ACOPLAMENTO DA TÉCNICA DE RING
OVEN E SERS (ROP-SERS):
MONITORAMENTO DE BASES
PURÍNICAS EM DNA
4.1 Motivação
O preparo de amostras em métodos analíticos quantitativos, visando à análise de traços, inclui com frequência uma etapa de pré-concentração. Essa etapa torna- se necessária devido à falta de sensibilidade e/ou seletividade da técnica de detecção utilizada. Como resultado, uma grande variedade de métodos de pré- concentração tem sido proposta, tais como extração em ponto de nuvem [101], microextração líquido-líquido [102], extração em fase sólida [103], pré-concentração por ring oven [104], entre outras. Dentre esses métodos, a pré-concentração baseada na técnica de ring oven (ou ROP, do inglês Ring Oven Preconcentration) é particularmente interessante devido à sua simplicidade, portabilidade e características ecológicas. A técnica de ring oven foi introduzida pela primeira vez por Weisz em 1954 [105], e após algumas melhorias (e.g. sua combinação com a análise de toque, do inglês spot test analysis) [106,107], foi utilizada em ensaios químicos qualitativos. ROP é baseada na difusão de amostras líquidas por capilaridade desde o centro do papel de filtro como uma mancha, enquanto o solvente evapora, deixando os compostos não voláteis no papel. Desta forma, o analito pode ser arrastado, depositado e concentrado nas bordas da mancha assumindo a forma de um anel, que possui um volume significativamente menor que o volume inicial de amostra [105]. O uso da técnica de ring oven em análises quantitativas também foi proposta por Weisz e consiste simplesmente na comparação das intensidades das cores produzidas no anel após uma reação química colorida [108,109]. Entretanto, são reportadas um número muito reduzido de aplicações quantitativas dessa técnica, sendo principalmente destinadas à determinação de íons inorgânicos [104].
Recentemente, tornou-se possível o acoplamento da técnica de ring oven com técnicas microanalíticas modernas, como resultado da sua capacidade de analisar áreas pequenas de amostras sólidas (e.g. espectroscopia Raman, fluorescência de raios X, NIR, LIBS, etc.). Assim, ROP foi utilizada com sucesso na determinação de íons metálicos [104] e detergentes [110] empregando LIBS (Laser-Induced Breakdown Spectroscopy) e espectroscopia NIRS (Near InfraRed Spectroscopy) como técnicas de detecção, respectivamente. Apesar d esses acoplamentos apresentarem um ganho de sensibilidade significativo, os limites de detecção ainda foram consideravelmente maiores que os estimados empregando técnicas bem
estabelecidas, como ICP-OES e HPLC. Neste contexto, SERS apresenta-se como uma técnica microanalítica com o potencial para complementar as características apresentadas pela técnica de ring oven, podendo incrementar, por exemplo, a sensibilidade e especificidade na detecção de compostos orgânicos. Além disso, o procedimento de amostragem utilizado pelos substratos SERS baseados em papel (imersão na solução de analito) pode ser considerado ineficiente, pois é altamente dependente da migração do analito da solução até a nanosuperfície e da afinidade do analito com a mesma. Neste sentido, a técnica de ring oven poderia melhorar a eficiência do procedimento de amostragem em substratos SERS baseados em papel por meio do confinamento do analito e das nanopartículas em um volume reduzido.
O DNA é uma biomacromolécula presente nas células de todos os organismos vivos e desempenha um papel fundamental na codificação de proteínas e armazenamento do código genético. Como mostrado na Figura 27, o DNA é constituído por açúcares, fosfatos, bases purínicas [adenina (A) e guanina (G)] e bases pirimidínicas [citosina (C) e timina (T)]. As bases nitrogenadas de DNA participam em vários processos importantes nos organismos vivos, razão pela qual a mudança anormal das suas proporções pode indicar a deficiência do sistema imune ou a presença de doenças como câncer, Alzheimer, epilepsia e HIV [111–113]. Assim, o monitoramento das proporções em DNA pode ser de extrema importância no diagnóstico clínico e na prevenção de doenças. Em consequência, muitos métodos analíticos, principalmente baseados em cromatografia [114], eletroforese [115], eletroquímica [116] ou espectrometria de massas [117], têm sido propostos. No entanto, esses métodos envolvem em muitos casos o uso de instrumentação sofisticada, operações complexas e preparo de amostra demorado. Por este motivo, o uso de uma plataforma analítica SERS de papel, em conjunto com a técnica de ring oven, apresenta-se como uma alternativa interessante para o monitoramento rápido, sensível e de baixo custo de bases nitrogenadas em DNA.
