5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.8. Adição dos princípios ativos às nanoemulsões
A nanoemulsão CC14 foi considerada mais estável através dos testes preliminares de estabilidade, pois uma pequena alteração na distribuição granulométrica foi observada para CC13 no teste de estresse térmico.
Além do mais, analisando os diâmetros médios dessas formulações, observou-se que CC14 apresentou partículas um pouco menores que CC13. Quanto menores os glóbulos de uma nanoemulsão, maior sua estabilidade (JEONG et al., 2001; TADROS, 2013).
Portanto, a formulação CC14 foi selecionada como nanoemulsão base para ser adicionada de EEB das folhas de Melaleuca leucadendron ou de pilocarpina ou de ambos ativos.
5.8.1. Adição do EEB
Na figura 23 pode ser observada a incorporação de 0,5% de EEB das folhas de
Melaleuca leucadendron previamente ao aquecimento da fase oleosa, nos três métodos
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Figura 23: Incorporação de 0,5% do EEB previamente ao aquecimento da fase oleosa. A – método I: EEB adicionado à fase oleosa completa. B – método II: EEB adicionado ao
Croduret 50 Special e sonicado por 2 horas. C – método III: EEB adicionado ao Croduret 50 Special e sonicado por 4 horas
No método I o EEB foi adicionado à fase oleosa completa e, em seguida, preparada a emulsão. Foram obtidas formulações amareladas com aspecto de nanoemulsão. Porém, não foi observada boa incorporação do extrato, ocorrendo deposição de partículas no fundo do recipiente utilizado para o preparo (Figura 24A).
Nos métodos II e III, foram obtidas formulações esverdeadas com aspecto de nanoemulsões (Figura 24B). Foi observado que quanto maior o tempo sob ultrassom, melhor a incorporação do extrato. Sendo assim, como no método II foram apenas 2 horas de sonicação frente a 4 horas no método III, a formulação obtida por esse último método foi selecionada como a melhor.
Figura 24: Formulações contendo 0,1% de EEB. A – nanoemulsão obtida pelo método I. B – nanoemulsão obtida pelo método III
Nas emulsões obtidas pelo método III foi alcançada excelente incorporação do extrato. No entanto, em concentrações superiores a 0,5% de EEB foram notadas
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partículas no fundo do recipiente utilizado para o preparo. Após a incorporação, todas as nanoemulsões com EEB, foram filtradas em filtro de 0,45 µm previamente à utilização. Este tipo de filtro não retém os glóbulos das formulações e é útil para a remoção de quaisquer partículas insolúveis de EEB que não podem ser vistas macroscopicamente.
Um extrato bruto possui muitos constituintes distintos em sua composição (SOUZA et al., 2012). Quando acrescentadas maiores concentrações do EEB, a quantidade de tensoativos e o aquecimento podem não ter sido suficientes para solubilizar os componentes com caráter muito hidrofílico. Contudo, a adição desse extrato ao tensoativo hidrofílico e a ultrassonicação, previamente ao acréscimo do restante da fase oleosa, favoreceram a incorporação. Além disto, após a adição da fase aquosa, estes compostos mais polares podem ter sido solubilizados, contribuindo para a obtenção de sistemas mais homogêneos e estáveis.
O desenvolvimento de formulações nanoestruturadas com extratos vegetais agrega muitas vantagens aos medicamentos obtidos. Dentre elas, pode-se citar melhora da solubilidade e biodisponibilidade desses princípios ativos, proteção contra a toxicidade e contra a degradação química e física. Além disso, pode aumentar sua ação farmacológica, através de sinergismo, por interação com os demais componentes da fórmula (GOYAL et al., 2011; ANSARI et al., 2012; BONIFÁCIO et al., 2014).
5.8.2 Adição do cloridrato de pilocarpina
A incorporação do cloridrato de pilocarpina às nanoemulsões, na fase de resfriamento, foi realizada sem alterações perceptíveis. Mesmo nas maiores concentrações testadas não houve problemas com a metodologia utilizada.
No caso das nanoemulsões que combinaram o EEB e o cloridrato de pilocarpina, a incorporação foi realizada em formulações adicionadas de extrato pelo método III. Por esse método, como descrito anteriormente, houve boa incorporação do EEB através da ultrassonicação por 4 horas com tensoativo hidrofílico. No caso dessas nanoemulsões, a pilocarpina também foi adicionada sem comprometimento aparente da qualidade.
