Análise de LFPs

Densidade espectral de potência (PSD): Foi calculada através do método de Welch com janelas

Hamming de 1024 pontos e sobreposição de 50% do segmento de LFP. A normalização da PSD foi resultado da divisão de cada ponto da PSD bruta pela soma de todos os pontos da PSD excluindo aqueles correspondentes a faixa de frequência entre 58 e 62 Hz. Essa faixa de frequência foi excluída das análises pois em alguns registros possuía muita energia proveniente de ruído da rede de energia elétrica local.

Coerência: A coerência é uma medida da correlação entre duas séries temporais. Em neurofisi-

ologia, onde dados eletrofisiológicos de campo (LFP) são registrados simultaneamente em várias áreas, podemos usá-la como parâmetro estimativo da sincronia entre regiões cerebrais. Neste relatório, utilizamos o método de Welch para cálculo da coerência entre o CPFm e o hipocampo com janelamento hamming de 1024 pontos, overlap de 50% e Transformada Rápida de Fourier (FFT) de 1024 pontos.

Capítulo 5

Resultados

5.1

Exploração de um novo ambiente

Três animais controles e três animais experimentais tendo sido manipulados por no mínimo cinco dias antecedentes foram deixados explorar livremente um novo ambiente durante a fase 1 do experimento descrito em4.4. Durante este período, foram registrados potenciais de campo local (LFP) simultaneamente no córtex pré-frontal e no hipocampo ventral. Para realização das análises dividimos o experimento em dois momentos: o primeiro enquanto o animal esteve ativo em atividade de exploração com as vibrissas em movimento; e o segundo quando animal esteve em repouso, no entanto, sem dormir. Para realização das análises mostradas nesse capítulo, utilizamos o melhor canal de registro do hipocampo e o melhor do córtex pré-frontal, isto é, aqueles menos sujeitos a ruídos elétricos e artefatos de movimento.

Podemos ver na figura 5.1, trechos representativos de LFPs de animais controles (5.1a e

5.1b) e animais VPA (5.1c e5.1d) em momentos de exploração. Já é bem descrito que durante atividade locomotora, os ratos apresentam oscilação hipocampal em ritmo teta (entre 4 e 12 Hz) sustentada. Mesmo através da representação do sinal no domínio do tempo, podemos observar que assim como o grupo controle, o grupo VPA também apresenta aumento da potência na faixa de teta. Percebe-se que a oscilação mais lenta de maior potência alcança seu valor de pico em torno de 8 vezes dentro do período de 1 s representado, correspondendo a frequência de teta. Essa característica fica mais clara, no entanto, quando observamos os dados no domínio de frequência.

A densidade espectral de potência normalizada apresentada na figura5.2refere-se ao conjunto de trechos extraídos em que os animais estiveram em locomoção. A faixa de frequência da rede elétrica local, em torno de 60 Hz, foi excluída da representação. Os gráficos em cinza correspondem

5.1. Exploração de um novo ambiente 28

(a) (b)

(c) (d)

Figura 5.1: Trechos ilustrativos de LFP de animais controle (em preto) registrados no(a)Córtex pré-frontal medial e no(b) hipocampo; e animais VPA (em vermelho) registrados no(c)córtex pré-frontal medial e no(d)hipocampo. Os animais estavam em atividade exploratória

ao grupo controle e aqueles em vermelho ao grupo VPA. Sendo ambos da esquerda extraídos do córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo. Vemos que os dois grupos apresentam um pico na faixa de teta em ambas regiões cerebrais. Outro pico em torno de 18 Hz é presente tanto no hipocampo como no pré-frontal medial do grupo controle. Por fim, notamos um pico na faixa de high gamma (62 Ű 90 Hz) no córtex pré-frontal dos animais controle.

