Avaliação da capacidade antioxidante do óleo de girassol

O óleo de girassol apresentou atividade antioxidante pelos dois métodos avaliados.

5.4.3.1. Método de redução do radical DPPH

Na figura 17 pode ser observada a inibição do radical DPPH pelo óleo de girassol e boa estabilidade da reação após 1 hora. A CE50, calculada através da equação

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Figura 17: Capacidade de inibição do radical DPPH em função da concentração do óleo de girassol após 30 e 60 minutos de reação (média ± desvio padrão, n = 3)

Com essa CE50, o óleo de girassol não se apresenta um antioxidante tão potente

quanto alguns antioxidantes sintéticos como o BHT (CE50 = 0,58 mg/mL) e o α-

tocoferol (CE50 = 0,10 mg/mL) (ZHANG et al., 2006). Contudo, em comparação a

outros óleos vegetais e essenciais como relatado na Tabela 7, sua atividade pode ser considerada satisfatória (ZHANG et al., 2006; SHAHSAVARI et al., 2008; VALAVANIDIS et al., 2004; BAUER et al., 2013).

Tabela 7: Comparação da capacidade redutora de DPPH do óleo de girassol e alguns outros óleos

Amostra CE50 (mg/mL) Referência

Óleo de girassol 6,39 ±0,27 Esse estudo

Óleo de milho 15,0 ±0,9 VALAVANIDIS et al., 2004 Óleo de oliva 17,5 ±1,2 VALAVANIDIS et al., 2004 Óleo de soja 10,0 ±0,5 VALAVANIDIS et al., 2004 Óleo de Licuri (Syagrus

coronata)

0,3336 BAUER et al., 2013 Óleo essencial de

Petroselinum crispum

80,21 ±3,41 ZHANG et al., 2006 Óleo essencial de Bunium

persicum 0,88 ±0,04 SHAHSAVARI et al., 2008 y = 9.2843x - 9.3558 R² = 0.982 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Inib içã o do DP P H ( %) Concentração do óleo (mg/mL) Inibição 30 min Inibição 60 min Linear 30 min

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5.4.3.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado

Utilizando a curva de calibração do α-tocoferol (Figura 16), foi obtida a equação linear que permitiu calcular a concentração deste com absorbância equivalente a da solução de óleo de girassol diluído 10 vezes (Tabela 8).

Tabela 8: Concentração de α-tocoferol com capacidade redutora do radical ABTS equivalente a da solução de óleo de girassol diluído 10 vezes

Concentração de

óleo de girassol média a 720 nm Absorbância Equação Linear Concentração de α-tocoferol 100 mg/mL 0,451 Y= -0,0005x + 0,6671 _R2_{= 0,991} 432,2 µg/mL

De acordo com esses dados foi encontrada uma capacidade de reduzir o radical ABTS de 4322 mg EAT/ kg de óleo. Esses valores confirmam sua capacidade antioxidante, que por esse método, utilizando α-tocoferol como padrão, também foi superior à atividade descrita para os óleos de milho (1300 mg EAT/kg), oliva (300 mg EAT/kg) e soja (1100 mg EAT/kg) (DURMAZ, 2012).

No óleo de girassol são encontrados antioxidantes naturais como os tocoferois e compostos fenólicos. Essas substâncias apresentam elevada capacidade sequestradora de radicais livres e podem ser relacionadas ao potencial antioxidante encontrado por ambas as metodologias avaliadas (WARNER e MOUNTS, 1990; LUDWIG et al., 2011; BAKRE et al., 2014).

O principal componente do óleo de girassol é um ácido graxo considerado essencial, o ácido linoléico – cerca de 65 % (BETT et al., 2004; MARQUES et al., 2004; KOWALSKI, 2007; HSIEH et al., 2008). Esse ácido graxo exerce papel de mediador pró-inflamatório, sendo essencial para a regulação dos eventos bioquímicos que precedem a fibroplasia e estando associado às ações cicatrizantes e anti- inflamatórias comumente relatadas para o óleo (GLASGOW e ELING, 1990; RODRIGUES et al., 2004; MAGALHÃES et al., 2008; BONFERONI et al., 2014).