Figura 27: Estrutura química do DNA contendo as bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). Adaptado da referência [118].
4.2 Objetivos específicos
Estudar as vantagens e limitações do acoplamento entre a técnica de ring oven e SERS;
Monitorar a proporção de bases nitrogenadas em DNA de bezerro empregando um método de adição de padrão e padrões internos.
4.3 Parte experimental e análise de dados
4.3.1 Equipamentos
Os espectros SERS foram coletados no equipamento Raman de bancada descrito no Capítulo 2 desta tese (laser emitindo radiação em 785 nm). As amostras foram expostas ao laser por 2 segundos em um total de 10 acumulações, a janela espectral foi de 350 a 1750 cm-1 com uma resolução de 2 cm-1, e a potência do laser
foi fixada em 50% da potência máxima nominal (250 mW). Adicionalmente, a imagem SERS foi obtida pelo mapeamento de uma região de 1,2 mm x 1,2 mm com
uma resolução de 0,05 mm e um tempo de exposição de 2 s em um total de 2 acumulações.
Os substratos SERS fabricados neste capítulo foram caracterizados por estudos FESEM. O equipamento FESEM e as condições experimentais para esses estudos foram as mesmas que às descritas no Capítulo 2.
4.3.2 Reagentes
Além dos reagentes utilizados no Capítulo 2 e 3, citosina, timina e DNA de bezerro foram obtidos da Sigma-Aldrich. Além disso, papel de filtro Whatman No 40 foi utilizado em todos os experimentos deste capítulo.
4.3.3 Sistema de pré-concentração baseada na técnica de ring oven
A Figura 28 mostra o sistema de preconcentração utilizado neste trabalho, que é similar ao proposto por Cortez et al. [104].Figura 28: Componentes do sistema de pré-concentração baseado na técnica de ring oven: (a) capilar de injeção, (b) peça metálica superior, (c) disco de papel de filtro, (d) peça metálica inferior com manta de aquecimento, (e) cabo do controlador de temperatura, (f e g) controlador de temperatura.
Este sistema consiste em duas partes cilíndricas de alumínio: a base (componente d da Figura 28) com uma manta de aquecimento em volta dela, e a parte superior (componente b da Figura 28) com um diâmetro adequado para encaixar-se na base metálica. Um disco de papel de filtro (componente c da Figura
28) é colocado e fixado exatamente entre as partes cilíndricas de alumínio. O sistema também possui um dispositivo de controle de temperatura (Contemp TMC 45, componentes f e g da Figura 28), com uma variação de ± 0,5 ºC, e uma plataforma de granito como suporte do forno. O capilar utilizado para carregar as soluções (0,25 mm de diâmetro) foi posicionado sobre o centro do disco de papel de filtro.
A operação do sistema seguiu as seguintes etapas: (1) o forno foi ligado e atingiu o equilíbrio na temperatura desejada, sendo que em todos os experimentos foi utilizada uma temperatura de 110 ºC. (2) Um disco de papel de filtro de três centímetros de diâmetro foi colocado entre a base e a parte superior de alumínio. (3) A amostra foi aspirada usando um sistema de injeção e o volume desejado foi coletado. (4) A solução foi depositada, gota a gota, no centro do papel de filtro com uma vazão de 50 ± 4 µL/min. (5) Após a deposição do volume desejado, o papel de filtro foi removido e esfriado. Todas as soluções foram preparadas em meio de água/etanol (50%, v/v) e as medidas SERS foram feitas empregando o espectrômetro Raman de bancada.
