Produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas por microrganismo isolado no Nordeste Brasileiro

Texto

(1)RENORBIO Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas por microrganismo isolado no Nordeste Brasileiro. Nathália Kelly de Araújo. NATAL/RN 2015.

(2) NATHÁLIA KELLY DE ARAÚJO. Produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas por microrganismo isolado no Nordeste Brasileiro. Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - Renorbio, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.. Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Co-Orientador: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo. NATAL/RN 2015.

(3) Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências. Araújo, Nathália Kelly. Produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas por microrganismo isolado no Nordeste brasileiro / Larissa Maria da Rocha Meira. – Natal, RN, 2015. 116 f.: il. Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos. Coorientadora: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de PósGraduação em Biotecnologia. 1. Cromatografia em leito expandido – Tese. 2. Bacillus Cereus. – Tese. 3. Quitosanase. – Tese. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 543.54.

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(5) Aos meus pais, Maria Aurea de Araújo e Otávio de Barros Neto que me enchem de inspiração e força para que eu nunca desista da batalha da formação profissional. Que vocês estejam ao lado de espíritos de luz! Eu amo vocês!. iv.

(6) AGRADECIMENTOS É com muita satisfação que escrevo meus agradecimentos a todas as pessoas de extrema importância na minha vida pessoal e profissional que de alguma forma contribuíram para a conclusão de mais essa importante etapa em minha vida. Primeiramente agradeço a Deus e espiritualidade por clarear minha mente e dar tranquilidade e confiança para execução desse trabalho; A Tiago pelo amor, incentivo e confiança durante os momentos fáceis e difíceis; A minha Tia Zélia Barros, pelos conselhos e carinhos tão valiosos; Aos meus irmãos, Alex, Eugênia, Paulo e Sandra pelo suporte acadêmico e sentimental; A todos os demais familiares, pelo apoio inegável na concretização dessa jornada; Ao professor Dr. Everaldo Silvino dos Santos, do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela orientação e compreensão durante a realização deste trabalho; À professora Dra. Gorete Ribeiro de Macedo do Departamento de Engenharia Química pela coorientação, pela amizade, pelos conselhos, por estar sempre disposta a ensinar e esclarecer dúvidas, e pelo crescimento profissional e pessoal proporcionados com o seu convívio. Muito obrigada, professora, por também ter me acolhido como sua aluna de iniciação científica; Aos professores, Sueli Rodrigues, Cristiane Assis e Matheus Pedrosa, componentes da banca de qualificação, pela enorme contribuição para o aperfeiçoamento do trabalho; Aos professores Eliana Kamimura, Michelle Vaz, Cristiane Assis e Matheus Pedrosa, componentes da banca de defesa, por aceitarem participar da avaliação final desse projeto; v.

(7) Ao colega e técnico de laboratório Francisco Canindé de Sousa Júnior pela ajuda durante as disciplinas e na realização de experimentos; A Carlos Padilha, colega de laboratório, pela imensurável ajuda na elaboração de experimentos, na interpretação de resultados e entendimento de todas as equações e números próprios da engenharia; Aos, também colegas e professores de laboratório, Michelle, Sérgio, Ruthinéia e Francinaldo, pela alegria e determinação que passam as pessoas ao seu redor; À Maria Luiza Xavier, aluna de iniciação científica que atuou nesse trabalho e tornou-se uma grande amiga. Malu, com você aprendi mais que ensinei. Sua doçura, afeto e dedicação é algo que não se encontra em qualquer lugar; A todos os demais alunos de iniciação científica que dividiram e contribuíram enormemente com esse trabalho. Em especial Humberto Arimatéia, Rafael Costa e Vanessa Pimentel; Ao aluno de intercâmbio Jean Haury, pela troca de experiências e conhecimentos; Aos demais colegas de laboratório pela boa convivência; As minhas amigas e colegas de mestrado, Larissa Lira, Dayse Santos e Dayse Caroline, que me ouviram e ajudaram durante os experimentos; À Ana Katarina Andrade Silva pela colaboração nos experimentos de identificação dos microrganismos; Aos colegas de departamento e funcionários, sempre garantindo um ambiente adequado e organizado necessários para o bem estar do nosso ambiente de trabalho;. vi.

(8) Às turmas de Farmácia e Engenharia Química pela paciência e pela oportunidade concedida durante as aulas ministradas por mim no estágio a docência; A coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES), pelo incentivo financeiro durante meu doutorado.. vii.

(9) “É. preciso. provocar. sistematicamente confusão. Isso promove a criatividade. Tudo aquilo que é contraditório gera vida”. Salvador Dalí. viii.

(10) RESUMO Uma cepa produtora de quitosanase foi isolada e identificada como Bacillus cereus C-01. A partir de extratos enzimáticos obtidos em cultivos submersos, foi efetuada a purificação da enzima e sua caracterização bioquímica. Para purificação foi utilizada a resina da linha Streamline DEAE e coluna de vidro (2,6 cm x 30,0 cm) acoplada a uma bomba peristáltica, em sistema de Adsorção em Leito Expandido (ALE). As condições para a purificação da quitosanase foram otimizadas estatisticamente através de um Planejamento Composto Central. Investigou-se as variáveis que influenciaram significativamente nos parâmetros fator de purificação (P) e rendimento da enzima (Y). As análises estatísticas mostraram que as melhores condições para o máximo P foram 150 cm.h-1 (velocidade de aplicação da amostra/carga), 6,0 cm de altura do leito fixo e 7,36 cm de altura do distribuidor. Em condições otimizadas, a enzima mostrou ligarse a resina na mesma medida usando caldo clarificado e não clarificado (0,32 e 0,30 U/g adsorvente, respectivamente). Em testes qualitativos do método empregado, a fração recuperada após a eluição exibiu 31% de rendimento e um aumento de 3,6 vezes na atividade específica em relação ao inicial. Considerando apenas a fração eluída com NaCl 0,3 M foi possível obter um fator de purificação de 1,75. A enzima purificada apresentou massa molecular aparente de 33 kDa, estabilidade entre as faixas de temperaturas e pH de 30 – 55 ºC e 5,5 – 8,0, respectivamente, e máxima atividade em pH 5,5 e temperatura de 55 ºC. Os íons de Cu2+, Fe2+ e Zn2+ foram inibitórios para a quitosanase. Em contraste, a enzima foi significativamente ativada por Mn2+. Os resultados demonstraram que é possível purificar múltiplas proteínas, a partir de um extrato bruto sem qualquer pré-tratamento, com um processo de purificação econômico e de um único passo. Palavras chaves: B. cereus, cromatografia em leito expandido, quitosanase.. ix.