Topicamente, segundo Marques et al. (2004), o óleo de girassol pode ser considerado um tratamento alternativo para o processo cicatricial de segunda intenção, contribuindo para o fechamento mais rápido de feridas com grande espessura. Ele já tem sido utilizado para esses fins, como um dos componentes do Dersani®, um medicamento empregado no tratamento de lesões cutâneas (MANDELBAUM et al., 2003; GONÇALVES et al., 2010; PRICHOA et al., 2011).

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Baseado no potencial antioxidante, na possível capacidade regeneradora tissular e considerando sua acessibilidade, o óleo de girassol representa uma boa escolha como fase oleosa de nanoemulsões tópicas cuja finalidade é a radioproteção. Apesar de apresentar uma capacidade seqüestradora de radicais livres muito inferior a do EEB, por ser utilizado em concentrações elevadas nas formulações, pode representar um complemento dessa ação.

5.5. Desenvolvimento das nanoemulsões O/A

Dentre as 36 formulações que foram obtidas, as emulsões desenvolvidas utilizando Span 80/ Croduret 50 Special como sistema tensoativo, apresentaram floculação seguida de separação de fases, logo após o preparo (Tabela 9).

Tabela 9: Aspecto macroscópico das emulsões desenvolvidas utilizando Span 80/Croduret 50 Special como sistema tensoativo

Composição Formulação tensoativos (%) Proporção de SP/CRO

Aspecto Macroscópico (logo após o preparo) Composição A (5% de óleo e 5 % de sistema tensoativo) SC1 10/90 Separação de fases SC2 20/80 Separação de fases SC3 30/70 Separação de fases SC4 40/60 Separação de fases SC5 50/50 Separação de fases SC6 60/40 Separação de fases SC7 70/30 Separação de fases SC8 80/20 Separação de fases SC9 90/10 Separação de fases Composição B (10% de óleo e 10 % de sistema tensoativo) SC10 10/90 Separação de fases SC11 20/80 Separação de fases SC12 30/70 Separação de fases SC13 40/60 Separação de fases SC14 50/50 Separação de fases SC15 60/40 Separação de fases SC16 70/30 Separação de fases SC17 80/20 Separação de fases SC18 90/10 Separação de fases

Legenda: SP/CRO = Span 80/Croduret 50 Special

Microscopicamente, 24 horas após o preparo, foram observadas partículas grandes, segregadas e com aspecto coagulado (Figura 18). Essas partículas confirmaram a instabilidade das formulações, sugerindo incompatibilidade do óleo de girassol com o

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sistema tensoativo. Os resultados estão de acordo com Walther et al. (2005) que relataram que nenhuma emulsão combinando Span 80 e esse óleo apresenta estabilidade. Segundo Yang et al. (2012) elevadas concentrações de monooleato de sorbitano, em fase oleosa contendo óleo de girassol, provocam redução da estabilidade e/ou coagulação de micropartículas.

Figura 18: Fotomicrografia de formulações utilizando o sistema tensoativo Span 80/ Croduret 50 Special, 24 horas após o preparo, aumento de 400X. A – emulsão SC5 sob

luz branca comum. B – emulsão SC3 sob luz polarizada

As análises macroscópicas, das formulações utilizando Crill 3/ Croduret 50 Special, realizadas após 24 horas do preparo, podem ser observadas na Tabela 10.

