxidativa corrobora esses dados (Figura 38). Também é observada uma possível diminuição no consumo de acetato disponível no meio (Figura 37) e consequente diminuição da síntese de ácidos graxos (Figura 32). Isso indica que mais energia está sendo gasta para manutenção da célula se comparado com a situação normal. Caso esse desvio para a produção de outros metabólitos não ocorresse, mais energia ainda seria disponibilizada para ser estocada na forma de TAGs. Foi observada também uma menor taxa fotossintética como consequência da redução da expressão de genes envolvidos na fixação de carbono (Figura 29), na formação dos complexos antena e fotossintético (Figura 30) e na síntese de clorofila (Tabela 8). A maior produção de TAGs durante a inibição da via da TOR contribui com o aumento da eficiência do processo de acúmulo, mas o gasto de energia para manutenção do metabolismo é um fator que impede que essa eficiência seja mais alta ainda. O balanço final acaba sendo um pouco prejudicado, no entanto, não se sabe em qual extensão.
Dessa forma, é observado um direcionamento do metabolismo para a produção de TAGs durante a inibição da via da TOR. Entretanto, essa não é uma resposta totalmente centralizada, já que também ocorrem reações catabólicas não ligadas à síntese desse tipo de molécula. É importante ressaltar que essa é uma análise baseada apenas nos níveis de expressão dos genes envolvidos em cada via e pode não refletir exatamente os metabólitos que estão sendo produzidos. Idealmente, o próximo passo deve ser identificar tais metabólitos por metaboloma, o que permitirá inferir de forma mais exata sobre o direcionamento das vias (125). Esse tipo de quantificação também permitirá quantificar a perda na forma de outros metabólitos devido a esse direcionamento parcial para a síntese de TAGs e descobrir a influência sobre a eficiência final do processo de acúmulo desses compostos. Mesmo assim, sua síntese ainda parece estar favorecida, já que a resposta celular em situação de estresse é estocar moléculas de carbono (116).
A segunda questão central neste trabalho é se o controle do crescimento pela via da TOR se daria apenas pela regulação do balanço entre anabolismo e catabolismo ou se também haveria algum tipo de influência no progresso no ciclo celular. Através dos resultados obtidos com relação à regulação das vias
Figura 43 | Modulação das principais vias metabólicas na condição controle e durante a inibição da via da TOR. Os esquemas representam o direcionamento do metabolismo que pode ser inferido a partir dos níveis gerais de expressão gênica para cada uma das nove vias metabólicas. Acima estão as análises na condição normal e abaixo as análises na inibição da via da TOR. À esquerda estão representadas as respostas inicias e à direita as respostas tardias. As setas azuis e vermelhas indicam, respectivamente, aumento e redução da expressão dos genes envolvidos no processo, enquanto as setas pretas indicam a não ocorrência de alteração de expressão com relação ao momento de referência (5min não tratado). A largura da seta é proporcional à intensidade da alteração na expressão gênica.
TAP – Early Response TAP – Late Response
metabólicas é evidente que a via da TOR está intrinsicamente ligada ao controle do metabolismo. Além disso, alguns dos dados obtidos sugerem a ocorrência de certo atraso no progresso do ciclo celular como resposta à inibição da via da TOR. Somente a partir das 12h no tratamento, os termos de GO relacionados ao ciclo celular passam a estar enriquecidos dentro do grupo de genes com aumento de expressão (Tabela 8). Até esse momento esses GOs sempre se encontravam enriquecidos entre o grupo de genes cuja expressão foi regulada negativamente. Isso indica que ocorre um aumento de expressão de genes relacionados ao controle do ciclo celular na condição controle até às 12h, momento a partir do qual uma maior quantidade desses genes passa a estar mais expresso no tratamento. Além disso, termos relacionados com cromatina, nucleoplasma, metabolismo de DNA e montagem de nucleossomo estão pouco representados dentre os genes que sofreram aumento em sua expressão. Apenas após 24h esses termos aparecem enriquecidos dentro do grupo de genes mais expressos. Nesse momento também é observado baixa representatividade de termos envolvidos com a fase mitótica e com a citocinese dentre os genes com expressão diminuída. Tais resultados permitem concluir que o processo de duplicação do DNA sofre um atraso no tratamento em comparação à condição normal, e o mesmo se aplica para eventos relacionados à fase mitótica e à posterior separação das células filhas. Fica claro o atraso do desenvolvimento do ciclo celular como resultado da inibição da via da TOR.
Outros dados também reforçam a hipótese da influência da via da TOR no progresso do ciclo celular. Foi encontrado que a inibição dessa via compromete o desenvolvimento da fase G1 (Figura 42). Os níveis de expressão de componentes de um complexo inibitório formado pela proteína retinoblastoma, responsável por regular o progresso nessa fase, foram mais altos nessa situação. Acompanhando esse ocorrido, três fatores promotores da fase G1 tiveram sua expressão reprimida e apresentaram quantidade de transcritos geralmente inferior à condição normal ao longo do tempo. Esses fatores são ciclinas D, que constituem exatamente os alvos finais da sinalização inibitória promovida pelo complexo retinoblastoma (120). Tais fatos indicam que a inibição da via da TOR estimulou essa cascata de sinalização resultando na inibição de fatores que controlam a fase G1. Portanto, sugerem que a via supracitada também está envolvida no controle do ciclo celular. Para verificar se os meios pelos quais ela realiza esse tipo de controle são diretos ou indiretos seria necessário desenvolver um estudo mais específico que proporcionasse o entendimento da regulação do complexo retinoblastoma. Entretanto, esse nível de compreensão não foi alvo deste trabalho.
Uma análise da alteração da expressão dos reguladores da transcrição também fornece fortes indícios da inibição da via da TOR resultar em atraso no avanço do ciclo celular (Tabela 9). Ao avaliar os diversos reguladores transcricionais com função relacionada ao ciclo celular, à transição entre fases no ciclo celular e ao desenvolvimento, nota-se que muitos deles (44 dentre os 75 presentes ao todo nesses grupos) sofrem alteração considerável no padrão de expressão ao longo do tempo em relação à condição normal. Sendo assim, é possível inferir que a via da TOR não apenas exerce influência sobre o ciclo das células, como também é responsável por interferir amplamente nos genes envolvidos nesse quesito (126).
Por fim, a terceira questão central é acerca da extensão da relação entre a expressão de fatores de transcrição e sua regulação pela via da TOR. A análise visou esclarecer se essa via exerce influência sobre um grupo limitado de reguladores da transcrição ou se essa influência acaba se estendendo por todos eles. Foi encontrado que 45 das 52 famílias de genes codificadores de reguladores da transcrição exibem um padrão de expressão gênica notavelmente diferente na situação em que a via da TOR está reprimida (Tabela 9). Essa alteração engloba 60% (222 de 367 genes analisados) dos genes presentes nessas 45 famílias. O fato da maioria das famílias ser influenciada por essa repressão revela que tal via exerce influência sobre uma diversidade de funções celulares além do crescimento e sensibilidade a nutrientes (54) e, portanto, ela deve ser capaz de controlar o metabolismo celular de uma forma geral.