(11) ABSTRACT A chitosanase-producing strain was isolated and identified as Bacillus cereus C-01. From enzyme extract obtained from submerged cultures, the purification of the enzyme and biochemical characterization were studied. For purification was used Expanded Bed Adsorption (EBA) system with a Streamline DEAE resin and a glass column (2.6 cm x 30.0 cm) coupled to a peristaltic pump. The conditions for the purification of chitosanase were statistically optimized using a Central Composite Design (CCD). The variables that significantly influenced parameters of the purification factor (P) and enzyme yield (Y) were determined. Statistical analyses showed that the optimum conditions for maximum P were 150 cm.h-1 (load flow velocity), 6.0 cm of settled bed height and 7.36 cm distributor height. In the optimized conditions, the enzyme bound to resin on the same extent using clarified and unclarified broth (0.32 and 0.30 U/g adsorbent, respectively). The optimization of purification variables resulted in an approximately 3.66-fold increase in P compared with that observed under not optimized conditions. The fraction recovered after the elution exhibited 31% of the yield. If considered only the eluted fraction with 0.3 M NaCl was possible to obtain a purification factor of 1.75. The purified enzyme showed an apparent molecular mass of 33 kDa, pH and temperature stability between ranges of 30 – 55 °C and 5.5 – 8.0 respectively, as well as maximal activity at pH 5.5 and temperature 55 °C. The ions Cu+2, Fe+2 and Zn+2 showed inhibitory effect for chitosanse. In contrast, the enzyme was significantly activated by Mn+2.The results demonstrated that it is possible to purify multiple proteins from crude feedstock with an economic process and single-step purification. Keywords: B. cereus, expanded-bed chromatography, chitosanase.. x.

(12) LISTA DE FIGURAS Fundamentação Teórica Figura 1: Estruturas químicas da quitina, quitosana e COS. Fonte: Lodhi et al., 2014. .............................. 5 Figura 2: Modo de ação de uma quitosanase (a) e uma exo-β-D-glicosaminidase. Fonte: (Thadathil & Velappan, 2014). ........................................................................................................................................... 8 Figura 3: Ciclo básico de operação da ALE. As setas indicam a direção do escoamento. Fonte: Amersham Pharmacia Biotech. ................................................................................................................... 18. Artigo: Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using Expanded Bed Adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD) Figure 1: Response surfaces for 23 central composite designs (a) X1 – X2 (purification factor); (b) X1 – X3 (purification factor); (c) X2 – X3 (purification factor); (d) X1 – X2 (Enzyme yield); (e) X1 – X3 (Enzyme yield); (f) X2 – X3 (Enzyme yield). ............................................................................................................. 44 Figure 2: The experimental data versus the predicted data of normalized of purification factor (a) and enzyme yield (b). ........................................................................................................................................ 45 Figure 3: Chromatographic profile of crude extract from Bacillus cereus in streamline DEAE ion exchange column. The column was previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 (Buffer A) and the sample was eluted from column with 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5 containing 0.3, 0.7 and 1.0M NaCl (Step wise). ........................................................................................................................................ 46. Artigo: Single-step purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed chromatography Figure 1: Time-course of cell growth, chitosanase activity and protein content. C-01 was grown aerobically in broth medium at 30 ºC for 72 hours: (■) Chitosanase activity, (○) total protein, (●) pH and (□) DNA content. ........................................................................................................................................ 58 Figure 2: Bed expansion height in function of superficial velocity of fluid. Unclarified (□) and clarified culture broth (■). ......................................................................................................................................... 59 Figure 3: Effect of the presence of cells on the breakthrough curve behaviour of chitosanase into the resin Streamline DEAE. Unclarified (□) and clarified culture broth (■). ........................................................... 60 Figure 4: Effect of expansion degree on the breakthrough curve behaviour of chitosanase into the resin Streamline DEAE by using unclarified broth. Expansion degree of 1.2 (■), 1.5 (●) and 2.0 (▲). ............ 61 Figure 5: The elution profile of chitosanase after adsorption of broth culture on Streamline DEAE. Content of protein (○) and enzyme activity (■). ......................................................................................... 61. xi.

(13) Figure 6: SDS-PAGE analysis of the chitosanase from B. cereus C-01. Lanes: M- molecular markers; 1culture supernatant; 2- load; 3- washing; 4- fraction eluted with 0.3 M NaCl; 5- fraction eluted with 0.7 M NaCl; 6- zymogram analysis for fraction eluted with 0.3 M NaCl; 7- zymogram analysis for fraction eluted with 0.7 M NaCl. .............................................................................................................................. 62 Figure 7: Effects of pH on the activity (■) and stability of chitosanase (●). The pH stability profile to the enzyme was determined by measuring the residual enzyme activity at pH 6 after 24 hours of incubation in different pH values (3.0 – 10.0) at 4 ºC. ..................................................................................................... 64 Figure 8: Effects of temperature on the activity (■) and stability of chitosanase (●). The enzymatic samples were incubated for 60 minutes at temperature ranging from of 30 ºC to 80 ºC. ........................... 65 Figure 9: Effect of ions on chitosanase activity. The enzymatic samples were incubated at 4 ºC for 2 hours in the presence of: Mg2+, Cu2+, Fe2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+ and Ba2+. ..................................................... 66. xii.

(14) LISTA DE TABELAS Artigo: Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using Expanded Bed Adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD) Table 1: Matrix of CCD to coded and uncoded level of independent variables. ........................................ 39 Table 2. Central Composite design variables (coded factor and levels) and effect estimates for screening of factors affecting purification factor (P) and enzyme yield (Y). .............................................................. 41 Table 3: Analysis of variance (ANOVA) for central composite design of purification factor and enzyme yield. ........................................................................................................................................................... 42. Artigo: Single-step purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed chromatography Table 1: Purification of the chitosanase from B. cereus C-01 .................................................................... 62. xiii.

(15) LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS AE. Atividade enzimática. ANOVA. Análise de Variância - Analysis of variance. BSA. Soro Albumina Bovina - Bovine Serum Albumin. CCD. Planejamento Composto Central - Central Composite Design. COS. Quitooligossacarídeos - Chitooligoshcarides. DEAE. Dietilaminoetil. Df. Graus de Liberdade - Degrees of freedom. DP. Desvio padrão. EBA. Adsorção em Leito Expandido - Expanded Bed Adsorption. Eq.. Equação - Equation. GH. Glicosilhidrolases - Glicosil Hidrolases. GlcN. Glucosamina. GlcNAc. N-acetilglucosamina. GP. Grau de polimerização. kDa. Quilodalton - kilodaltons. MLEE. Eletroforese de enzimas multilocos. P. Fator de Purificação - Purification factor xiv.

(16) PAGE. Eletroforese. em. gel. de. poliacrilamida. -. polyacrylamide. gel. electrophoresis. PCR. Reação em Cadeia da Polimerase - Polymerase Chain Reaction. PFGE. Eletroforese em gel de campo pulsado. Y. Redimento da Enzima - Enzyme yield. rpm. Rotações por minuto. RSM. Metodologia de Superfície de Resposta - Response Surface Methodology. SDS. Dodecil Sulfato de Sódio - Sodium dodecyl sulfate. xv.