Figura 5.2: PSD do LFP dos animais em atividade exploratória. Os gráficos em cinza corres- pondem ao grupo controle (n=3) e aqueles em vermelho ao grupo VPA (n=3). Sendo ambos da esquerda extraídos do córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo. Durante a atividade de livre exploração, um animal controle e um animal VPA não ficaram

5.1. Exploração de um novo ambiente 29 em repouso em momento algum. Portanto, para as analises dos momentos em repouso, somente dois animais de cada grupo foram utilizados. Vemos na figura5.3trechos representativos de LFPs desses momentos e podemos notar que nesse caso as ondas são mais chatas. A potência de teta claramente se mostra reduzida neste caso. No entanto, esse fato fica mais nítido se compararmos as figuras5.4e 5.2que representam a PSD normalizada para os dois momentos distintos.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 5.3: Trechos ilustrativos de LFP de animais controle (em preto) registrados no(a)Córtex pré-frontal medial e no(b) hipocampo; e animais VPA (em vermelho) registrados no(c)córtex pré-frontal medial e no(d)hipocampo. Os animais estavam em repouso.

Figura 5.4: PSD do LFP dos animais em repouso. Os gráficos em cinza correspondem ao grupo controle (n=2) e aqueles em vermelho ao grupo VPA (n=2). Sendo ambos da esquerda extraídos do córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo.

5.2. Animais em interação social 30

5.2

Animais em interação social

Nesta seção abordaremos os resultados provenientes da etapa do experimento de interação social (seção 4.4) quando cada animal fora colocado na arena principal enquanto um animal familiar estava presente em um compartimento lateral da mesma. Os dois espaços eram separados por uma parede de acrílico transparente e com orifícios circulares de 1,5 cm ao longo de toda ela. Desta forma, os animais podiam interagir através da visão, do olfato e de vocalizações. Somente dados provinientes de dois animais de cada grupo foram utilizados nessas análises. Durante esse período, separamos os trechos de interação com o animal familiar conforme explicado em4.8.1. Podemos ver na figura5.5, trechos representativos de LFPs de animais controles (5.5ae 5.5b) e animais VPA (5.5c e 5.5d) nesses momentos. Ao analisarmos a PSD dos dois grupos durante a interação social (figura5.6), não observamos nenhuma diferença significativa.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 5.5: Trechos ilustrativos de LFP de animais controle (em preto) registrados no(a)Córtex pré-frontal medial e no(b) hipocampo; e animais VPA (em vermelho) registrados no(c)córtex pré-frontal medial e no(d)hipocampo. Os animais estavam interação social.

Afim de elucidar com mais clareza as diferenças entre as densidades espectrais de potência entre os dois grupos de animais nos três momentos distintos: em exploração, em repouso e em interação social; separamos o PSD por ritmos oscilatórios cerebrais: Teta, Beta, Low gamma e High Gamma (figuras5.7, 5.8,5.9 e 5.10). As barras correspondem ao valor médio da PSD dentro da faixa de frequência de cada ritmo. Para comparar os resultados dos grupos, utilizamos teste-t. Os resultados e comparações que realizaremos, no entanto, servem como caminho para futuras investigações visto o pequeno número de ratos.

5.2. Animais em interação social 31

Figura 5.6: PSD do LFP dos animais em interação social. Os gráficos em cinza correspondem ao grupo controle (n=2) e aqueles em vermelho ao grupo VPA (n=2). Sendo ambos da esquerda extraídos do córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo.

Conforme já mostrado em diversos estudos, o grupo controle apresenta aumento da potência do ritmo Teta hipocampal quando em exploração se comparado quando encontra-se em repouso (p=0,025) (figura 5.7). Nossos resultados mostram também uma diferença dessas medições nos momentos de exploração e interação social para o grupo controle (p=0,00096). No entanto, estas alterações não ocorrem no grupo VPA. Por fim, não foram encontradas diferenças entre os grupos para o ritmo teta seja hipocampal seja cortical.

Figura 5.7: PSD média do ritmo teta no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita) nos três momentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interação social (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto as vermelhas correspondem aos animais VPA.

5.2. Animais em interação social 32 Para os outros ritmos, não foram encontradas diferenças significativas. Tanto beta quanto

gamma (dividido em low e high) se mostram bem similares entre os animais controles e experi-

mentais em todos os momentos analisados (figuras5.8,5.9e 5.10).

Figura 5.8: PSD média do ritmo beta no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita) nos três momentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interação social (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto as vermelhas correspondem aos animais VPA.

Figura 5.9: PSD média do ritmo low gamma no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita) nos três momentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interação social (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto as vermelhas correspondem aos animais VPA.

Analisamos também a coerência entre as regiões CPFm e hipocampo dos animais nos três momentos previamente descritos (figura5.11). Para facilitar a comparação, de maneira semelhante ao que fizemos para as análises de PSD, calculamos a coerência média para cada ritmo oscilatório.