Tabela 10: Aspecto macroscópico das emulsões desenvolvidas utilizando Crill 3/Croduret 50 Special como sistema tensoativo

Composição Formulação tensoativos (%) Proporção de CRI/CRO Aspecto Macroscópico (24 h após o preparo) Composição A (5% de óleo e 5 % de sistema tensoativo) CC1 10/90 Separação de fases CC2 20/80 Separação de fases CC3 30/70 Separação de fases CC4 40/60 Separação de fases CC5 50/50 Separação de fases CC6 60/40 Separação de fases CC7 70/30 Separação de fases CC8 80/20 Separação de fases CC9 90/10 Separação de fases

56 (10% de óleo e 10 % de sistema tensoativo) CC11 20/80 Separação de fases CC12 30/70 Separação de fases CC13 40/60 Emulsão translúcida CC14 50/50 Emulsão translúcida CC15 60/40 Emulsão amarelada CC16 70/30 Separação de fases CC17 80/20 Separação de fases CC18 90/10 Separação de fases

Legenda: CRI/CRO = Crill 3/Croduret 50 Special

As formulações CC1 a CC9, logo após o preparo apresentaram aspecto leitoso característico de emulsões, mas após 24 horas foi observada separação de fases. Microscopicamente, foram observadas floculação e partículas de tamanhos variados, mas sem aspecto coalhado (Figura 19). Provavelmente, a pequena concentração de óleo, apenas 5%, não contribuiu para a estabilidade do sistema. Walther et al. (2005) e Donsi et al. (2012) obtiveram emulsões estáveis utilizando 10% de óleo de girassol na composição da fase oleosa.

Figura 19: Fotomicrografia, sob luz polarizada, de uma das formulações utilizando o sistema tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 10 % de fase oleosa,

emulsão CC5, 24 horas após o preparo, aumento de 400X.

Nas formulações restantes, foram utilizados 10% de óleo de girassol, mas mesmo assim, CC10 a CC12 e CC16 a CC18 apresentaram separação de fases após 24 horas. Microscopicamente, foram observadas floculação e partículas de tamanhos variados, muito semelhantes às observadas de CC1 a CC9.

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A formulação CC15 (60/40-CRI/CRO) apresentou aspecto leitoso característico de emulsões, sendo considerada estável macroscopicamente após 24 horas do preparo. Microscopicamente, foram observadas partículas pouco segregadas, mas de tamanhos variados (Figura 20). Emulsões com glóbulos de tamanhos variados como essa são geralmente pouco estáveis. Quanto mais polidisperso o sistema, maior a diferença de solubilidade relativa do óleo dentro das partículas e mais provável a ocorrência de maturação de Ostwald. Fenômeno onde os glóbulos menores, por sua elevada solubilidade, transferem seu conteúdo para os maiores, levando, no final, à completa separação de fases (CAPEK, 2004; SABERI et al., 2014; WU et al., 2014).

Figura 20: Fotomicrografia, sob luz polarizada, da emulsão CC15, utilizando o sistema tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 20 % de fase oleosa, 24 horas após

o preparo, aumento de 400X

Além disto, o fato de terem sido observadas partículas grandes em CC15, ainda no aumento de 400 vezes, não foi condizente com o esperado para uma nanoemulsão.

As formulações CC13 (40/60-CRI/CRO) e CC14 (50/50-CRI/CRO), estáveis macroscopicamente após 24 horas, apresentaram aspecto transparente azulado (Figura 21) característico de nanoemulsões (SADURNÍ et al., 2005; KLASSEN et al., 2014).

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Figura 21: Emulsão CC13 durante resfriamento sob agitação, com aspecto transparente azulado

Quando avaliadas microscopicamente, não foram observadas partículas em CC13 e CC14, mesmo no maior aumento (Figura 22). Esses resultados permitiram sugerir que os glóbulos formados nas mesmas eram de tamanho reduzido, representando possíveis nanoemulsões.

Figura 22: Fotomicrografia sob luz polarizada, das formulações com aspecto macroscópico de nanoemulsões, 24 horas após o preparo, aumento de 1000X.