(17) SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................ xi LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. xiii LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS ............................................................................................... xiv 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................... 2 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ......................................................................................................... 5 2.1. Quitina e Quitosana ........................................................................................................................... 5 2.2. Hidrólise da Quitosana ....................................................................................................................... 7 2.3. Produção de Quitosanases ................................................................................................................. 9 2.4. Bactéria Bacillus cereus.................................................................................................................... 10 2.5. Quitooligossacarídeos ...................................................................................................................... 11 2.6. Purificação de proteínas .................................................................................................................. 13 2.7. Adsorção em Leito Expandido .......................................................................................................... 15 3. REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 19 4. OBJETIVOS.......................................................................................................................................... 32 4.1. Objetivo geral ................................................................................................................................... 32 4.2. Objetivos específicos ........................................................................................................................ 32 5. ARTIGOS DERIVADOS DA TESE ................................................................................................... 34 Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using Expanded Bed Adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD) .................................................................... 35 Abstract...................................................................................................................................................... 35 INTRODUCTION..................................................................................................................................... 36 MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................. 37 Materials .................................................................................................................................................... 37 Isolation and identification of chitosanolytic bacterium ....................................................................... 37 Chitosanase production ............................................................................................................................ 37. xvi.

(18) Analytical methods.................................................................................................................................... 38 Experimental Designs ............................................................................................................................... 38 Operation of EBA ..................................................................................................................................... 39 RESULTS AND DISCUSSION ............................................................................................................... 40 Identification of chitosanase-producing strain ....................................................................................... 40 CCD and Model fitting ............................................................................................................................. 40 Analysis of variance (ANOVA) ................................................................................................................ 42 Response surface methodology (RSM) .................................................................................................... 43 Test of the model ....................................................................................................................................... 45 CONCLUSION ......................................................................................................................................... 46 REFERENCES .......................................................................................................................................... 47 Single-step purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed chromatography 51 Abstract...................................................................................................................................................... 51 INTRODUCTION..................................................................................................................................... 52 MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................. 53 Materials .................................................................................................................................................... 53 Isolation and identification of chitosanolytic bacterium ....................................................................... 53 Chitosanase production ............................................................................................................................ 53 Hydrodynamic of the bed ......................................................................................................................... 54 Operation of EBA ..................................................................................................................................... 54 Dynamic binding capacity ........................................................................................................................ 55 Effect of pH and temperature on the enzyme activity ........................................................................... 55 Effect of various chemicals and surfactants on the enzyme activity .................................................... 56 Analytical methods.................................................................................................................................... 56 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and zymogram analysis 56 RESULTS AND DISCUSSION ............................................................................................................... 57. xvii.

(19) Identification of chitosanase-producing strain ....................................................................................... 57 Production of chitosanase from Bacillus cereus C-01 ............................................................................ 57 Hydrodynamic of the bed ......................................................................................................................... 58 Dynamic binding capacity ........................................................................................................................ 59 Purification of chitosanase ....................................................................................................................... 61 Effect of pH and temperature .................................................................................................................. 63 Effect of various ions on enzyme activity ................................................................................................ 65 CONCLUSION ......................................................................................................................................... 66 REFERENCES .......................................................................................................................................... 67 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................................... 74 7. APÊNDICE............................................................................................................................................ 77. xviii.

(20) Introdução.

(21) Introdução 2. 1. INTRODUÇÃO A busca por moléculas com potencial terapêutico tem guiado a pesquisa em diversas partes do mundo. Parte dessas pesquisas está orientada na busca de moléculas naturais de origem vegetal, fúngica, bacteriana e animal. O segundo polímero mais abundante na natureza é a quitina, perdendo em biodispobilidade apenas para a celulose. A quitina é um polímero catiônico natural com estrutura e propriedades únicas, encontrado como componente estrutural da parede celular de fungos zigomicetos e algas clorofíceas, assim como no exoesqueleto de artrópodes (Thadathil & Velappan, 2014). A quitosana é a principal molécula desacetilada derivada da quitina, embora a desacetilação não seja total. Atualmente a quitosana adquirida comercialmente é produzida de quitina de crustáceos pela N-desacetilação usando soluções alcalinas e altas temperaturas (Thadathil & Velappan, 2014). Quitosana com grau de polimerização (GP) menor que 20 e massa molecular média de 3900 Da são chamados de oligômeros de quitosana, quitooligômeros ou quitooligossacarídeos (COS) (Mourya et al., 2011). Os COS são gerados pela depolimerização da quitosana usando hidrólise ácida, física ou degradação enzimática (Aam et al., 2010). Recentemente, os COS têm sido objeto de interesse em termos farmacêuticos e medicinais devido a sua não toxicidade, solubilidade, assim como os seus efeitos fisiológicos positivos (Lodhi et al., 2014). A hidrólise da quitosana, com o objetivo de produzir COS para uso biológico, envolve o uso de enzimas. O método de hidrólise enzimático envolve o uso de quitosanases e outras enzimas não específicas; este método é realizado em condições de operação brandas e permite um controle do tamanho do produto (Lodhi et al., 2014). Pouco tem sido descrito sobre o isolamento de microrganismos produtores de quitosanases a partir de solos do litoral do Nordeste do Brasil, mesmo sendo esta região grande produtora de crustáceos. Vale ressaltar que o principal componente do exoesqueleto dos crustáceos é a quitina. A obtenção de enzimas de interesse econômico de forma mais eficiente e com baixo custo de produção é uma das áreas de pesquisa em ascensão em biotecnologia. Neste trabalho foram isoladas quinze cepas bacterianas. As duas que apresentaram maior potencial para produção de quitosanases, foram identificadas por métododos moleculares:. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(22) Introdução 3. Bacillus cereus e Serratia marcescens. Entre essas duas, a maior produção de quitosanase foi observada no cultivo do B. cereus, assim, amostras do cultivo dessa cepa foram utilizadas em todas as etapas subsequentes dessa tese. A presente tese de doutorado teve como objetivo geral isolar e selecionar novos microrganismos produtores de quitosanases, com alto potencial de hidrólise da quitosana, produzir enzimas com atividade quitosanolítica, caracterizar tais enzimas bem como purificá-las. A tese está dividida da seguinte forma: após uma breve introdução, desenvolvida nesse capítulo, na qual foi contextualizada a importância da mesma, segue-se uma revisão da literatura, na qual são apresentados os fundamentos teóricos para os capítulos seguintes, seguida dos objetivos gerais e específicos, assim como da lista de refêrencias consultadas nessa primeira parte do trabalho. Destaca-se que, na presente tese, a metodologia bem como os resultados e as discussões desenvolvidas na mesma serão apresentados na forma de artigos que foram submetidos para periódicos. Os artigos são apresentados no formato que foram enviados para os periódicos. Em seguida, apresentam-se as considerações finais sobre o trabalho. Por fim, na forma de apêndice, apresenta-se um modelo matemático sobre o processo de purificação empregado nesse trabalho de doutorado. Este estudo matemático foi concebido em parceria com um aluno do Grupo de Engenharia de Bioprocessos do Programa de Pós-graduação em Engenharia Química. Grupo esse no qual também foi desenvolvida a presente tese.. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(23) Fundamentação Teórica.