5.2. Animais em interação social 33

Figura 5.10: PSD média do ritmo high gamma no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita) nos três momentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interação social (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto as vermelhas correspondem aos animais VPA.

Figura 5.11: Coerência média entre CPFm e hipocampo dos ritmos oscilatórios teta, beta, low

gamma e high gamma representados na esquerda para direita em três momentos distintos: em

exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interação social (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto as vermelhas correspondem aos animais VPA.

5.3. Condicionamento ao medo 34 Com relação ao ritmo teta, vemos que o grupo controle apresenta valores de coerência bastante similares em todos os momentos. Já o grupo VPA que apresenta valores próximos ao grupo controle nos períodos de exploração e repouso, apresenta uma elevação considerável da coerência no momento de interação social. Apesar de não significativas, as diferenças encontradas para o grupo VPA entre o momento de interação social e o momento de exploração (p=0.1448) ou o momento de repouso (p=0.1941) podem indicar um caminho a ser seguido em futuros experimentos com maior número de animais.

Ao analizarmos a coerência do grupo VPA entre o CPFm e o hipocampo na faixa de beta, vemos uma diminuição quando ocorre exploração em relação ao período de repouso (p=0.0033) ou em relação ao período de interação social (p=0.0226)

Já o ritmo gama que foi dividido em low e high apresenta diferenças na sua faixa de frequência mais elevada. A coerência de high gamma do grupo VPA durante a o repouso é bastante elevada se comparada aos momentos de exploração.

5.3

Condicionamento ao medo

O protocolo de condicionamento ao medo foi testado em dois animais sendo um controle e outro modelo de autismo. Após o paradigma de condicionamento, os ratos ao serem apresentados ao CS (originalmente não aversivo), apresentam comportamento de congelamento caracterizado pela cessação da ambulação e manutenção de movimentos apenas em decorrência da atividade respiratória. Além desta alteração comportamental, vários estudos também mostram alterações de parâmetros autonômicos como aumento da frequência cardíaca e ritmo respiratório. Como explicado na seção 4.5, durante o protocolo de condicionamento ao medo, os animais foram expostos a estímulos CS+ e estímulos CS-. No dia seguinte, realizamos o protocolo de extinção do condicionamento em uma arena completamente distinta daquela onde ocorreu o treinamento.

O protocolo de extinção foi dividido em cinco fases. A primeira corresponde ao período basal quando o animal é colocado na caixa e deixado explorar livremente. Durante este período nenhum estímulo (sonoro ou choque) é apresentado. Na fase seguinte, foram apresentados quatro estímulos CS-. Já nas três últimas fases, foram apresentados quatro CS+ em cada uma delas, porém, desta vez, eles não estavam associados a choque. Na figura 5.12, vemos o percentual do tempo que os animais ficaram congelados em cada fase do protocolo de extinção. Dividimos cada fase em quatro períodos de mesma duração já que, com exceção da primeira, quatro estímulos foram

5.3. Condicionamento ao medo 35 apresentados em cada uma delas. O valor de cada barra corresponde à média dos percentuais de tempo que os animais ficaram congelados nos quatro períodos de cada fase. O animal controle (figura 5.12a) parece ter generalizado o medo a qualquer um dos estímulos, CS- ou CS+, pois entrou em congelamento nas últimas quatro fases durante quase todo tempo. Já o animal VPA (figura 5.12b) não parece generalizar o medo e o percentual de tempo em congelamento só é significativo nas fases quando o CS+ é apresentado. A medida que os estímulos sonoros anteriormente apresentados em associação ao choque são apresentados isoladamente, ocorre um processo de extinção da memória aversiva. Esse processo, normalmente, fica claro com a queda no tempo de congelamento apresentado pelo animal. Infelizmente, nenhum dos dois animais apresentou extinção da memória consistente com a literatura. No entanto, é possível notar, principalmente no caso do animal VPA, uma redução no percentual do tempo que o animal passou parado indicando o início do processo de extinção.

(a) (b)

Figura 5.12: Taxa de tempo em que cada animal ficou congelado em cada fase do protocolo de extinção do medo.(a) animal controle;(b) animal VPA.