A – emulsão CC13. B – emulsão CC14

As combinações de tensoativos empregadas conferiram EHL de 10,34 e 9,4 a CC13 e CC14, respectivamente. Esses valores corroboram para a estabilidade dos sistemas obtidos, pois valores de EHL entre 8 e 13 costumam originar emulsões O/A

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estáveis (AKOH e NWOSU, 1992; NASHY e ABO-ELWAFA, 2011). De acordo com a literatura valores de EHL acima de 10 são ideais para a formação de nanoemulsões O/A, permitindo a formação de gotículas uniformes (KOMMURU et al.,2001; ANJANA et al., 2012).

Com esses resultados pode-se afirmar que para o desenvolvimento de sistemas emulsionados é fundamental encontrar as concentrações de óleo e combinações de tensoativos que originam formulações estáveis. Muitos autores relatam que a composição e a concentração de tensoativos utilizados na fase oleosa influenciam no tamanho dos glóbulos formados e na estabilidade das emulsões (MASON et al., 2006; MORAIS et al., 2006; BAZYLINSKA et al., 2014; KOMAIKO e MCCLEMENTS, 2014).

5.6. Determinação da distribuição granulométrica

As emulsões CC13 e CC14 foram selecionadas para determinação do diâmetro das partículas e dispersão das mesmas. CC13 apresentou tamanho de 81,2 ±4,27 nm, com IP de 0,09 ±0,094. CC14 apresentou tamanho de 77,1 ±1,28 nm, com IP de 0,156 ±0,025. Em ambos os casos, os diâmetros das partículas encontram-se na faixa de tamanho característico de nanoemulsões (IZQUIERDO et al., 2004; LI et al., 2011; REBOLLEDA et al., 2015). O IP é uma medida da amplitude da distribuição de tamanho. Tanto CC13 quanto CC14 apresentaram pequeno IP (inferior a 0,3), podendo ser consideradas nanoemulsões monodispersas (LI et al., 2011; GORAIN et al., 2014).

O tamanho dos glóbulos de uma emulsão depende do método de emulsificação empregado. Os resultados obtidos demonstram a eficiência do método de emulsificação por inversão de fases na obtenção de nanoemulsões. Método esse que consome baixa energia no processo de formação de emulsões, sendo econômico e indo de encontro à demanda industrial (SADURNÍ et al., 2005; MORAIS, 2008; DAVIDOV-PARDO e MCCLEMENTS, 2015).

5.7. Testes preliminares de estabilidade

As formulações CC13 e CC14 foram consideradas macroscopicamente estáveis 24 horas após seu preparo e, através da determinação do diâmetro médio das partículas,

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foram confirmadas como nanoemulsões, sendo submetidas aos testes de estresse térmico e centrifugação.

5.7.1. Estresse térmico

As nanoemulsões CC13 e CC14 permaneceram com suas características macroscópicas inalteradas, mesmo quando submetidas à temperatura de 80 ± 2 ºC. Em relação à distribuição granulométrica, CC14 não apresentou variação estatística significativa (p > 0,05) e CC13 apresentou uma pequena variação na distribuição, com significância de 0,07 (Tabela 11). Mesmo com essa pequena alteração observada no diâmetro das partículas de CC13, a formulação apresentou aspecto e características de uma nanoemulsão.

Tabela 11: Resultados da distribuição granulométrica após o teste de estresse térmico (média ± desvio padrão, n = 3)

Amostra _{Tamanho (nm)} Após 24h do preparo _{IP Tamanho (nm)} Após estresse térmico _IP

CC13 81,2 ±4,27 0,090 90,93 ±1,75 0,132

CC14 77,1 ±1,28 0,156 77,23 ±1,59 0,147

Legenda: IP = índice de polidispersão

O teste de estresse térmico permite um incremento de energia cinética ao sistema, observando a susceptibilidade do mesmo a essa situação. Apenas uma pequena variação foi observada em CC13 após um aumento muito significativo da temperatura, indicando que ambas nanoemulsões mantiveram a estabilidade (PEREIRA 2008; GORIAN et al., 2014).