Parte experimental

3.3.1 Equipamentos

Os espectros SERS foram coletados em dois equipamentos Raman diferentes, um de bancada e um portátil. O equipamento Raman de bancada descrito no Capítulo 2 desta tese (laser emitindo radiação em 785 nm) foi utilizado para realizar o estudo da fabricação dos substratos SERS baseados em papel de impressão. As amostras foram expostas ao laser por 5 segundos em um total de 5 acumulações, a janela espectral foi de 400 a 1800 cm-1 _{com uma resolução de 2 cm}- 1_{, e a potência do laser foi fixada em 50% da potência máxima nominal (250 mW).}

Por outro lado, um espectrômetro Raman portátil Mira M-1 (Metrohm, Herisau, Suiça), equipado com um laser operando em 785 nm, um tempo de exposição no intervalo de 1-2 segundos e uma potência de 75 mW, foi utilizado para realizar todas as medidas in situ da aplicação bioanalítica.

Os substratos SERS fabricados neste capítulo foram caracterizados por estudos FESEM e de espectroscopia UV-visível. O equipamento FESEM e as condições experimentais para esses estudos foram as mesmas que às descritas no Capítulo 2. Por outro lado, os experimentos empregando espectroscopia UV-visível (no modo de reflectância) foram feitas utilizando um equipamento Varian Cary Probe 50.

3.3.2 Reagentes

Além dos reagentes utilizados no Capítulo 2, cristal violeta foi obtido da Fluka, albumina bovina, ácido cítrico, creatinina e ureia foram obtidas da Sigma-Aldrich, fosfato de sódio monobásico e cloreto de potássio foram obtidos da Merck. Além disso, papel de impressão com densidade de 75 g/m2 _{foi obtido da Chamex (São}

Paulo, SP, Brasil) e foi utilizado para fabricar todos os substratos SERS empregados neste capítulo.

3.3.3 Substratos SERS baseados em papel de impressão e substratos

SERS comerciais

A Figura 18 mostra o sistema proposto para a preparação rápida de substratos SERS usando papel de impressão. Esse método consiste no uso de dois moldes de Teflon® _{com seis buracos circulares de 4 mm de diâmetro em um deles, o}

que permite o controle da área ativa do substrato. Apesar do controle da área onde as GNPs são depositadas, o uso de papel de filtro mostrou-se inadequado devido ao reduzido número de fibras por unidade de área, o que permite a difusão parcial do coloide através do bulk. Para contornar essa limitação, papel de impressão foi utilizado no preparo de todos os substratos SERS deste capítulo.

Figura 18: Procedimento para o preparo de substratos SERS baseados em papel de impressão.

O efeito da quantidade de GNPs adicionadas na superfície do papel foi estudado por meio da variação da concentração do coloide adicionado e cristal violeta como analito de teste. Assim, alíquotas de 20 µL de solução coloidal, em quatro níveis de concentração diferentes, foram adicionadas em todos os casos. Os

níveis de concentração estudados foram: (i) GNPs diluídas três vezes, (ii) GNPs sem diluição, (iii) GNPs pré-concentradas 10 vezes e (iv) GNPs pré-concentradas 50 vezes. Para obter uma solução pré-concentrada de GNPs, o coloide foi centrifugado por 15 min (3500 RPM), a quantidade de sobrenadante adequada foi descartada e o coloide foi resuspendido no volume restante. Após a adição das GNPs, o sistema foi colocado em estufa (90 °C) por uma hora para sua secagem. Por fim, as partes do papel de impressão recobertas com GNPs foram cortadas e coladas em superfícies de vidro de 1 cm x 1 cm para facilitar seu manuseio. Os espectros SERS foram adquiridos nesses substratos após a imersão dos mesmos na solução da amostra/analito por 20 min e a secagem usando ar comprimido.

Os substratos SERS comerciais Klarite® _{foram adquiridos da Renishaw}

diagnostics Ltd. (Glasgow, Reino Unido). Como mostrado anteriormente na Figura 4, esses substratos possuem uma superfície de ouro nanoestruturada altamente regular, formada por pirâmides invertidas e uma área ativa de 4 mm x 4 mm. Assim, esses substratos SERS foram utilizados para comparar o desempenho dos substratos SERS baseados em papel fabricados. Para obter os espectros SERS nos substratos Klarite®_{, 0,5 µL de solução de cristal violeta (2 mg/L) foram depositados}

diretamente na área ativa do substrato. Após a evaporação total do solvente (aproximadamente 30 min), os espectros foram obtidos em cinco posições diferentes e o experimento foi feito em triplicata (n=15).

3.3.4 Simulações eletrodinâmicas clássicas

Com o intuito de entender melhor os resultados experimentais obtidos sobre o efeito da quantidade de GNPs na superfície do papel, simulações numéricas baseadas na teoria generalizada de Mie [93,94] foram feitas em colaboração com o Prof. Dr. Diego Pereira dos Santos do Instituto de Química da Unicamp. Em todas as simulações, a resposta óptica do ouro foi descrita pelos valores experimentais obtidos por Jhonson e Chisty para a função dielétrica [95].

3.3.5 Preparo e análise das amostras de urina sintética

As amostras de urina sintética, com e sem adição de ácido úrico, foram preparadas tomando em consideração os componentes majoritários da urina

(potenciais interferentes), simulando a matriz de urina de uma pessoa saudável [96,97]. Assim, 10 g de ureia, 5,2 g de NaCl, 4,5 g de KCl, 4,8 g de NaH2PO4, 0,4 g

de ácido cítrico, 0,8 g de creatinina e 50 mg de albumina bovina foram misturados em 900 mL de água. Depois, o pH foi ajustado em 6,0 utilizando NaOH 0,1 mol/L, e o volume foi completado para 1 L com água deionizada. Os espectros SERS foram obtidos após a imersão dos substratos SERS de papel de impressão na solução de amostra 1% (v/v) por 20 min e a secagem usando ar comprimido.

3.3.6 Modelo MCR-ALS

Como mencionado anteriormente, MCR-ALS é um método quimiométrico baseado na decomposição bilinear de uma matriz D em escores (C) e pesos (S), contendo informação sobre as amostras e variáveis, respectivamente. O método de adição de padrão foi acoplado com o modelo MCR-ALS como descrito na secção 1.4.3 e os espectros SERS (obtido usando o espectrômetro Raman portátil) foram arranjados na matriz D (r x c), com os níveis de adição nas r linhas e as intensidades nas c colunas. Os cálculos foram realizados tomando como estimativa inicial dos perfis espectrais (primeira e última coluna da matriz D). Os dados foram tratados empregando o programa Matlab® 2014 e MCR-ALS toolbox 2.0 [67].