4.4
Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade explora-
tória e interação social
Segundo dados anteriormente obtidos em nosso laboratório, ratos expostos ao VPA durante a gestação apresentam alterações comportamentais caracterizadas por redução de interesse social, aumento de comportamentos estereotipados e hiperatividade se comparados a animais controles (Sousa,2013). A interação com um animal não-familiar leva à formação de uma memória social em roedores. Durante este processo, tanto o hipocampo quanto regiões corticais são recrutadas para a codificação e posterior consolidação desta memória episódica. Tendo isto em consideração, nosso interesse foi avaliar a atividade oscilatória hipocampal e pré-frontal durante atividade exploratória e interação social. Além disso, mesurar o grau de sincronização entre as duas áreas.
O experimento foi realizado com três ratos controles e três ratos experimentais implantados com eletrodos no CPFm e no hipocampo. Em sessões individuais, cada animal foi conectado ao cabo de registro (contendo um pré-amplificador Ű headstage) e submetidos aos paradigmas descritos nesta seção. Este experimento é realizado em uma sequência de quatro fases distintas numa arena retangular principal (86x57x40 cm3) com dois pequenos compartimentos laterais
(17x17x40 cm3) (figura4.4). Nas fases 1 e 3, os compartimentos laterais permaneceram vazios e
o animal pode explorar livremente por toda arena principal. As divisórias entre a arena principal e os compartimentos auxiliares foram confeccionadas em madeira com revestimento preto similar às paredes da arena principal. Já nas fases 2 e 4, um animal familiar ou não-familiar é colocado em um dos compartimentos e um objeto branco de tamanho similar a um rato Wistar no outro. Neste caso, as divisórias utilizadas entre a arena principal e os compartimentos auxiliares foram confeccionadas de acrílico transparente com orifícios circulares de 1,5 cm espaçados por 2 cm para permitir a interação entre os animais. A sequência de apresentação de animal familiar ou não-familiar foi randomizada, bem como o lado do compartimento em que são colocados. As quatro fases são separadas por intervalos de cinco minutos quando o animal é retirado da arena principal e posto em sua caixa de origem. Com exceção da terceira fase que tem duração de 10 minutos, todas as fases têm duração igual a 20 minutos.
Os animais familiares são ratos Wistar pareados por sexo e idade e compartilham a mesma gaiola com os animais experimentais por pelo menos 5 dias antes do início dos experimentos de interação social. As gaiola de manutenção dos animais no biotério são divididas ao meio com uma prancha de acrílico transparente com orifícios circulares de 1,5 cm (ver figura4.5). Desta
4.4. Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade exploratória e interação social 21
Figura 4.4: O experimento é dividido em quatro fases. Em todas as fases, o animal pode explorar o compartimento central livremente. Nas fases 1 e 3, os compartimentos laterais encontram-se vazios. Já nas fases 2 e 4, um dos compartimentos comporta um animal e o outro um objeto branco de tamanho similar a um rato. A linha temporal do experimento é ilustrada na parte de baixo da figura.
maneira, os animais podem interagir através de vocalizações, pistas olfativas e contato visual, sem risco de danos ao capacete do animal implantado. Os animais não familiares são ratos Wistar pareados por sexo e idade pertencentes a outras gaiolas também mantidos em pares.
Por pelo menos 5 dias antes do dia de experimentação, os animais foram manuseados diari- amente pela manhã por pelo menos 15 minutos cada. Durante as sessões experimentais, foram realizados registros eletrofisiológicos contínuos, registro de áudio ultrassônicos e filmagem do comportamento sincronizada com os registros. A iluminação do ambiente foi realizada por um conjunto de leds infra-vermelhos. Após o teste, os animais retornaram às suas caixas de origem e foram levados ao biotério. O aparato comportamental foi limpo com uma toalha umedecida com água.