4.3.4 Síntese in situ de GNPs em papel de filtro
Como uma primeira estratégia de acoplamento ROP-SERS, a possibilidade de migração das GNPs através do papel de filtro para formar um anel foi avaliada. No entanto, a forte interação entre as GNPs e a celulose resulta na imobilização rápida das GNPs no centro do papel de filtro impedindo a formação do anel.
Para evitar a adsorção irreversível de GNPs no papel de filtro e promover a formação de um anel de GNPs, uma estratégia baseada na síntese in situ de GNPs em papel de filtro foi proposta pela primeira vez nesta tese. Para tal, os seguintes reagentes foram sequencialmente injetados no sistema de pré-concentração por ring oven: (1) 100 µL de solução de ácido tetracloroáurico, (2) 150 µL de solução de ácido clorídrico em pH 2, (3) 100 µL de solução de citrato de sódio, e (4) 300 µL de solução de hidróxido de sódio em pH 11. Neste procedimento, os volumes injetados foram fixos, e as concentrações de ácido tetracloroáurico e citrato de sódio variaram dependendo da massa final requerida para os estudos feitos sobre a síntese.
Três métodos diferentes para acoplar a técnica de ring oven e SERS foram avaliados:
Método 1. Síntese in situ de GNPs em papel de filtro seguida pela adsorção do analito através da imersão do substrato SERS em uma solução do mesmo por 30 min.
Método 2. Primeiro, a síntese in situ de GNPs em papel de filtro foi feita. Depois, a adsorção do analito no substrato SERS foi promovida via ROP de 300 µL de solução de analito formando um anel exatamente na mesma posição que o anel de GNPs formado.
Método 3. A pré-concentração de 300 µL de solução de analito foi feita. Depois, 0,5 µL de coloide de GNPs (sintetizadas no Capítulo 2 e pré-concentradas 200 vezes por centrifugação) foram depositadas diretamente na borda do anel de analito formado.
4.3.6 Determinação de bases purínicas em DNA de bezerro
Para quantificar bases nitrogenadas no DNA, a amostra de DNA de bezerro foi hidrolisada através da desnaturação, degradação e ruptura das ligações de hidrogênio em meio ácido. Este procedimento foi utilizado devido à sua simplicidade e porque não requer a inclusão de moléculas orgânicas adicionais na matriz (potenciais interferentes). Assim, 3 mg de DNA de bezerro foram pesados e colocados em um recipiente fechado de 10 mL. Depois, 1 mL de HCl (1 mol/L) foi adicionado e a mistura foi aquecida até aproximadamente 100 ºC por 60 min. Antes da sua análise empregando ROP-SERS, o pH da solução de DNA desnaturado foi ajustado com NaOH (0,5 mol/L) e a amostra foi diluída para obter a concentração de DNA desejada.