Durante o protocolo de extinção ao medo, realizamos registros eletrofisiológicos no córtex pré-frontal medial e no hipocampo. Como descrito na seção4.5, cada estímulo sonoro, CS+ ou CS-, é composto por 27 bips sequenciais de duração de 500 ms. As figuras5.13,5.14,5.15,5.16, mostram o espectrograma médio pré e pós bips da segunda fase (CS-), da terceira fase (primeiros quatro CS+) e da última fase (últimos quatro CS-), na ordem de cima para baixo. O tempo 0 corresponde exatamente ao início de cada bip.

As figuras 5.13 e 5.14 correspondem aos registros do animal controle no córtex pré-frontal medial e no hipocampo, respectivamente. Como podemos observar, as respostas evocadas pelos estímulos sonoros em ambas regiões são bastante claras. O aumento na potência de gama parece estar associado ao medo de que aquele bip preceda um choque. Essas figuras sugerem a generalização do medo visto que a apresentação do CS- (5.13a e 5.14a) gera esse aumento,

5.3. Condicionamento ao medo 36

(a)

(b)

(c)

Figura 5.13: Média do espectrograma do CPFm do animal controle pré e pós inicio de um bip(a)

da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada;(a)da etapa 3 quando a primeira bateria de quatro CS+ é apresentada;(a)da etapa 5 quando a última bateria de quatro CS+ é apresentada.

corroborando, assim, os achados comportamentais. Vemos, então, que a medida que os estímulos sonoros ocorrem sem choque, a resposta passa a ser de menor intensidade.

As figuras5.15e5.16correspondem aos registros do animal VPA no córtex pré-frontal medial e no hipocampo, respectivamente. Diferentemente do animal controle, este animal não parece ter generalizado o medo a ambos estímulos. Coerentemente ao comportamento, o aumento da potência de gama na presença de CS- não ocorre (figuras5.15a e5.16a), sugerindo que o animal diferenciou CS- e CS+ e não apresentava medo do choque na presença de CS-. Já na primeira bateria de CS+ (figuras5.15be 5.16b), a resposta evocada parece clara e é diminuída a medida em que o estímulo é apresentado na ausência de choque, o que se constata com a última bateria de CS+ (figuras5.15c e 5.16c).

5.3. Condicionamento ao medo 37

(a)

(b)

(c)

Figura 5.14: Média do espectrograma do hipocampo do animal controle pré e pós inicio de um

bip (a) da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada; (a) da etapa 3 quando a primeira bateria de quatro CS+ é apresentada;(a)da etapa 5 quando a última bateria de quatro CS+ é apresentada.

5.3. Condicionamento ao medo 38

(a)

(b)

(c)

Figura 5.15: Média do espectrograma do CPFm do animal VPA pré e pós inicio de um bip (a)

da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada;(a)da etapa 3 quando a primeira bateria de quatro CS+ é apresentada;(a)da etapa 5 quando a última bateria de quatro CS+ é apresentada.

5.3. Condicionamento ao medo 39

(a)

(b)

(c)

Figura 5.16: Média do espectrograma do hipocampo do animal VPA pré e pós inicio de um

bip (a) da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada; (a) da etapa 3 quando a

primeira bateria de quatro CS+ é apresentada;(a)da etapa 5 quando a última bateria de quatro CS+ é apresentada.

Capítulo 6

Discussão

Estratégia metodológicos para o estudo de comportamentos sociais

A deficiência na interação/comunicação social é um dos dois fatores utilizados para diagnósticos em pacientes autistas. Em nosso laboratório, utilizando modelos animais de autismo VPA, foram realizados experimentos que comprovaram déficits de interação social nesses animais. No entanto, nenhuma pesquisa fora realizada sobre a caracterização eletrofisiológica nesse modelo durante um episódio de interação social ou resposta ao medo. Visando contribuir para o preenchimento desta lacuna, nos propusemos neste trabalho iniciar a implementação de estratégias metodológicas que sejam capazes de acoplar o monitoramento comportamental por vídeo (p.ex. interação social), registros eletrofisiológicos com múltiplos eletrodos e registro de emissões ultrassônicas.