A aquisição de dados neurais foi realizada através do sistema Omniplex (Plexon Inc.) utili- zando headstage de alta impedância de entrada com ganho de 20X (HST/32V-G20). Os registros eletrofisiológicos e os dados comportamentais de posicionamento do animal foram sincronizados através do sistema CinePlex (Plexon Inc.). Dois microfones ultrassônicos Avisoft Bioacoustics
4.4. Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade exploratória e interação social 22
Figura 4.5: Os animais familiares dividiram gaiola com os animais experimentais durante 3 dias anteriores aos experimentos. A gaiola era dividida por uma placa de acrílico transparente e com orifícios circulares de 1,5 cm de diâmetro
CM16/CMPA foram utilizados para registrar as emissões vocais dos animais. A posição dos
mesmos foi pensada de maneira a possibilitar futura identificação do rato emissor. Conforme ilustrado na figura 4.6, um deles foi colocado em direção ao animal aprisionado no pequeno compartimento enquanto a direção do segundo foi paralela a parede mais longa do aparato de maneira que o som emitido pelo animal aprisionado chegue bastante atenuado a entrada deste microfone.
Figura 4.6: Esquema representativo do setup do experimento de interação social. Utilizando um sistema de aquisição de dados NI USB-6531, os registros ultrassônicos dos microfones foram sincronizados aos registros de vídeo e eletrofisiológicos do sistema da Plexon.
4.5. Condicionamento pelo medo 23 desenvolvido a fim de sincronizar o início dos registros de áudio aos registros de vídeo e neurais. Quando executado no notebook, um pulso elétrico era enviado a uma saída digital do sistema de aquisição de dados National Instruments NI USB-6351 concomitantemente ao início do registro das vocalizações. A saída digital do NI USB-6531 foi conectada a entrada digital da Plexon e, desta forma, podemos sincronizar os registros sonoros aos registros de vídeo e eletrofisiológicos posteriormente.
4.5
Condicionamento pelo medo
O condicionamento pelo medo é um paradigma comportamental bastante utilizado para estudar essa emoção em modelos animais. Portanto, se apresenta como um bom mecanismo de estudo de alterações emocionais presentes no autismo. Este protocolo de condicionamento ao medo que descreveremos nesta seção foi testado em dois animais sendo um controle e outro modelo de autismo. Neste paradigma, um estímulo sonoro previamente não aversivo (CS+) é apresentado algumas vezes em conjunto a um choque de baixa intensidade ao animal. O animal, então, passa a demonstrar reações características de medo (congelamento, aumento de frequência cardíaca) ao ouvir aquele som mesmo quando não associado a um choque. Em indivíduos com estresse pós-traumático e ansiedade generalizada existe uma grande probabilidade de ŞgeneralizaçãoŤ comportamental a estímulos não aversivos diversos. A generalização se refere ao fato da resposta comportamental ser exacerbada mesmo quando seguindo um estímulo inofensivo que não tenha sido previamente apresentado em conjunto com estímulos aversivos.
Os experimentos de condicionamento discriminativo pelo medo são realizados em um aparato cujo assoalho consiste em barras de metal por onde é dado choques de intensidade em torno de 0,3 mA. Com exceção da parede frontal da caixa que é transparente, todas as paredes são opacas em tonalidade cinza. Após cada sessão as caixas foram limpas com solução de ácido acético 1%. Dois estímulos sonoros de diferentes frequências foram apresentados, um deles pareado ao choque (CS+) e o outro não (CS-). Cada estímulo com duração de 30 segundos em uma sequência de 27 bips de 0,5 s (ver figura 4.7). No caso do CS+, o último bip foi co-terminado com um choque. Os bips eram compostos por tons puros de 4 kHZ (CS+) e 10kHz (CS-).
O animal foi colocado no aparato e pôde explorar a caixa livremente por 2 minutos. Após esse período, foram apresentados os estímulos sonoros cuja ordem de apresentação é a seguinte: 5 CS+ e 5 CS- intercalados e separados por intervalos aleatórios de 30 a 120 s. Durante todo