As nanoemulsões combinando os dois princípios ativos foram filtradas em filtros de 0,45 µm, para evitar a presença de partículas não incorporadas do extrato.
O cloridrato de pilocarpina é um fármaco com coeficiente de partição O/A característico de substâncias hidrofílicas, podendo-se esperar boa incorporação do mesmo em componentes aquosos (JARVINEN et al., 1991; PALLICER et al., 2011).
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Isto justifica os bons resultados obtidos com a sua adição após o preparo das nanoemulsões O/A, em que a fase dispersante e, nesse caso, o maior componente, foi água.
5.9. Caracterização físico-química das nanoemulsões
As nanoemulsões NB, NE, NP e NEP foram obtidas, conforme descrito anteriormente, selecionando quantidade de fase oleosa, sistema tensoativo, concentração de cada tensoativo no sistema e método de incorporação do EEB ideais. Na tabela 13 pode ser observada a composição detalhada dessas formulações.
Tabela 13: Composições centesimais das nanoemulsões utilizadas nos ensaios de caracterização
Componente NB NE NP NEP
Óleo de girassol 10 % 10 % 10 % 10 %
Crill 3 5 % 5 % 5 % 5 %
Croduret 50 Special 5 % 5 % 5 % 5 %
EEB das f. M. leucadendron - 0,1 % - 0,05 %
Cloridrato de pilocarpina - - 0,1 % 0,05 %
Água 80 % 79,9 % 79,9% 79,9 %
Legenda: NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina; f. = folhas
Essas quatro nanoemulsões foram utilizadas nos ensaios de caracterização. Como as nanoemulsões contendo extrato (NE e NEP) passaram por filtração, NB e NP também foram filtradas em filtro de 0,45 µm. Esse procedimento teve a finalidade de conceder a todas as nanoemulsões as mesmas condições, especialmente porque parte delas foi destinada aos ensaios de estabilidade realizados posteriormente.
A filtração, nessa porosidade, é um método eficaz para remoção de boa parte dos microrganismos, conferindo menor chance de contaminação às amostras (JORNITZ et al., 2002; SINCLAIR et al., 2014). Segundo Vetten et al. (2014) a filtração é um método seguro. Ela pode ser utilizada para eliminar a contaminação microbiana, sem alterar as propriedades físico-químicas das nanopartículas, desde que sejam utilizados filtros com porosidade adequada.
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5.9.1. Avaliação macroscópica
Após 24 horas do preparo nenhum indício de separação de fases, floculação ou cremeação foi observado nas formulações NB, NE, NP e NEP. Portanto, as mesmas foram consideradas estáveis macroscopicamente.
As quatro emulsões apresentaram aspecto transparente azulado característico de nanoemulsões (SADURNÍ et al., 2005; KOMAIKO e MCCLEMENTS, 2014).
5.9.2. Avaliação microscópica
Microscopicamente, após 24 horas do preparo, nenhuma estrutura foi observada em NB, NE, NP e NEP. Nem mesmo sob luz polarizada ou sob o maior aumento (1000x).
Resultados estes que corroboram com o desejado para nanoemulsões, que devem apresentar partículas de tamanho reduzido. Além disso, a ausência de estruturas birrefringentes confirma que não houve formação de cristais líquidos ao redor dos glóbulos das emulsões, tampouco a precipitação da pilocarpina e/ou de compostos do EEB (KINI et al., 2012; CHAUDHARY et al., 2014).
5.9.3. Determinação da distribuição granulométrica
O diâmetro médio e o IP obtidos para NB, NE, NP e NEP, 24 horas após o preparo, estão descritos na tabela 14. Todas as quatro emulsões foram consideradas sistemas monodispersos com glóbulos de tamanhos reduzidos.
Tabela 14: Distribuição granulométrica obtida para caracterização das nanoemulsões, 24 horas após o preparo (média ±desvio padrão, n = 3)
Amostra Tamanho (nm) IP
NB 76,7±0,95 0,184±0,023
NE 74,7±0,55 0,148±0,026
NP 78,8±2,69 0,220±0,016
NEP 77,4±3,48 0,241±0,043
Legenda: IP = índice de polidispersão; NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
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O tamanho variou pouco de uma formulação para outra, mantendo-se na faixa entre 70 e 80 nm. Analisando essa variação por ANOVA, a um grau de confiança de 95%, as médias de distribuição granulométrica não diferiram significativamente entre as emulsões. Com isso, pode-se inferir que a incorporação dos ativos à nanoemulsão base, além de não ter alterado suas características macroscópicas, também não influenciou no tamanho dos glóbulos formados.