A definição de interação social é bastante ampla e envolve inúmeras variáveis. Com o objetivo de isolar alguns parâmetros, o experimento é composto de quatro fases. A apresentação de um animal familiar e outro não-familiar nos permite eliminar o fator novidade. Já o objeto de tamanho similar ao animal colocado no compartimento oposto permite a diferenciação entre interação social e interação com um objeto. Ademais, as fases sem exposição de animais são importantes para medições de níveis basais.

As VUS são muito importantes para comunicação entre os roedores. Diversos estudos mostram um cunho emocional e social importante a depender da frequência desses sons. Ademais, a vocalização de um rato pode despertar respostas em outro animal ouvinte. Portanto, durante o experimento foram utilizados microfones ultrassônicos. A identificação da valência e do emissor das VUS é um mecanismo muito interessante para melhor compreensão da interação entre os animais. Esperamos que esse setup seja utilizado futuramente no laboratório para experimentos

41 com modelos VPA e também de outras patologias com prejuízo social.

Dois animais de cada grupo passaram por todas as fases desse protocolo o que nos permite tecer alguns comentários qualitativos. Observamos que o tempo que todos os animais, tanto controles quanto VPAs, passam a interagir com o objeto é muito reduzido, não excedendo 30s num período de 20 minutos em nenhum dos casos. Outro fato importante é a manipulação prévia dos animais que devem estar o menos estressados possível para explorar e interagir livremente. Por fim, notamos que os animais aprisionados podem emitir taxas bastante distintas de VUS. A medição desse elemento é de bastante importância para compreensão do comportamento do animal que está sendo analisado. Ao ouvir uma vocalização de valência positiva ou negativa, é natural que as respostas neuronais sejam distintas. Infelizmente, não pudemos analisar este fator até o momento, mas esperamos utilizá-lo em experimentos futuros.

Os experimentos de condicionamento e extinção do medo foram realizados somente com dois animais: um controle e um VPA. O objetivo era validar do começo ao fim os setups para experimentos futuros dentro do laboratório. O grande desafio desses protocolos foi sincronizar todos os eventos sonoros e comportamentais ao registro eletrofisiológico. Infelizmente, o registro eletrofisiológico durante a etapa de condicionamento não foi possível, pois o choque aplicado nas patas do animal poderia danificar o headstage. Durante o primeiro dia do protocolo, os animais são apresentados a baterias de estímulos sonoros associados a um choque (CS+) e não-associados a choque (CS-). No segundo dia, apresentamos os mesmos estímulos, no entanto, ambos na ausência de choque. O comportamento natural do animal ao ser colocado em um ambiente novo é explorar. Porém, ao ouvir aquele estímulo que fora anteriormente apresentado em presença do choque, caso o rato tenha criado a memória aversiva, imediatamente ele fica imóvel (congela). A medida que o estímulo é apresentado, essa memória aversiva vai sendo extinta e a curva de tempo de congelamento decai. Dizemos que o animal generalizou o medo, quando ele também congela ao ouvir o estímulo CS-. As razões para que isso ocorra incluem estresse e ansiedade e, portanto, manipulação e habituação do animal ao experimentador são indispensáveis.

Acerca dos resultados mostrados nas figuras da seção 5.3 não podemos generalizá-los aos grupos, pois o número de animais é insatisfatório. No entanto, se analisarmos cada animal individualmente, podemos tecer algumas considerações. O gráfico de barras que ilustra o tempo de congelamento de cada animal por fase do protocolo de extinção (figura5.12) deixa claro que o animal controle desde o começo, na fase basal (BL), já se movimenta menos que o animal VPA. Esse comportamento pode ser um indicador de estresse, o que também pode explicar a

42 generalização do medo ao estímulo CS- que este animal apresentou. SegundoMarkram et al.(2008) que realizaram experimentos de condicionamento pelo medo com animais VPA, esses animais apresentam maior taxa de generalização e menor taxa de decaimento da curva de congelamento na fase de extinção. Em nosso laboratório, será necessário reproduzir os experimentos com um maior número de animais para que sejamos capazes de avaliar esses achados.

Com relação aos registros eletrofisiológicos, também podemos diferenciar facilmente o espec- trograma do animal que generalizou e aquele que não generalizou. Vemos que tanto no hipocampo quando no CPFm, o animal controle apresenta um aumento significativo da potência do sinal na faixa de gama e bastante sincronizado com o início dos bips de CS- e de CS+. No caso do