(24) Fundamentação Teórica 5. 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1. Quitina e Quitosana Quitina é o segundo polímero mais abundante na natureza. É um polímero catiônico natural linear de alta massa molecular composto de unidades de N-acetil-D-glicosamina unidas por ligações β (1→4) (Aam et al., 2010), conforme estrutura apresentada na Figura 1. A quitina apresenta propriedades únicas, sendo encontrada como componente estrutural da parede celular de fungos zigomicetos e algas clorofíceas, assim como no exoesqueleto de artrópodes (Thadathil & Velappan, 2014). Na sua forma natural é encontrada como microfibrilas cristalinas (Perrin et al., 2014).. Figura 1: Estruturas químicas da quitina, quitosana e COS. Fonte: Lodhi et al., 2014.. Destaca-se que a imunogenicidade da quitina é excepcionalmente baixa, apesar da presença de nitrogênio. Assim como a celulose, a quitina é um material altamente insolúvel e de Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(25) Fundamentação Teórica 6. baixa reatividade química. Sua única diferença química com a celulose, polissacarídeo mais abundante na natureza, é a substituição de um grupo hidroxila em C-2 por um grupo amino acetilado. Tem coloração branca e é inelástica (Lodhi et al., 2014). A quitina existe em duas formas cristalinas polimórficas, α e β. A α-quitina consiste de folhas fortemente empacotadas alternando entre cadeias paralelas e antiparalelas. Esta forma da quitina é encontrada no exoesqueleto de artrópodes, insetos e na parede celular de fungos e leveduras. A β-quitina ocorre com menos frequência na natureza do que a α-quitina, mas pode ser extraída de gladius de lula (Aam et al., 2010). Além da sua aplicação como matéria-prima para obtenção da quitosana e COS, a quitina tem sido o centro de várias aplicações terapêuticas e tem se mostrado um promissor biomaterial para engenharia de tecidos e na tecnologia de células tronco (Lodhi et al., 2014). A partir da desacetilação química da quitina, ou por bioconversão utilizando quitina desacetilases, obtêm-se a quitosana (Pareek et al., 2013). A quitosana é um amino polissacarídeo composto principalmente de unidades de 2-amino-2-deoxi-D-glicose, também conhecido por glicosamina (GlcN), ligadas linearmente por ligações glicosídicas β-1,4 com grau de acetilação variado (Khor, 2014). A quitosana possui similaridade estrutural com glicosaminoglicanos e tem sido amplamente investigada como um biomaterial natural para diversas aplicações biomédicas devido a sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades antimicrobianas e funcionalidade (Jiang et al., 2014). As aplicações da quitina são limitadas quando comparadas com a da quitosana. A quitina é quimicamente inerte e insolúvel tanto em água com em ácido, enquanto a quitosana é relativamente reativa e pode ser produzida de várias formas. A quitosana é normalmente insolúvel em pH neutro e básico, porém torna-se solúvel em pH ácido. A solubilidade da quitosana depende da distribuição de grupos amino livres e N-acetil. Em ácidos diluídos (pH < 6,0), os grupos amino são protonados e a molécula torna-se solúvel (Lodhi et al., 2014). Atualmente, a quitina e quitosana comercializadas são produzidas a partir do exoesqueleto de caranguejos e camarões, assim como da concha interna de lulas (Jung & Park, 2014). A produção da quitosana envolve desproteinização, desmineralização e desacetilação. As características desses biopolímeros dependem do processo e condições de produção. Características como aparência do polímero, turbidez em solução, grau de desacetilação e massa molecular são de grande importância para aplicações biológicas e industriais (Nwe et al., 2014).. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(26) Fundamentação Teórica 7. 2.2. Hidrólise da Quitosana A hidrólise da quitosana é um processo similar ao que ocorre com outros polissacarídeos, na qual a presença de determinados agentes (ácidos ou enzimas) rompe as ligações glicosídicas. Os quitooligossacarídeos (COS), gerados a partir dessa hidrólise, apresentam variações tanto no grau de polimerização (GP) como na sequência das unidades de glicosamina (GlcN) e Nacetilglicosamina (GlcNAc) do oligômero gerado (Kim & Rajapakse, 2005). Para produção em larga escala de COS, a hidrólise ácida é comumente usada para clivar as ligações glicosídicas da quitosana. Entretanto, a hidrólise química resulta em baixa produtividade de COS e uma grande quantidade de unidades monoméricas de D-glicosamina. Normalmente a hidrólise química é realizada usando ácido clorídrico, nitroso, fosfórico, ou hidrofluorídrico. Entretanto, devido à complexidade de controle do processo de reação, estes tratamentos também resultam na formação de compostos secundários que são de difícil remoção (Mourya et al., 2011; Lodhi et al., 2014). Dessa forma, os COS preparados por método ácido são de difícil aplicação como material bioativo devido à possibilidade de contaminação com componentes tóxicos. Por outro lado, a hidrólise enzimática da quitosana tem sido proposta como método preferencial para produção de COS bioativos (Kim & Rajapakse, 2005). Enzimas operam sob condições brandas e são altamente específicas. Além disso, o uso de enzimas permite o controle da reação e da formação do produto por meio do ajuste da concentração da enzima, do pH, temperatura e do tempo de reação (Mourya et al., 2011). A quitosana é usualmente susceptível a um grande número de enzimas, incluindo as específicas (quitosanases) e não-específicas (carbohidrolases, proteases, lipases, entre outras) (Kim & Rajapakse, 2005). Pesquisas sobre quitosanases tem recebido grande atenção devido a sua ampla aplicação em vários campos (Thadathil & Velappan, 2014). Entre essas aplicações, inclui-se a preparação de COS bioativos (Wang et al., 2011a; de Araujo et al., 2013), de agentes de biocontrole para aumentar a resistência de plantas contra patógenos fúngicos (Hsu et al., 2012), mediar a entrega de gene (Almalik et al.,2013) e a bioconversão de resíduos quitinosos marinhos (Wang et al., 2011b). O comitê de nomenclatura de enzimas, em 2004, definiu quitosanase como enzima capaz de realizar a endohidrólise de ligações β-1,4 entre resíduos de GlcN em uma molécula de. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(27) Fundamentação Teórica 8. quitosana parcialmente acetilada, a partir da extremidade redutora (Figura 2a). Posteriormente, em 2008, o comitê criou uma segunda classe de enzima, exo-β-D-glicosaminidase que ataca a quitosana a partir de sua terminação não redutora (Figura 2b) (Thadathil & Velappan, 2014).. Figura 2: Modo de ação de uma quitosanase (a) e uma exo-β-D-glicosaminidase. Fonte: (Thadathil & Velappan, 2014).. Enzimas que hidrolisam as ligações glicosídicas entre açúcares são chamadas de Glicosil Hidrolases (GH). As GH são classificadas pelo banco de dados Carbohydrate-Active enZYmes (CAZY) o qual constantemente mantêm atualizada a lista de GH, assim como de outras enzimas que agem sobre carboidratos. A classificação do CAZY é puramente baseada na similaridade entre sequências de aminoácidos. Assim, várias classes de GH contêm enzimas que agem em diferentes substratos. Enzimas com atividade quitosanolítica têm sido encontradas nas famílias de GH 5, 7, 8, 46, 75 e 80. A GH 7 é uma família de celulases e a atividade quitosanolítica detectada está ligada a atividade inespecífica de algumas celulases. A família GH 5 possui uma variedade enzimas, incluindo quitosanases, celulases, liqueninases, manases e xilanases. Na família GH 8 tem sido relatada maior atividade quitosanolítica, em alguns casos, ligado às celulases e xilanases, em outros, realmente a quitosanases. As famílias GH 46, GH 75 e GH 80 possuem exclusivamente quitosanases. As famílias GH 75 e GH 80 possuem poucos membros e. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(28) Fundamentação Teórica 9. sua estrutura tridimensional ainda não foi determinada. As quitosanases mais estudadas são aquelas pertencentes à família 46 (Aam et al., 2010). Tem sido observado que a estrutura das pontes glicosídicas na quitosana afeta o processo de hidrólise. Quitosanas diferencialmente desacetiladas possuem quatro diferentes tipos de ligações glicosídicas distribuídas aleatoriamente na sua estrutura. Essas incluem ligações entre duas unidades N-acetilglicosamina (A-A), entre uma unidade acetilada e outra desacetilada (AD), entre uma unidade desacetilada e outra acetilada (D-A) e entre duas unidades desacetiladas (D-D). A especificidade da quitosanase com respeito aos quatro diferentes modos de clivar a ligação glicosídica é determinada pela identidade das extremidades redutoras e não redutoras. A distinção entre quitosanase e quitinase é mínima, já que ambas possuem a habilidade de degradar uma variedade de quitosanas com diferentes graus de acetilação. Entretanto, quitinases atacam preferencialmente polímeros com alto grau de acetilação, enquanto que, quitosanases são mais efetivas em quitosanas com baixa N-acetilação (Mourya et al., 2011). 2.3. Produção de Quitosanases Quitosanases são produzidas por microrganismos e plantas, onde possuem um importante papel na nutrição e defesa. Quitosanases extracelular de origem bacteriana já foram descridas em diversos gêneros: Bacillus sp. (Almalik et al., 2013; Goo & Park, 2014; Liang et al., 2014), Serratia sp. (Wang et al., 2010; Zhang et al., 2014b), Janthinobacterium sp. (Johnsen et al., 2010), Paenibacillus sp. (de Araujo et al., 2013; Zitouni et al., 2013), Acinetobacter sp. (Wang et al., 2011b) e Streptomyces sp.(Takasuka et al., 2014). Com relação às quitosanases de origem fúngica, há um número menor de relatos. Cita-se, por exemplo, a produção de quitosanases por Aspergillus sp. (Hirano et al., 2012; Beck et al., 2014), Gongronella sp. (Zhang et al., 2013), Metarhizium anisopliae (de Assis et al., 2012) e Trichoderma sp. (da Silva et al., 2012). Pesquisas recentes revelam a produção de quitosanases por cianobactérias. Estas compreendem um grupo extremamente diverso de procariontes fotossintetizantes com amplo potencial biosintético e diversas atividades metabólicas. Em estudos utilizando Anabaena fertilíssima foi observada a produção de uma quitosanase com potencial de uso como agente de biocontrole (Gupta et al., 2010; Gupta et al., 2012).. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(29) Fundamentação Teórica 10. Além dos microrganismos, algumas são produzidas por plantas (Thadathil & Velappan, 2014). Em estudo utilizando COS produzidos por hidrólise enzimática com quitosanase de broto de bambu foi possível avaliar a atividade in vivo e in vitro desse composto (Chang et al., 2014). Em outro estudo, também com broto de bambu, foi possível purificar e caracterizar duas isoformas de quitosanase (Hsu et al., 2012). 2.4. Bactéria Bacillus cereus De acordo com a taxonomia atual, o grupo Bacillus cereus inclui sete espécies reconhecidas:. Bacillus. anthracis,. Bacillus. cereus,. Bacillus. thuringiensis,. Bacillus. weihenstephanensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides e Bacillus cytotoxicus, que compartilham um parentesco genético e bioquímico (Gillis & Mahillon, 2014). Estas espécies foram originalmente descritas como base nos seus habitats, sua patogenicidade para mamíferos e insetos, e suas características morfológicas e fisiológicas (Ash et al., 1991). Este grupo consiste de espécies estreitamente relacionadas de bactérias de interesse para pesquisa devido a sua importância na indústria e na medicina. Entretanto, ainda há dificuldade de distinguir essas bactérias a em nível intra e inter-espécie (Punina et al., 2013). Bacillus cereus é um comum contaminante de alimentos enquanto Bacillus thuringiensis é capaz de produzir um bioinseticida o qual é tóxico para larvas de insetos. Na classificação tradicional, B. thuringiensis pode ser distinguido do B. cereus pela sua capacidade de produzir um inseticida de inclusão cristal no interior da célula durante a esporulação. Como essa característica é frequentemente localizada no plasmídeo, o qual é transferível, quando as cepas perdem o plasmídeo elas tornam-se indistinguíveis (Chen & Tsen, 2002). Devido ao fato relatado acima, recentes abordagens moleculares, com alvo em genes cromossomais, têm sido usadas para identificação específica das cepas do grupo B. cereus. A diversidade genética da bactéria B. thuringiensis e a possibilidade de distinguí-la da bactéria B. cereus, vem sendo estudada por diferentes métodos (Punina et al., 2013). Para diferenciação entre B. cereus e B. thuringiensis, sondas específicas de DNA baseadas na região variável V1 da subunidade 16S do rRNA têm sido desenhadas. Entretanto, vários trabalhos vêm analisando sequências da subunidade 16S do rRNA das espécies deste grupo e demonstram que elas são praticamente idênticas e dentro da variação esperada para uma única espécie. Comparações recentes de várias cepas de B. thuringiensis e B. cereus, por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), polimorfismo de conformação de fita simples,. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(30) Fundamentação Teórica 11. eletroforese de enzimas multilocos (MLEE) e a diversidade de seus elementos móveis, sugerem que estes dois Bacillus spp. devem ser considerados uma espécie (Chen & Tsen, 2002). Além disso, o uso de outras sequências de nucleotídeos de rRNA, tais como 23S e 16S23S, também não permitiram estabelecer a atual relação filogenética entre B. thuringiensis e B. cereus (Punina et al., 2013). Dessa forma, com base em amplos estudos genômicos realizados em cepas de B. cereus e B. thuringiensis, tem-se indicado que pode ser mais apropriado considerá-los como pertencentes a uma espécie genérica a partir do qual vários ecótipos e patótipos surgiram (Gillis & Mahillon, 2014). Historicamente, diversos estudos relatam a produção de quitinases e quitosanases pela bactéria Bacillus cereus (Kurakake et al., 2000; Chang et al., 2007; Liang et al., 2012; Liang et al., 2013; Goo & Park, 2014; Liang et al., 2014; Seo et al., 2014). 