4.4 Resultados e discussão
A estratégia proposta para a síntese in situ de GNPs em papel de filtro consiste na formação de um anel de ácido tetracloroáurico para depois formar um anel de citrato de sódio na mesma posição, em uma temperatura fixa de 110 ºC, com o intuito de promover a redução do ouro(III). Dois parâmetros foram avaliados no estudo desta síntese: (i) a proporção em massa de citrato de sódio/ácido
tetracloroáurico (citrato/Au(III)) e (ii) as massas individuais de citrato de sódio e ácido tetracloroáurico em uma proporção fixa. O cristal violeta foi utilizado como analito de teste e os espectros SERS foram obtidos após a imersão do substrato SERS na solução do analito por 30 min. A Figura 29A mostra o espectro SERS de cristal violeta (1 µmol/L) com destaque na banda intensa característica localizada em 1176 cm-1, cuja intensidade foi utilizada como resposta SERS neste estudo. Na Figura
29B é apresentado o efeito da proporção em massa de citrato/Au(III) na resposta SERS, com uma massa de ácido tetracloroáurico fixa em 0,1 µg. A explicação desse comportamento é que o incremento na proporção citrato/Au(III) incrementa a probabilidade da reação de redução devido à proximidade dos reagentes no volume do anel. Neste sentido, a síntese de mais GNPs (geração de hot spots) leva ao incremento da resposta SERS; entretanto, um valor da proporção citrato/Au(III) maior que 5000 leva à diminuição do sinal como resultado do crescimento incontrolado das GNPs com formas irregulares. Assim, uma proporção de massa citrato/Au(III) de 5000 foi utilizada em todos os experimentos posteriores. Adicionalmente, o efeito das massas individuais utilizadas de citrato de sódio e ácido tetracloroáurico foi estudado empregando a proporção selecionada. Este estudo foi feito visando a geração de um grande número de GNPs em um mesmo volume, o volume do anel, o que poderia levar à geração de um grande número de hot spots e, consequentemente, o aumento da sensibilidade. O monitoramento da resposta SERS mostrado na Figura 29C corrobora esse comportamento esperado; entretanto, o excesso de reagentes acumulados no anel levou à deformação do mesmo causando a diminuição na repetibilidade das medidas. Portanto, com base nesses resultados, as massas utilizadas para a síntese in situ de GNPs no papel de filtro foram de 0,2 µg de ácido tetracloroáurico e 1 mg de citrato de sódio (proporção citrato/Au(III) de 5000).
Figura 29: (A) Espectro SERS de cristal violeta (1 µmol/L) obtido no substrato SERS de papel após a síntese in situ de GNPs. (B) Efeito da proporção citrato de sódio/ácido tetracloroáurico na resposta SERS com a massa de ácido tetracloroáurico fixa em 0,1 µg. (C) Efeitos das massas individuais de citrato de sódio e ácido tetracloroáurico na resposta SERS com a proporção de citrato de sódio/ácido tetracloroáurico fixa em 5000.
Como mostrado na Figura 30A, a síntese in situ de GNPs no papel de filtro nas condições selecionadas resultou na formação de um anel bem definido. Além disso, a caracterização por estudos FESEM (Figura 30B) mostrou que GNPs quase- esféricas foram obtidas com um diâmetro médio de 122 ± 25 nm (N=100), demonstrando a viabilidade da síntese in situ de GNPs em papel de filtro, reportada pela primeira vez nesta tese. Entre as vantagens do método de síntese proposto podem-se destacar a sua rapidez (aprox. 13 min), a ausência de resíduos gerados, e o fato de não requerir o armazenamento de coloide para sua posterior deposição nos substratos de papel. Entretanto, algumas das suas limitações são a geração irregular de hot spots e a ampla variedade de tamanhos de partícula (RSD de aprox. 21%) quando comparada à síntese de GNPs coloidais (RSD de aprox. 13%).
A Figura 30 C mostra os espectros obtidos em diferentes partes do substrato SERS, antes e depois da imersão do mesmo em uma solução de cristal violeta (1 µmol/L) por 30 min. Na parte interior do anel (Figura 30Ca) nenhuma banda correspondente ao cristal violeta foi observada, identificando-se apenas bandas de celulose. Também, o espectro obtido sobre o anel de GNPs indicou que houve uma diminuição das intensidades das bandas da celulose, como consequência da menor área exposta do papel ao laser. Por fim, um espectro intenso de cristal violeta foi obtido no anel após a imersão do substrato SERS na solução do mesmo, mostrando
que o procedimento proposto é capaz de detectar facilmente este analito em um nível micromolar de concentração.
Figura 30: (A) Anel de GNPs obtido por meio do método in situ de redução com citrato proposta. (B) Imagem FESEM da borda do anel de GNPs formado. (C) Espectro (a) Raman na região interna do anel e (b) SERS antes e (c) após a adsorção de cristal violeta via imersão simples por 30 min.
