Adsorção em Leito Expandido

A viabilidade econômica de um bioprocesso está diretamente ligada ao número e eficiência das etapas necessárias durante a purificação, a fim de alcançar as especificações dos produtos solicitados. Adsorção em Leito Expandido (ALE) é um processo integrado que combina a separação sólido-líquido e a recuperação do produto numa única operação unitária. Esta abordagem sugere um aumento do rendimento global, menor necessidade de investimentos de capital e de consumo e, sobretudo, uma redução do tempo de processo. O sucesso de um processo de integração é, no entanto, intimamente ligada a uma compreensão detalhada dos princípios bioquímicos envolvidos e as limitações decorrentes da complexidade de matéria-prima (Hubbuch et al., 2005).

A ALE permite que proteínas sejam recuperadas diretamente a partir de cultura de microrganismos ou de células, sem a necessidade de remoção prévia de sólidos suspensos. O desempenho geral da ALE é comparável à de um leito empacotado devido à redução da mistura das partículas de adsorvente na coluna. No entanto, as condições ideais de operação são mais restritas devido à dependência da expansão do leito e a densidade requerida das partículas de adsorvente, bem como a viscosidade e a densidade da matéria-prima. A composição da matéria- prima pode se tornar mais uma restrição limitante devido às interações das partículas adsorventes com superfície das células, DNA e outras substâncias, levando a sua agregação e, consequentemente, a instabilidades do leito e formação de canais preferenciais. Apesar destas dificuldades, a ALE tem encontrado aplicações generalizadas na purificação em grande escala de proteínas de células de mamíferos e microbianas (Anspach et al., 1999).

O estudo e uso de leito fluidizado como ferramenta cromatográfica passou a ser utilizado com maior efetividade a partir da década de 90 (Draeger & Chase, 1990). A partir da introdução

de novos tipos de adsorventes destinados a operação em leito expandido, linha streamline produzida pelo grupo Amersham Phamarcia Biotech atual G&E, foi possível uma maior estabilidade do leito e um aumento na faixa de velocidade de operação (100-300 cm.h-1) (Padilha, 2013).

A matriz do adsorvente deve mostrar características de fluidização adequadas. Em particular, o leito deve ter a capacidade de expansão requerida (cerca de duas a três vezes a altura do leito fixo) quando aplicada uma velocidade de fluxo adequada. Existe uma estreita relação entre a altura do leito expandido e a velocidade de fluxo, a qual depende criticamente das propriedades físicas do adsorvente e da alimentação utilizada. Além disso, as partículas do adsorvente devem possuir faixas de diâmetro que sejam adequadas para geração de uma expansão estável (Chase, 1994).

O comportamento fluidinâmico do leito expandido engloba três características primordiais, o regime de escoamento, o grau de mistura e a possibilidade de existência de camada estagnada entre o fluido e o adsorvente. Pode-se ressaltar que a Adsorção em Leito Expandido se baseia na manutenção da fluidização estável (mais semelhante ao escoamento

plug-flow), estabelecendo um balanço entre as propriedades fluidodinâmicas entre o leito

fluidizado e as propriedades cromatográficas do leito fixo (Padilha, 2013).

Durante a operação de uma coluna em leito expandido para purificação de bioprodutos é essencial o conhecimento do comportamento leito em função das propriedades das partículas do adsorvente e da solução de alimentação. Esta caracterização é baseada no mensuramento do grau de expansão em função da velocidade e viscosidade do fluido, na presença de contaminantes como células microbianas e na distribuição das partículas do adsorvente (Moraes et al., 2013).

Uma das formas de conhecer o comportamento de um leito expandido e o seu regime de escoamento, em função das propriedades físicas das partículas e do fluido, é por meio da equação de Richardson-Zaki (Richardson & Zaki, 1954). Pela teoria, a velocidade terminal de uma partícula esférica (Ut) é influenciada pelo movimento das outras (interferência

populacional), conforme Equação 3 (Padilha, 2013):

𝒖 = 𝒖𝑻 . 𝜺𝒏

Sendo u a velocidade superficial, ε refere-se a porosidade do leito, uT é a velocidade terminal de

Esse modelo descreve a influência da população sobre a velocidade terminal individual, sendo fundamental para avaliar a expansão do leito quando este alcança o equilíbrio (Padilha, 2013). Os parâmetros uT e n são determinados pela linearização da Equação 3:

𝑙𝑛 𝑢 = 𝑙𝑛 𝑢𝑇+ 𝑛 . 𝑙𝑛 𝜀 Eq.4

A porosidade do leito pode ser estimada em função da altura total de expansão do leito (Moraes et al., 2013):

𝜺 = 𝟏 − (𝟏 − 𝜺_𝟎).𝑯𝟎

𝑯 Eq. 5

Onde ε0 e H0 são a porosidade e altura do leito sedimentado, respectivamente. Admite-se que ε0

tem valor igual a 0,4 (Moraes et al., 2013).