2.5. Quitooligossacarídeos A quitosana é suscetível de hidrólise (degradação hidrolítica) devido à presença de pontes glicosídica na molécula; essas ligações são bastante instáveis quando tratadas com agentes hidrolisantes, como por exemplo, soluções aquosas de ácidos. Quitosana com Grau de Polimerização (GP) inferior a 20 e com massa molecular média menor do que 3900 Da são chamados de oligômeros de quitosana, quitooligômeros ou quitooligosacarídeos (COS) (Mourya et al., 2011). Os COS não são solúveis em acetona, butanol, etanol, acetato de etila, propanol e piridina mas são totalmente solúveis em água e parcialmente solúvel em metanol e dimetil sulfóxido. Oligômeros com GP entre 2-4 são solúveis em metanol, mas oligômeros com GP maior que 5 são menos solúveis (Mourya et al., 2011). Diferentemente da maioria dos polissacarídeos, a quitosana e os COS têm cargas positivas, o que lhes permite se ligar fortemente a superfícies negativamente carregadas; esta propriedade é responsável por muitas atividades biológicas já descritas para estas moléculas. No entanto, é importante mencionar que COS com estruturas diferentes apresentam diferentes atividades biológicas, e nem todas as atividades biológicas são encontradas em um dado COS. Cada tipo especial de COS bioativo é desenvolvido através da modificação química e/ou hidrólise enzimática para potencial aplicação farmacêutica e médica (Zhang et al., 2010). Os COS têm sido objeto de crescente atenção em termos de aplicações medicinais e farmacêuticas, devido a sua alta solubilidade e não toxicidade bem como aos seus efeitos. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(31) Fundamentação Teórica 12. fisiológicos positivos. Recentes avanços têm lançado luz sobre os benefícios do COS à saúde, incluindo a redução do colesterol no sangue e da pressão arterial elevada, efeitos de proteção contra infecções, controle da artrite, melhora da absorção de cálcio e propriedades antitumorais (Lodhi et al., 2014). No início do ano 1970, foi relatada a primeira atividade biológica, antitumoral, dos COS. Essa atividade foi inicialmente sugerida como induzida pela propriedade catiônica exercida por grupos amino dos COS. Posteriormente, foi aceito que a massa molecular também possui papel majoritário para a atividade antitumoral (Lodhi et al., 2014). Tem sido demonstrada a ação antitumoral tanto com uso de células tumorais, por exemplo, HepG2, HeLa (de Assis et al., 2012) e HL-60 (Kim et al., 2012), como com uso de modelos animais. Estudos in vivo com portadores de câncer de pulmão constatou que a administração oral de COS pode regular a função imune, reduzir os efeitos negativos da radioterapia sobre a imunidade e ter um bom efeito antitumoral adjuvante (Ma et al., 2015). Também foi demonstrado que administração oral de COS em ratos portadores de tumor de cólon suprime o crescimento do tumor, através da indução de apoptose e a estimulação do sistema imunitário, o que sugere que os COS são potencialmente um alimento funcional (Masuda et al., 2014). Pesquisas também tem evidenciado diretamente a ação antioxidante dos COS. Destaca-se que foi relatada a inibição do estresse oxidativo induzido por etanol (Luo et al., 2014b), o sequestro de radicais DPPH (Eom et al., 2012; de Araujo et al., 2013) e superóxido (de Assis et al., 2012; Li et al., 2013). A inibição da oxidação celular, em células sob estresse oxidativo, também já foi descrita em diversos trabalhos, por exemplo, com macrófagos RAW264.7 (Ngo et al., 2011), eritrócitos (Fernandes et al., 2010, Zhang et al., 2014a), células pancreáticas MIN6 (Lu et al., 2012) e de fígado (Trinh et al., 2014). Também se destacam os efeitos: imunoestimulante (Zhang et al., 2014c), antibacteriana (Wu et al., 2013; Younes et al., 2014), prebiótica (Kong et al., 2014), antidiabética (Katiyar et al., 2011), supressão de metástase (Luo et al., 2014a), ativação da resistência de plantas contra insetos e ataques de patógenos (Zhang et al., 2011), antifúngica (Suma & Podile, 2013; Younes et al., 2014), anti-inflamatória (Azuma et al., 2015), antiviral (Artan et al., 2010), prevenção da adesão bacteriana em células humanas (Rhoades et al., 2006) e uso como vetor para entrega de genes (Issa et al., 2006; Csaba et al., 2009).. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(32) Fundamentação Teórica 13. 2.6. Purificação de proteínas Após a produção de biomoléculas de interesse industrial, farmacêutico e/ou medicinal utiliza-se operações unitárias (Downstream processing) que possam garantir o grau de pureza desejado do material, que dependerá de sua aplicação. Pesquisadores têm purificado e caracterizado com sucesso um grande número de proteínas de uma variedade de microrganismos usando diferentes técnicas. A partir desses passos são obtidas diferentes informações, tais como atividade específica, rendimento, ponto isoelétrico, massa molecular, Km, Vmax, pH e temperatura ótimas. Várias estratégias envolvendo passos individuais ou multi-passos normalmente são empregadas (Sooch et al., 2014). A eficiência do Downstream processing é influenciada pela concentração de proteínas, pela complexidade do extrato bruto e pelo grau de pureza requerido. Esse processo pode ser dividido em duas fases: recuperação primária e purificação (Wilken & Nikolov, 2012). O objetivo da recuperação primária é maximizar o título do produto e o rendimento no extrato ou homogeneizado celular, reduzir o volume e preparar uma amostra clarificada para a purificação. Processos downstream para sistemas baseados em biorreatores iniciam-se com a coleta da biomassa por centrifugação, filtração com membranas, ou por bombeamento do meio líquido para fora do biorreator. Para proteínas intracelulares é necessário o rompimento da célula; enquanto que para proteínas extracelulares, o meio de cultura é tipicamente concentrado, clarificado e condicionado antes de serem submetidas a processos cromatográficos. Algumas das operações unitárias de recuperação primária, tais como a centrifugação, filtração de fluxo cruzado e filtração frontal, são multifuncionais, e as suas estratégias de aplicações são definidas pela composição e propriedades do extrato, tamanho das partículas e a estabilidade do produto (Wilken & Nikolov, 2012). Proteínas podem ser purificadas na sua forma ativa com base em características tais como solubilidade, tamanho, carga e afinidade específica de ligação. A etapa de purificação usualmente inicia-se com o passo de concentração de proteína (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio ou solventes ou polietileno glicol) e remoção de impurezas que poderão afetar o rendimento, qualidade e/ou a eficiência da purificação (Thadathil & Velappan, 2014). Para aplicações que exigem alto grau de pureza (uso em terapias e diagnóstico), etapas adicionais de purificação são necessárias, principalmente para remover impurezas residuais e assegurar a qualidade do produto (Wilken & Nikolov, 2012).. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(33) Fundamentação Teórica 14. Para purificação de quitosanases e quitinases, aplicam-se diferentes técnicas cromatográficas tais como filtração em gel (Oh et al., 2011), troca iônica (Jiang et al., 2012, Nguyen et al., 2014), combinação das duas técnicas (Wang et al., 2008; Wang & Yeh, 2008) e afinidade (Yang et al., 2007). Para quitosanases produzidas pelo Bacillus cereus tem-se empregado principalmente combinação de gel filtração com troca iônica (Liang et al., 2012; Liang et al., 2014) e somente gel filtração (Goo & Park, 2014). A gel filtração é um tipo de cromatografia baseada no tamanho das partículas. A amostra é aplicada no topo de uma coluna preenchida com um polímero poroso e insolúvel, mas altamente hidratado, normalmente dextrana ou agarose ou poliacrilamida. Sephadex, Sepharose e Bio-gel são as preparações comerciais mais usadas nessas resinas, as quais tipicamente possuem grânulos com 100µm de diâmetro. Pequenas moléculas podem entrar nos poros dessa resina, mas as grandes não. O resultado é que as moléculas pequenas são distribuídas na solução aquosa, tanto no interior dos grânulos da resina como entre eles, enquanto que as moléculas grandes estão localizadas apenas na solução entre os grânulos. As moléculas grandes fluem mais rapidamente através da coluna e saem primeiro porque um volume menor é suficiente para eluílas. As moléculas que são de um tamanho médio, ocasionalmente entram no interior de um grânulo e irão fluir em uma velocidade intermediária. Enquanto as moléculas pequenas, as quais tomam um caminho tortuoso e mais longo, serão eluídas por último (Berg et al., 2002). Na cromatografia de troca iônica, as proteínas são separadas de acordo com a carga líquida que a mesma possui. Se uma proteína exibe carga positiva em pH 7,0, normalmente ela irá se ligar a uma resina contendo contra-íons positivos, deslocando-os. Uma proteína positivamente carregada ligada a uma resina pode então ser eluída aumentando-se a concentração de cloreto de sódio ou outro sal no tampão de eluição, os íons sódio, agora com uma maior força iônica, competem com a proteína deslocando-a. As proteínas que têm uma baixa densidade de carga positiva líquida tenderão a ser eluídas em primeiro lugar, seguida daquelas que têm uma densidade de carga mais elevada (Berg et al., 2002; Nelson & Cox, 2006). Em um processo de purificação, diversas variáveis devem ser estudadas. Tratando-se de bioprodutos, especificamente enzimas, o desempenho da técnica de purificação pode ser evidenciado pelas variáveis redimento da atividade enzimática e fator de purificação (Padilha, 2013).. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(34) Fundamentação Teórica 15. O redimento da atividade enzimática é a relação entre a atividade enzimática do material purificado e a atividade do extrato bruto, a qual pode ser expressa em percentual (Padilha, 2013): 𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 (%) =. 𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎á𝒕𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒑𝒖𝒓𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒅𝒐 𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎á𝒕𝒊𝒄𝒂 𝒏𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒃𝒓𝒖𝒕𝒐. 𝒙 𝟏𝟎𝟎. Eq.1. O fator de purificação expressa o quão seletivo é o processo de purificação, relacionando as atividades específicas do material purificado e do seu estado inicial (Padilha, 2013): 𝑭𝒂𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒑𝒖𝒓𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂çã𝒐 =. 𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒏𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒑𝒖𝒓𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒅𝒐 𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒏𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒃𝒓𝒖𝒕𝒐. Eq.2. 2.7. Adsorção em Leito Expandido A viabilidade econômica de um bioprocesso está diretamente ligada ao número e eficiência das etapas necessárias durante a purificação, a fim de alcançar as especificações dos produtos solicitados. Adsorção em Leito Expandido (ALE) é um processo integrado que combina a separação sólido-líquido e a recuperação do produto numa única operação unitária. Esta abordagem sugere um aumento do rendimento global, menor necessidade de investimentos de capital e de consumo e, sobretudo, uma redução do tempo de processo. O sucesso de um processo de integração é, no entanto, intimamente ligada a uma compreensão detalhada dos princípios bioquímicos envolvidos e as limitações decorrentes da complexidade de matéria-prima (Hubbuch et al., 2005). A ALE permite que proteínas sejam recuperadas diretamente a partir de cultura de microrganismos ou de células, sem a necessidade de remoção prévia de sólidos suspensos. O desempenho geral da ALE é comparável à de um leito empacotado devido à redução da mistura das partículas de adsorvente na coluna. No entanto, as condições ideais de operação são mais restritas devido à dependência da expansão do leito e a densidade requerida das partículas de adsorvente, bem como a viscosidade e a densidade da matéria-prima. A composição da matériaprima pode se tornar mais uma restrição limitante devido às interações das partículas adsorventes com superfície das células, DNA e outras substâncias, levando a sua agregação e, consequentemente, a instabilidades do leito e formação de canais preferenciais. Apesar destas dificuldades, a ALE tem encontrado aplicações generalizadas na purificação em grande escala de proteínas de células de mamíferos e microbianas (Anspach et al., 1999). O estudo e uso de leito fluidizado como ferramenta cromatográfica passou a ser utilizado com maior efetividade a partir da década de 90 (Draeger & Chase, 1990). A partir da introdução. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(35) Fundamentação Teórica 16. de novos tipos de adsorventes destinados a operação em leito expandido, linha streamline produzida pelo grupo Amersham Phamarcia Biotech atual G&E, foi possível uma maior estabilidade do leito e um aumento na faixa de velocidade de operação (100-300 cm.h-1) (Padilha, 2013). A matriz do adsorvente deve mostrar características de fluidização adequadas. Em particular, o leito deve ter a capacidade de expansão requerida (cerca de duas a três vezes a altura do leito fixo) quando aplicada uma velocidade de fluxo adequada. Existe uma estreita relação entre a altura do leito expandido e a velocidade de fluxo, a qual depende criticamente das propriedades físicas do adsorvente e da alimentação utilizada. Além disso, as partículas do adsorvente devem possuir faixas de diâmetro que sejam adequadas para geração de uma expansão estável (Chase, 1994). O comportamento fluidinâmico do leito expandido engloba três características primordiais, o regime de escoamento, o grau de mistura e a possibilidade de existência de camada estagnada entre o fluido e o adsorvente. Pode-se ressaltar que a Adsorção em Leito Expandido se baseia na manutenção da fluidização estável (mais semelhante ao escoamento plug-flow), estabelecendo um balanço entre as propriedades fluidodinâmicas entre o leito fluidizado e as propriedades cromatográficas do leito fixo (Padilha, 2013). Durante a operação de uma coluna em leito expandido para purificação de bioprodutos é essencial o conhecimento do comportamento leito em função das propriedades das partículas do adsorvente e da solução de alimentação. Esta caracterização é baseada no mensuramento do grau de expansão em função da velocidade e viscosidade do fluido, na presença de contaminantes como células microbianas e na distribuição das partículas do adsorvente (Moraes et al., 2013). Uma das formas de conhecer o comportamento de um leito expandido e o seu regime de escoamento, em função das propriedades físicas das partículas e do fluido, é por meio da equação de Richardson-Zaki (Richardson & Zaki, 1954). Pela teoria, a velocidade terminal de uma partícula esférica (Ut) é influenciada pelo movimento das outras (interferência populacional), conforme Equação 3 (Padilha, 2013): 𝒖 = 𝒖𝑻 . 