Acompanhamento do crescimento

Técnicas utilizadas para estimar a densidade em células/mL:

6.1-Dissolução da mucilagem com sonicador (utilizada em culturas de Merismopedia sp.,

Microcystis novacekii):

Em um tubo de centrífuga são acrescentados 3 ml de cultura fixada com Lugol. Agita- se o tubo por 1 minuto no Vortex. A amostra é então sonicada a uma amplitude de 23%, em 3 pulsos de 20 segundos, e intervalo de 1 minuto entre cada pulso. As amostras foram mantidas no gelo para resfriamento durante o processo (Mc Alice 1971).

Posteriormente, este método foi modificado passando a ser realizado em 2 pulsos de 20 segundos, com intervalo de 1 minuto, à mesma amplitude.

6.2-Digestão de mucilagem por NaOH (utilizada em culturas de Microcystis novacekii): Para colônias com muita mucilagem, acrescenta-se em um tubo de centrífuga 1 mL de NaOH (1 M) e 2 mL de amostra. Coloca-se o tubo em banho maria a 60°C durante 10 minutos. Para colônias com pouca mucilagem, acrescenta-se em um tubo de centrífuga 1 mL de NaOH (1 M) e 2 mL de amostra. Coloca-se o tubo em banho-maria a 80°C durante 5 minutos (Box 1981).

Após ser submetida a um dos processos listados acima, a amostra é colocada no Vortex por 30 segundos e dela são retirados 3 µL, os quais são colocados em uma câmara de Fuchs-Rosenthal, própria para contagem. São contadas todas as células presentes nos campos até que se obtenha 400 células. A partir dos valores de densidade obtidos pode- se construir a curva de crescimento (Mc Alice 1971).

Resultados

Até o momento, foram mantidas as culturas monoalgais já existentes de Merismopedia sp.,

Microcystis novacekii, Microcystis protocystis, Cylindrospermopsis raciborskii e foi

acrescentada uma cultura de Sphaerocystis sp., recentemente isolada pelo método da micropipetagem sob microscópio invertido.

O monitoramento semanal através de lâminas de culturas revelou variações na morfologia de Microcystis novacekii: as colônias podem estar na sua forma característica, ou seja, esferoidais e com as células densamente concentradas no centro e bem delimitadas por mucilagem (Komárek et al.2002), ou apresentar células bastante dispersas no meio, com

pouca mucilagem.

De forma semelhante, em lâminas de Microcystis protocystis foram observadas variações na disposição das células no período compreendido entre Março e Julho de 2006, as células se encontravam distribuídas de duas em duas no interior da mucilagem. Fora deste período, as células se encontravam distantes e irregularmente distribuídas na mucilagem (Komárek et al.2002).

Após o isolamento, as células de Sphaerocystis sp. deixaram de formar colônias. Decorrido um mês, voltaram à formação colonial esférica e compacta, características do gênero (Sant’ Anna 1984).

Com relação às técnicas para o monitoramento do crescimento, a digestão de mucilagem (pouca mucilagem) por NaOH mostrou-se mais eficiente para Microcystis novacekii (Fig. 1), já que as contagens de células obtidas a partir de amostras que eram submetidas ao sonicador mostravam-se discrepantes em relação ao esperado, ou seja, não refetiam o crescimento linear das culturas. Conseqüentemente, as curvas de crescimento obtidas não correspondiam à real situação das algas, (Fig. 2).

Figura 1: Curva de crescimento de Microcystis novacekii, submetidas à técnica de digestão de mucilagem por NaOH. Linha azul: crescimento observado. Linha preta: crescimento esperado.

Figura 2: Curva de crescimento de Microcystis novacekii, submetidas à técnica de dissolução de mucilagem pelo sonicador. Linha azul: crescimento observado.

Linha preta: crescimento esperado.

Verificou-se pela contagem de células da cultura de Merismopedia sp, o aumento da densidade e um crescimento positivo e significativo (Fig.3).

y = 0,0979x - 3808,8 R2 _{= 0,9843} 6,5 6,6 6,7 6,8 6,9 7 7,1

28/set 29/set 30/set 1/out 2/out 3/out 4/out 5/out Dias

Log10 da

densi

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Figura 3: Densidades de Merismopedia sp. em meio líquido.Linha azul: crescimento observado. Linha preta: crescimento esperado.

Ainda se encontram em processo de isolamento culturas de Microcystis sp.(WC),

Microcystis natans, Microcystis sp. (ASM-1), contaminadas por outra cianobactéria sem

aerótopos, ainda não identificada, que durante certo período mostrou-se dominante na cultura e as colônias deixaram de flutuar com a mesma facilidade.

As culturas de Microcystis sp.2 se encontram contaminadas com Microcystis protocystis. A técnica de lavagens sucessivas dos fragmentos coloniais em meio estéril está

contribuindo para o isolamento da alga: já são observadas maiores formações coloniais desta espécie em detrimento das colônias de Microcystis protocystis.

A técnica de lavagem por centrifugação, segundo Tavares et al. 2001, não se mostrou satisfatória, resultando em considerável mortalidade de células.

A técnica de lavagem por meio de centrifugação, segundo Vieira 1977, não isolou completamente as algas, mas contribuiu para minimizar o número de células contaminantes no sobrenadante, onde predominaram Microcystis. No meio onde foi inoculado o precipitado, predominou a cianobactéria contaminante, que também está sendo isolada. O método da pipeta capilar sob microscópio invertido se mostrou viável para o isolamento das colônias após a centrifugação.

A centrifugação mostrou-se eficiente, pois minimizou também a ocorrência de colônias de bactérias e fitoflagelados nas culturas.