Outra informação importante a ser aferida sobre o sistema é a capacidade dinâmica de ligação. Esta normalmente é determinada quando a concentração de proteína ou a atividade enzimática no efluente da coluna alcança 10% da concentração ou atividade inicial (C/C0=0,1 ou U/U0=0,1), assim há redução de perda da molécula alvo no escoamento. A capacidade dinâmica de ligação (QB), definida como concentração de proteína ou unidade de enzima adsorvida por massa do adsorvente, pode ser calculada de acordo com a Equação 6:

𝑸_𝑩 = 𝑪𝟎(𝑽𝒇−𝑽𝒎) ∫𝑽𝒎𝑽𝒇𝑪𝒅𝑽

𝒎𝒂𝒅𝒔 Eq. 6

Onde C0 é a concentração de proteína (mg.mL-1) ou a atividade enzimática inicial (U.mL-1), Vf é

o volume final de solução de alimentação, Vm é o volume a 10% de ruptura (mL) e mads refere-se

a massa de adsorvente (g).

O ciclo de operação básico da ALE é composto pelas etapas de equilíbrio, aplicação da amostra, lavagem, eluição e posterior limpeza da resina (Figura 3). As estratégias de otimização de cada etapa são, em geral, semelhantes às adotadas em um processo de leito convencional (Chase, 1994).

Figura 3: Ciclo básico de operação da ALE. As setas indicam a direção do escoamento. Fonte: Amersham Pharmacia Biotech.

O processo de ALE também é operado de forma muito semelhante ao processo empacotado. A principal diferença é a direção do fluxo do líquido. Uma velocidade de fluxo mais baixa pode ser usada se a viscosidade da matéria-prima for muito alta. Isto pode prevenir uma expansão muito elevada (Hjorth, 1997).

No início do protocolo de purificação, o adsorvente sedimentado necessita ser convertido em um leito expandido e estável antes da aplicação da alimentação contendo material particulado. Para isso uma solução tampão é aplicada e esta flui através do leito, inicialmente sob um baixo fluxo e sendo gradualmente elevado até que se atinja uma altura duas vezes maior que a inicial. Feito isso a amostra pode ser aplicada no sistema. Entretanto, as propriedades físicas da alimentação podem ser diferentes daquelas do tampão usado na expansão inicial do leito. Como consequência, se o fluxo não for reduzido, a extensão da expansão do leito poderá aumentar. Após aplicação da amostra, inicia-se a etapa de lavagem (Chase, 1994).

A etapa de lavagem de um processo de leito expandido tem a dupla função de remoção de matéria-prima mantida dentro dos espaços vazios inter e intrapartícula do adsorvente e, em alguns casos, remoção de material fracamente adsorvido (Chase, 1994).

Depois do material não ligado ter sido lavado da resina (etapa de lavagem), o fluxo é interrompido e deixa-se a resina sedimentar. A etapa de eluição geralmente é realizada em modo empacotado e a uma velocidade reduzida, normalmente 100 cm.h-1 para manter baixo o volume da fração eluída. A eluição também pode ser realizada com o leito expandido, mas tem sido descrito um aumento de 40% no volume da fração eluida (Hjorth, 1997).

Um importante estágio na operação de um leito expandido é o procedimento de limpeza e regeneração da resina. Este procedimento é realizado para manter a funcionalidade do adsorvente, garantir que todas as impurezas tenham sido removidas e evitar a passagem de contaminante entre amostras de resina. A maioria dos procedimentos de limpeza inclui a utilização de hidróxido de sódio em concentrações de 0,5 a 1M. Este tratamento deve ser realizado durante um período controlado de tempo (3-4 horas), para permitir que os contaminantes sejam removidos. O hidróxido de sódio é geralmente combinado com outras soluções, tais como 10% de ácido acético ou solventes orgânicos como etanol 20% (Hjorth, 1997).

Nos últimos anos, a ALE tem sido empregada na purificação das mais diversas biomoléculas, das quais pode-se citar a purificação de ácido salvinólico e alcalóides (Li et al., 2014), lactoferrina e imunoglobulina G (Du et al., 2014), ficocianina C (Moraes et al., 2013), antígeno recombinante da Hepatite B (Ng et al., 2012) e β-galactosidade (Boeris et al., 2012).

Conforme relatado anteriormente, é comum o uso de resinas de troca iônica em leito empacotado para purificação de quitosanases, recentemente também foi relatado o uso de resinas de troca iônica, linha Streamline, para purificação de duas quitosanases produzidas pelo fungo

Metarhizium anisopliae (de Santana et al., 2014).

Tendo em vista o exposto, no presente estudo foi adotada a estratégia de planejamento experimental com a realização de um Planejamento Composto Central para o estudo de uma estratégia de purificação de uma quitosanase utilizando ALE.