O pequeno diâmetro das partículas obtidas pode ser associado à composição das nanoemulsões, ao método utilizado e também, ao modo como esse método foi executado (SIMOVIC et al., 1999; IZQUIERDO et al., 2004; MORAIS et al., 2006). De acordo com Pereira (2008) glóbulos menores são formados por elevada velocidade de agitação e baixo fluxo de adição da fase aquosa.
As formulações NB, NE, NP e NEP apresentaram aspecto transparente azulado, tamanho de glóbulos reduzido e foram desenvolvidas utilizando pequenas concentrações de sistema tensoativo (10 %). Essas propriedades confirmam a obtenção de nanoemulsões (MCCLEMENTS, 2012; TUBESHA et al., 2013; BAZYLINSKA et al., 2014).
O tamanho pequeno dos glóbulos, além de contribuir para a estabilidade, pode apresentar maior facilidade em permear a pele, alcançando estrato córneo e epiderme. Essa propriedade pode colaborar para uma boa ação tópica dos ativos presentes nas nanoemulsões (TADROS et al., 2004; OZTURK et al., 2014).
5.9.4. Determinação do pH
Os valores de pH obtidos para as formulações NB, NE, NP e NEP após 1, 7 e 30 dias do preparo, podem ser observados na tabela 15.
Tabela 15: Valores de pH das nanoemulsões após 1, 7 e 30 dias do preparo (média ± desvio padrão, n = 3)
Amostra 1 dia 7 dias pH 30 dias
NB NE NP NEP 6,46 ±0,04 6,49 ±0,06 6,48 ±0,04 6,48 ±0,03 6,47 ±0,04 6,52 ±0,03 6,53 ±0,04 6,55 ±0,05 6,57 ±0,07 6,53 ±0,03 6,56 ±0,07 6,55 ±0,07 Legenda: NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
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Os valores foram todos próximos a 6,5. Quando analisado por ANOVA, não houve diferenças significativas entre o pH das diferentes nanoemulsões, a um nível de significância de 0,05. Esses resultados, próximos da neutralidade à ligeiramente ácidos, são geralmente característicos de sistemas nanoemulsionados. Schwarz et al. (2012), Nirmala et al. (2014) e Rocha-Filho (2014) encontraram valores semelhantes para as nanoemulsões desenvolvidas em seus estudos.
O pH é um parâmetro de caracterização e também de monitoramento da estabilidade das formulações. De acordo com a literatura, nanoemulsões estáveis, física e quimicamente, apresentam valores na faixa de 6,5 a 8 (FRONZA et al., 2004; MASMOUDI et al., 2005; CARNEIRO, 2013). Segundo Ozturk et al. (2014) esses sistemas são estáveis numa faixa ainda mais ampla de pH, de 3 a 8.
Alterações no valor do pH indicam a ocorrência de reações químicas ou crescimento bacteriano. Um decréscimo nos valores pode ser decorrente da oxidação da fase oleosa ou da hidrólise de triglicerídeos, gerando ácidos graxos livres (MASMOUDI et al., 2005; PEREIRA 2008).
Com o decorrer dos 30 dias de armazenamento, não houve variação significativa nos valores de pH em nenhuma das nanoemulsões (p > 0,05). Pode-se sugerir que as formulações permaneceram estáveis, não sendo detectadas alterações químicas de seus componentes.
O pH de produtos dérmicos é um fator importante para evitar irritação da pele e para não deixá-la suscetível à infecção bacteriana. É interessante que formulações tópicas apresentem valores ligeiramente ácidos, uma vez que o pH cutâneo encontra-se em torno de 4,5 a 6. Portanto, os resultados obtidos, para NB, NE, NP e NEP, confirmam a compatibilidade dessas nanoemulsões com o uso a que se destinam (BORGES et al., 2013; CLARES et al., 2014).