Como mencionado anteriormente, três métodos de acoplamento da técnica de ring oven e SERS (ROP-SERS) foram avaliados. No método 1, um anel de GNPs foi sintetizado antes da adsorção do analito via imersão simples em uma solução de cristal violeta (1 µmol/L). No método 2, um anel de cristal violeta (1 µmol/L) foi formado após a síntese in situ de GNPs. Esta estratégia permite incrementar o sinal SERS como resultado da pré-concentração do analito no anel de GNPs sintetizado, promovendo a sua adsorção na nanosuperfície e melhorando o procedimento de amostragem. No método 3, um anel de cristal violeta (1 µmol/L) é formado antes da deposição direta de 0,5 µL de GNPs pré-concentradas 200 vezes por centrifugação (Figura 31A). Esta estratégia também aproveita a pré-concentração do analito e, ao mesmo tempo, a grande quantidade de GNPs depositadas diretamente no anel. A
imagem FESEM obtida na borda do anel mostra uma distribuição relativamente homogênea de GNPs, gerando uma grande quantidade de hot spots. Além disso, este método apresenta a vantagem da grande afinidade da celulose pelas GNPs, o que evita a deformação do anel e a migração excessiva do coloide entre as fibras do papel de filtro. Assim, uma imagem SERS foi obtida na borda do mesmo após a deposição das GNPs (Figura 28C) para corroborar a deformação não significativa do anel. Portanto, medidas reprodutíveis e uma alta sensibilidade são esperadas para esse método.
Figura 31: (A) Anel de cristal violeta formado após a pré-concentração por Ring Oven. (B) Imagem FESEM no ponto p do anel. (C) Imagem SERS ao redor do ponto p do anel.
Os desempenhos dos três métodos propostos foram comparados em termos da intensidade da resposta SERS e a repetibilidade da mesma, e os resultados são apresentados na Tabela 5. A resposta SERS do método convencional foi obtida utilizando os substratos SERS baseados em papel de filtro fabricados no capítulo 2 pelo método de imersão. Como mostrado nesta tabela, as respostas do método convencional e do método 1 não apresentaram uma diferença significativa, enquanto
os métodos 2 e 3 apresentaram um grande ganho na intensidade do sinal SERS, sendo que o método 3 apresentou a maior resposta. Esses resultados podem ser explicados pelo fato dos métodos 2 e 3 tomarem vantagem da etapa de pré- concentração do analito diretamente no anel. Adicionalmente, a comparação da repetibilidade das respostas SERS (empregado o valor de RSD) mostrou que o método 2 apresentou a pior repetibilidade, provavelmente como resultado da variação relativamente grande de tamanhos de partícula e da formação irregular de hot spots mostradas anteriormente. Neste ponto, é interessante notar que, além de proporcionar a maior resposta SERS, o método 3 também apresentou uma boa repetibilidade. Por este motivo, o método 3 foi utilizado em todos os experimentos subsequentes.
Tabela 5. Comparação do desempenho do método convencional (substratos SERS fabricados no Capítulo 2) e dos métodos propostos após a pré-concentração de 300 µL de cristal violeta (1 µmol/L) (n = 15, cinco medidas por anel).
Método Intensidade em 1176 cm-1 ± s (u.a.) RSD (%)
Convencional 29,7 ± 3,0 10,1
1 32,7 ± 3,6 11,0
2 77,0 ± 9,4 12,2
3 165,5 ± 14,9 9,0
O coeficiente de pré-concentração (Kv/v) na técnica de ring oven, expresso em
termos de volume, representa uma medida da intensificação proporcionada pelo sistema proposto no sinal, e pode ser teoricamente estimada pelas seguintes equações:
𝐾𝑣/𝑣 =𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑉𝑎𝑛𝑒𝑙 (41)
𝑉𝑎𝑛𝑒𝑙 = 𝜋tp[rex2 − (r
ex− wr)2] (42)
onde 𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 e 𝑉𝑎𝑛𝑒𝑙 são os volumes da amostra e do anel, respectivamente, rex é o
considerando as medidas típicas para o papel de filtro e as dimensões dos anéis formados neste trabalho, o valor de 𝑉𝑎𝑛𝑒𝑙 estimado foi de 3,3 µL e, portanto, o coeficiente de concentração teórico para 300 µL de amostra foi de 90.