Uma cultura não monoespecífica de Scenedesmus sp., que estava sendo mantida desde 2004, passou a apresentar dominância de Sphaerocystis sp. a partir de Maio de 2006, e desde então, exemplares de Scenedesmus sp. não foram mais encontrados nas amostras dessa cultura.

Uma amostra da cultura de Merismopedia sp. foi submetida à técnica de centrifugação, segundoTavares et al. 2001. Após o processo, foram encontradas as microalgas, zooflagelados e também bactérias, provenientes da cultura original. Decorridos 12 dias do plaqueamento de Merismopedia sp. em meio sólido, percebeu-se o crescimento de colônias verdes, correspondentes as algas e colônias brancas, correspondentes as bactérias. Ocorreu o crescimento de Merismopedia sp. em 11 tubos Ependorff®, e a posterior análise deles em microscópio ótico revelou a presença de bactérias, zooflagelados e Merismopedia sp. em todas elas. Nas placas expostas à luz U.V. não se verificou nenhuma colônia de bactéria ou da microalga após o 12° dia de incubação. O meio que recebeu o tratamento com antibiótico não apresentou bactérias no material precipitado, enquanto no sobrenadante foram vistas algumas bactérias, Merismopedia sp. e zooflagelados

Discussão

Foram observadas variações morfológicas temporárias macroscópicas e/ou microscópicas em algumas culturas. Estas modificações podem ter sido provocadas pelas condições e processos utilizados no cultivo, ou podem refletir variações fisiológicas inerentes às espécies de algas.

A espécie Scenedesmus sp. mostrou-se uma competidoras ineficiente em relação a

Sphaerocystis sp., nas condições em que se encontram no cultivo, já que Sphaerocystis sp.

tornou-se a espécie dominante na cultura, e acabou por eliminar Scenedesmus sp.

foi monitorado através de contagens. O método mais largamente utilizado é o descrito por Üthermol, onde são contados o número de indivíduos ou colônias por mililitro. Este método, no entanto, mostrou-se inadequado aos propósitos desta contagem, cujo objetivo

era estimar o número de células por mililitro. Algas dos gêneros Microcystis e

Merismopedia formam colônias unidas por mucilagem, o que dificulta a contagem das células individualmente. Utilizou-se então o método de contagem descrito por Mc Alice 1971. Para que a mucilagem fosse rompida, as alíquotas destas culturas destinadas à contagem foram submetidas à dissolução da mucilagem através do sonicador. Suspeitou-se que este método poderia...estar destruindo as células, o que levou à adequação de 2 pulsos durante a sonicagem e não mais 3, como determinado no protocolo. Paralelamente a isso, novas alíquotas foram submetidas à digestão de mucilagem por NaOH, método este que se mostrou mais confiável, pois as contagens e curvas de crescimento correspondentes se mostraram mais próximas do previsto. As células das amostras submetidas a este processo tornam-se mais translúcidas, mas não afetam a contagem.

Com relação às técnicas de isolamento, as lavagens sucessivas em meio estéril se mostraram eficientes para o isolamento de organismos coloniais que apresentam diferenças macroscópicas entre as colônias. As centrifugações por si só não proporcionam o isolamento, mas contribuem significativamente para a separação das espécies presentes no meio. Essa separação, possivelmente, se dá em função da diferença de densidade entre algas com aerótopos (Microcystis), que permaneceram em maior número no sobrenadante e algas sem aerótopos (contaminante), que predominaram no precipitado. As técnicas de centrifugação encontradas na literatura anteriormente referidas sofreram algumas adaptações (número de centrifugações e rotações por minuto), de modo a atingir resultados satisfatórios, evitando a mortalidade exagerada das algas durante o processo. A centrifugação mostrou-se um método interessante para limpar culturas muito povoadas por bactérias, fito e zooflagelados, pois ocorreu significativa diminuição desses organismos após o processo.

A micropipetagem se mostra eficiente apenas em situações onde a densidade de contaminantes é menor se comparada à densidade da cultura a ser isolada, e isso pode ser obtido com auxílio da centrifugação.

Em agosto de 2006, deu-se início ao projeto piloto do estudo genético da alga

Merismopedia sp. Como as culturas mantidas no laboratório não são axênicas, houve o

receio de que o material genético das bactérias presentes na cultura pudesse interferir nos resultados das análises moleculares. A fim de eliminar as bactérias foram testadas as técnicas de purificação descritas. Dentre as técnicas empregadas, apenas a utilização de antibiótico acoplada a centrifugação mostrou-se eficaz na eliminação das bactérias. Estudos sobre cianobactérias encontrados na literatura (Lorenzi 2004; Roseto et al 2000; Oliveira 2003) mostram ser possível a detecção de algas tóxicas em culturas não axênicas, utilizando-se a técnica de PCR com primers específicos para genes produtores de cianotoxinas (Lorenzi 2004). Portanto, será dada continuidade à avaliação da possível

citotoxicidade das algas Merismopedia sp., utilizando-se as culturas não axênicas. Conclusões e Perspectivas

Este subprojeto viabiliza a manutenção do cultivo algológico do Laboratório de Limnologia (ICB-UFMG) e possibilita a ampliação deste Banco de Algas. Com a infra- estrutura disponível já é possível fornecer boas culturas para a realização de estudos moleculares e fisiológicos com as algas cultivadas. Espécies isoladas já estão sendo utilizadas como organismos-teste em pilotos de pesquisas com pesticidas organofosforados e metais pesados. Assim, esperamos ser possível o desenvolvimento de projetos aplicados, capazes de gerar produtos e soluções seguras para os problemas ambientais atuais.

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ATIVIDADE 18

AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DAS ÁGUAS NA BACIA DO MÉDIO RIO DOCE