5.9.5. Determinação da temperatura de inversão de fases
A condutividade elétrica, a 25 ºC, obtida para NB, NE, NP e NEP foi, respectivamente, 254,7; 258,3; 257,9 e 237,5 µSm/cm. Esses valores são característicos de nanoemulsões O/A. Ao contrário, emulsões em que a fase contínua é a oleosa, apresentam baixa a nenhuma condutividade (BUMAJDAD e EASTOE, 2004; KLASSEN et al., 2014). Essa diferença entre O/A e A/O, além de empregada para
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determinar o tipo de emulsão, pode ser utilizada para caracterizar a inversão de fases (BOUCHAMA et al., 2003).
Na Figura 25 está representada a condutividade elétrica das nanoemulsões, em função da temperatura. As formulações aumentaram levemente a condutividade à medida que a temperatura aumentou. Chegaram, então, a um ponto onde ocorreu a inversão de fases, ocasionando um decréscimo brusco da mesma. As curvas obtidas encontram-se de acordo com o perfil descrito para emulsões na literatura (FERNANDEZ et al., 2004; KLASSEN et al., 2014).
Figura 25: Condutividade elétrica das nanoemulsões em função da temperatura
Nas formulações contendo ativos, foi observado um aumento um pouco mais aparente da condutividade em função da temperatura, quando comparadas à NB. Essa diferença pode ser consequência da composição mais complexa das nanoemulsões com EEB e/ou cloridrato de pilocarpina. Pois, a elevação, que ocorre inicialmente, é decorrente da maior mobilidade dos íons presentes na fase contínua, causada pelo aquecimento. Além do aumento na taxa de dissociação dos sais presentes no meio (SPERNATH e MAGDASSI, 2007; CARNEIRO, 2013).
A TIF determinada, para cada nanoemulsão, pode ser observada na tabela 16. Todas as formulações apresentaram TIF na faixa entre 79 e 82 ºC. Esses valores foram próximos aos utilizados para o preparo das mesmas.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 Co nd ut iv id ad e (μ S.c m -1) Temperatura (ºC) NB NE NP NEP
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O ideal, no método de inversão de fases, é preparar as nanoemulsões em uma temperatura em torno da TIF, seguido de um arrefecimento rápido (MAALI e MOSAVIAN, 2013; OLIVEIRA et al., 2014).
Tabela 16: Temperatura de inversão de fases (TIF) obtida para caracterização das nanoemulsões, 24 horas após o preparo
Amostra TIF (ºC)
NB 81,5
NE 79,2
NP 81,7
NEP 80,5
Legenda: TIF = temperatura de inversão de fases; NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
Segundo Tadros (2013), quando utilizada temperatura um pouco abaixo da TIF, são formados glóbulos de tamanhos menores. Isso porque, a mínima tensão interfacial, necessária para a inversão de fases, é alcançada próximo à TIF e, aumenta novamente, logo em seguida.
As TIFs encontradas foram adequadas para emulsões armazenadas à temperatura ambiente, por volta de 20 a 25 ºC. De acordo com Shinoda e Saito (1969) e com Tadros (2013) sistemas estáveis são obtidos quando as temperaturas de inversão são cerca de 20 a 65 ºC superiores à temperatura de estocagem.
5.9.6. Determinação do potencial zeta
O potencial zeta fornece uma medida da força elétrica repulsiva entre as partículas. A determinação desse potencial pode ser utilizada como um parâmetro de caracterização e de monitoramento da estabilidade de sistemas coloidais. Quanto maior o potencial zeta, maior a repulsão eletrostática entre as nanopartículas, havendo menor probabilidade de agregação (GUPTA e GHOSH, 2014; KADAM et al., 2014; TAMJIDI et al., 2014).
A velocidade de migração dos glóbulos, com potencial zeta, em direção a um eletrodo de carga oposta, foi medida via M3-PALS. Esse método é decorrente da combinação de duas técnicas, laser Doppler com análise de fase por espalhamento de luz (PALS) (ARZENŠEK et al., 2012; FELIX et al., 2013). Com isso, foi possível obter
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uma distribuição completa do potencial de cada nanoemulsão e um valor médio do mesmo (Tabela 17).
Todas as quatro nanoemulsões apresentaram valor de potencial zeta adequado, indicando estabilidade das mesmas. De acordo com a literatura, para alcançar um sistema eletrostaticamente estável, é necessário um potencial zeta igual ou maior a 30 mV, em módulo (LAKSHMI e KUMAR, 2010; ABLA e BANGA, 2014; TAMJIDI et al., 2014; TRAN et al., 2014).