Para comparar esse valor teórico estimado com um valor experimental, a proporção dos sinais SERS obtidos pela pré-concentração de 300 µL de cristal violeta (1 µmol/L) e pela deposição direta de 100 µL cristal violeta (3 µmol/L) foi calculada. Ambos os experimentos foram realizados empregando um disco de papel de filtro de 23 mm de diâmetro. Assim, um coeficiente de pré-concentração experimental de 79 ± 6 foi obtido, demonstrando a boa concordância entre o valor teórico e experimental para o sistema ROP-SERS proposto. Adicionalmente, é importante mencionar que, segundo os termos da equação 41, o fato do solvente ser evaporado torna o volume do anel praticamente constante e, consequentemente, o valor de 𝐾𝑣/𝑣 dependeria apenas do volume injetado. Isto implica que, se uma maior
sensibilidade do método fosse requerida, esta poderia ser obtida apenas pela injeção de um volume maior de amostra. Para corroborar essa afirmação, a resposta SERS em 1176 cm-1 de duas soluções de cristal violeta (0,2 e 1 µmol/L) foi obtida
para diferentes volumes injetados e os resultados são apresentados na Figura 32. Portanto, o incremento do volume de amostra utilizado pode incrementar a resposta SERS obtida pelo método ROP-SERS proposto (i.e. o método apresenta uma sensibilidade controlável).
Figura 32: Efeito do volume de amostra injetado no sistema ROP na resposta SERS do cristal violeta.
Como teste preliminar à análise de DNA, a influência do pH nos espetros SERS de adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) foi estudada empregando a técnica ROP-SERS (Figura 33), sendo os pHs escolhidos com base nos valores de pKa das bases nitrogenadas [119]. Esta figura mostra que os
espectros de C (10 µmol/L, pKa = 4,4) e T (50 µmol/L, pKa = 9,9) são observados
apenas em meio fortemente básico (pH = 13), provavelmente devido à maior afinidade das suas espécies básicas pela nanosuperfície de ouro. De forma similar, os sinais SERS mais intensos para A (10 µmol/L, pKa = 4,1) e G (10 µmol/L, pKa1 =
3,25 e pKa2 = 9,4) foram observados em meio básico (pH = 13), sendo que A foi o
analito que apresentou o espectro mais intenso em todos os pHs. Também, é interessante notar que em pH = 6 as intensidades dos espectros SERS de A e G foram mais parecidas entre si, esta seria então a melhor condição para quantificar G na presença de A. Adicionalmente, leves deslocamentos nas bandas mais intensas de A e G foram observados quando a solução foi alterada de meio ácido para meio básico. Essas observações sugerem que o efeito do pH está associado principalmente com a afinidade das moléculas de A e G através dos átomos de nitrogênio dos anéis purínicos formando complexos com a superfície de ouro, através do par de elétrons disponíveis.
Figura 33: Estudo do efeito do pH nos espectros SERS de A (10 µmol/L), G (10 µmol/L), C (10 µmol/L) e T (50 µmol/L), obtidos em pH (A) 13, (B) 6 e (C) 1.
Na ausência de interferentes, a determinação individual de A, G, C e T foi feita em pH = 13 pelo monitoramento das suas bandas mais intensas localizadas em 738 cm-1 (respiração do anel), 668 cm-1 (respiração do anel), 796 cm-1 (respiração e
deformação do anel) e 1340 cm-1 (flexão CH3 e deformação C6-H), respectivamente
(Figura 34). As curvas de calibração são apresentadas nessa figura e os limites de detecção calculados foram de 50 (A), 70 (G), 100 (C) e 400 (T) nmol/L, sendo similares ou menores aos obtidos utilizando técnicas bem estabelecidas como a