Tabela 17: Potencial zeta obtido para caracterização das nanoemulsões, 24 horas após o preparo (média ±desvio padrão, n = 3)
Amostra Potencial Zeta (mV)
NB -46,0 ± 0,79
NE -30,3 ± 3,07
NP -43,1 ± 0,71
NEP -43,3 ± 3,00
Legenda: NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
Nanoemulsões produzidas a partir de misturas de tensoativos não-iônicos apresentam potencial zeta negativo. A carga superficial negativa tem sido atribuída à adsorção de íons hidroxila na interface O/A. Esse mecanismo pode ser decorrente da formação de pontes de hidrogênio com os grupos etóxi da cadeia polietilênica, originando íons oxônio (HO e AHMAD, 1999; LIU et al., 2006; SANTOS et al., 2011).
Alterações no potencial zeta, devido a mudanças de condições e/ou de constituintes das emulsões, podem alterar a carga dos glóbulos e interferir na estabilidade dos sistemas. A influência da adição de eletrólitos ou outros aditivos depende das quantidades empregadas (JEONG et al., 2001; MORAIS et al., 2006).
Avaliando as diferenças de potencial zeta entre as nanoemulsões, apenas NE apresentou variação estatisticamente significativa (p < 0,05). A adição de cloridrato de pilocarpina, um sal ionizável, na quantidade avaliada, não exerceu influência na carga superficial dos glóbulos.
A presença de EEB só alterou o potencial zeta em NE, provavelmente, por estar em maior concentração nessa formulação que em NEP. Uma possibilidade, para a redução de potencial observada, é que compostos presentes no extrato, como as hidroxilas dos compostos fenólicos, estejam interagindo com os grupos etóxi da cadeia polietilênica dos tensoativos, reduzindo a adsorção de íons hidroxila da interface.
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Vale ressaltar que nenhum sinal de instabilidade foi observado, macroscopicamente, em NE. Além disso, o potencial zeta determinado, mesmo inferior aos das demais, parece ser suficiente para garantir estabilidade eletrostática ao sistema.
5.10. Testes de estabilidade
Nas nanoemulsões, a energia livre das fases, oleosa e aquosa, separadas é menor do que a da própria formulação. Por essa razão, são sistemas termodinamicamente instáveis. No entanto, quando adicionados estabilizadores apropriados, como os tensoativos, suas características podem ser mantidas por um período considerável (ZEEB et al., 2014).
Durante os 60 dias de armazenamento, nenhuma alteração macroscópica foi observada em NB, NE, NP e NEP. As emulsões permaneceram sem separação de fases, cremeação ou floculação e mantiveram suas características organolépticas.
5.10.1. Estresse térmico
Com o aquecimento, os tensoativos não-iônicos tendem a se desidratar, podendo alterar a solubilidade O/A e a tensão interfacial. Além disso, o aumento da temperatura eleva a energia cinética, incrementando o movimento Browniano do sistema. Esses processos permitem que as partículas superem a barreira energética e aproximem-se umas das outras. Fenômenos como floculação e coalescência tornam-se mais prováveis. Pode ocorrer um aumento no tamanho dos glóbulos ou, ainda, separação de fases (MORAIS et al., 2006; RAO e MCCLEMENTS, 2011).
Tabela 18: Distribuição granulométrica das nanoemulsões posteriormente aos testes de estresse térmico realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após seu preparo (média ±desvio padrão, n = 3)
AM Tamanho 1 dia 7 dias Tamanho após estresse térmico 15 dias 30 dias 60 dias NB NE NP NEP 76,7 ±0,96 78,5 ±2,80 76,8 ±0,20 81,6 ±4,56 76,9 ±2,11 77,7 ±0,93 74,7 ±0,55 74,1 ±0,11 73,9 ±1,03 73,9 ±0,65 75,9 ±2,56 76,5 ±1,41 78,8 ±2,69 77,8 ±0,53 79,7 ±1,40 76,8 ±0,79 80,3 ±0,74 80,5 ±0,43 77,4 ±3,48 79,5 ±0,42 83,7 ±3,81 80,0 ±1,51 79,5 ±7,81 82,4 ±3,79 Legenda: AM = amostra; NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
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Ao final dos ensaios de estresse térmico realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após o preparo, as nanoemulsões permaneceram estáveis. Macroscopicamente, não foram observadas alterações, mesmo quando submetidas à temperatura de 80 ± 2 ºC. A distribuição granulométrica também não sofreu variações significativas em nenhuma das amostras, a um nível de significância de 0,05 por ANOVA (Tabela 18).
5.10.2. Centrifugação
Agregação, cremeação e separação de fases, que ocorreriam com o tempo, podem ser antecipados com o ensaio de centrifugação. No entanto, esses fenômenos de instabilidade são incomuns em nanoemulsões com tamanho de partícula reduzido. Nessas formulações, o movimento Browniano é maior que a força gravitacional e assegura que os glóbulos permaneçam separados. Especialmente nas que apresentam diâmetro inferior a cerca de 70 nm (BADOLATO et al., 2008; MCCLEMENTS e RAO, 2011) .
Posteriormente aos ciclos de centrifugação, realizados após 1, 7, 15, 30 e 60 dias do preparo, não ocorreram alterações macroscópicas. Também não foram determinadas variações significativas no tamanho das partículas (ANOVA, p > 0,05) (Tabela 19).
Tabela 19: Distribuição granulométrica das nanoemulsões posteriormente aos testes de centrifugação realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após seu preparo (média ±desvio padrão, n = 3)
AM Tamanho 1 dia 7 dias Tamanho após centrifugação 15 dias 30 dias 60 dias NB NE NP NEP 76,7 ±0,96 77,5 ±0,66 75,0 ±1,13 77,9 ±1,01 77,7 ±0,37 78,0 ±2,46 74,7 ±0,55 75,5 ±1,57 75,4 ±0,62 75,9 ±1,99 75,1 ±0,20 77,0 ±0,17 78,8 ±2,69 80,4 ±3,80 78,9 ±1,23 81,7 ±1,86 83,2 ±3,04 81,5 ±1,24 77,4 ±3,48 76,7 ±1,72 77,8 ±2,13 80,4 ±2,98 78,9 ±1,28 80,6 ±0,51 Legenda: AM = amostra; NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina e NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
Assumindo que a estabilidade é diretamente proporcional à força gravitacional, o comportamento das emulsões, em longo prazo, pode ser estimado pela centrifugação em velocidades moderadas. Portanto, de acordo com os resultados, NB, NE, NP e NEP apresentaram-se fisicamente estáveis (LATREILLE e PAQUIN, 1990; ANDRADE et al., 2007).
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Quanto mais rápido ocorre o aumento das partículas menor a estabilidade de um sistema. Sendo assim, a manutenção do tamanho, observada após o armazenamento e os ensaios de estresse térmico e centrifugação, confirma a durabilidade das emulsões (MCCLEMENTS e RAO, 2011; GUPTA e GHOSH, 2014).
Esses fatos reafirmam a eficiência do método e dos componentes utilizados para a obtenção das formulações. Pois foram capazes de conferir propriedades físico- químicas que caracterizaram sistemas estáveis.
5.11. Determinação da citotoxicidade in vitro das nanoemulsões por MTT
Formulações para aplicações cosméticas e farmacêuticas, além de características adequadas de estabilidade, precisam apresentar baixa toxicidade. É necessário determinar as concentrações em que os princípios ativos podem ser utilizados sem causar danos. Consequentemente, antes de realizar estudos de atividade, especialmente
in vivo, é interessante realizar estudos de toxicidade in vitro (WEYENBERG et al.,
2007; ROTHEN-RUTISHAUSER et al., 2008; SCHERLIEß, 2011).
A citotoxicidade avaliada pelo método MTT tem sido muito utilizada, por apresentar elevada sensibilidade. Esse ensaio tem como alvo a função catalítica das desidrogenases, que é facilmente influenciada por efeitos tóxicos. Além disso, pode ser utilizado em vários tipos de culturas de células (WAN et al., 2009; SCHERLIEß, 2011; NIKZAD et al., 2014).
A nanoemulsão sem ativos não apresentou efeito citotóxico. A viabilidade celular, determinada para NB, foi de 98,39 ±0,56 %. Pode-se sugerir que o óleo de girassol e o sistema tensoativo apresentaram características toleráveis aos macrófagos murinos. Janjic et al. (2014) também analisaram a citotoxicidade de nanoemulsões com tensoativos não-iônicos. Utilizaram uma metodologia diferente e, ainda assim, não observaram efeitos tóxicos.
Hung et al. (2005) avaliaram, por MTT, a toxicidade de emulsões lipídicas frente a fibroblastos. Compararam diferentes tensoativos e relataram que os não-iônicos são