𝜺𝒏. Eq.3. Sendo u a velocidade superficial, ε refere-se a porosidade do leito, uT é a velocidade terminal de uma partícula única e n o índice de expansão do leito.. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(36) Fundamentação Teórica 17. Esse modelo descreve a influência da população sobre a velocidade terminal individual, sendo fundamental para avaliar a expansão do leito quando este alcança o equilíbrio (Padilha, 2013). Os parâmetros uT e n são determinados pela linearização da Equação 3: 𝑙𝑛 𝑢 = 𝑙𝑛 𝑢𝑇 + 𝑛 . 𝑙𝑛 𝜀. Eq.4. A porosidade do leito pode ser estimada em função da altura total de expansão do leito (Moraes et al., 2013): 𝜺 = 𝟏 − (𝟏 − 𝜺𝟎 ).. 𝑯𝟎. Eq. 5. 𝑯. Onde ε0 e H0 são a porosidade e altura do leito sedimentado, respectivamente. Admite-se que ε0 tem valor igual a 0,4 (Moraes et al., 2013). Outra informação importante a ser aferida sobre o sistema é a capacidade dinâmica de ligação. Esta normalmente é determinada quando a concentração de proteína ou a atividade enzimática no efluente da coluna alcança 10% da concentração ou atividade inicial (C/C0=0,1 ou U/U0=0,1), assim há redução de perda da molécula alvo no escoamento. A capacidade dinâmica de ligação (QB), definida como concentração de proteína ou unidade de enzima adsorvida por massa do adsorvente, pode ser calculada de acordo com a Equação 6: 𝑽𝒇. 𝑸𝑩 =. 𝑪𝟎 (𝑽𝒇 −𝑽𝒎 ) ∫𝑽𝒎 𝑪𝒅𝑽. Eq. 6. 𝒎𝒂𝒅𝒔. Onde C0 é a concentração de proteína (mg.mL-1) ou a atividade enzimática inicial (U.mL-1), Vf é o volume final de solução de alimentação, Vm é o volume a 10% de ruptura (mL) e mads refere-se a massa de adsorvente (g). O ciclo de operação básico da ALE é composto pelas etapas de equilíbrio, aplicação da amostra, lavagem, eluição e posterior limpeza da resina (Figura 3). As estratégias de otimização de cada etapa são, em geral, semelhantes às adotadas em um processo de leito convencional (Chase, 1994).. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(37) Fundamentação Teórica 18. Figura 3: Ciclo básico de operação da ALE. As setas indicam a direção do escoamento. Fonte: Amersham Pharmacia Biotech.. O processo de ALE também é operado de forma muito semelhante ao processo empacotado. A principal diferença é a direção do fluxo do líquido. Uma velocidade de fluxo mais baixa pode ser usada se a viscosidade da matéria-prima for muito alta. Isto pode prevenir uma expansão muito elevada (Hjorth, 1997). No início do protocolo de purificação, o adsorvente sedimentado necessita ser convertido em um leito expandido e estável antes da aplicação da alimentação contendo material particulado. Para isso uma solução tampão é aplicada e esta flui através do leito, inicialmente sob um baixo fluxo e sendo gradualmente elevado até que se atinja uma altura duas vezes maior que a inicial. Feito isso a amostra pode ser aplicada no sistema. Entretanto, as propriedades físicas da alimentação podem ser diferentes daquelas do tampão usado na expansão inicial do leito. Como consequência, se o fluxo não for reduzido, a extensão da expansão do leito poderá aumentar. Após aplicação da amostra, inicia-se a etapa de lavagem (Chase, 1994). A etapa de lavagem de um processo de leito expandido tem a dupla função de remoção de matéria-prima mantida dentro dos espaços vazios inter e intrapartícula do adsorvente e, em alguns casos, remoção de material fracamente adsorvido (Chase, 1994). Depois do material não ligado ter sido lavado da resina (etapa de lavagem), o fluxo é interrompido e deixa-se a resina sedimentar. A etapa de eluição geralmente é realizada em modo empacotado e a uma velocidade reduzida, normalmente 100 cm.h-1 para manter baixo o volume da fração eluída. A eluição também pode ser realizada com o leito expandido, mas tem sido descrito um aumento de 40% no volume da fração eluida (Hjorth, 1997).. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(38) Fundamentação Teórica 19. Um importante estágio na operação de um leito expandido é o procedimento de limpeza e regeneração da resina. Este procedimento é realizado para manter a funcionalidade do adsorvente, garantir que todas as impurezas tenham sido removidas e evitar a passagem de contaminante entre amostras de resina. A maioria dos procedimentos de limpeza inclui a utilização de hidróxido de sódio em concentrações de 0,5 a 1M. Este tratamento deve ser realizado durante um período controlado de tempo (3-4 horas), para permitir que os contaminantes sejam removidos. O hidróxido de sódio é geralmente combinado com outras soluções, tais como 10% de ácido acético ou solventes orgânicos como etanol 20% (Hjorth, 1997). Nos últimos anos, a ALE tem sido empregada na purificação das mais diversas biomoléculas, das quais pode-se citar a purificação de ácido salvinólico e alcalóides (Li et al., 2014), lactoferrina e imunoglobulina G (Du et al., 2014), ficocianina C (Moraes et al., 2013), antígeno recombinante da Hepatite B (Ng et al., 2012) e β-galactosidade (Boeris et al., 2012). Conforme relatado anteriormente, é comum o uso de resinas de troca iônica em leito empacotado para purificação de quitosanases, recentemente também foi relatado o uso de resinas de troca iônica, linha Streamline, para purificação de duas quitosanases produzidas pelo fungo Metarhizium anisopliae (de Santana et al., 2014). Tendo em vista o exposto, no presente estudo foi adotada a estratégia de planejamento experimental com a realização de um Planejamento Composto Central para o estudo de uma estratégia de purificação de uma quitosanase utilizando ALE.. 3. REFERÊNCIAS Aam, B. B.; Heggset, E. B.; Norberg, A. L.; Sorlie, M.; Varum, K. M.; Eijsink, V. G. Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine. Marine Drugs 8(5): 14821517, 2010. Almalik, A.; Day, P. J.; Tirelli, N. "HA-coated chitosan nanoparticles for CD44-mediated nucleic acid delivery." Macromolecular Bioscience 13(12): 1671-1680,2013.. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.

(39) Fundamentação Teórica 20. Amersham Pharmacia Biotech. Expanded bed adsorption handbook. Disponível em: http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Expanded_Bed_Absorption/PHARMACIA_IntrodEB A.pdf Acesso em abril de 2015. Anspach, F. B.; Curbelo, D.; Hartmann, R.; Garke, G.; Deckwer, W. D. "Expanded-bed chromatography in primary protein purification." Journal of Chromatography A 865(1-2): 129144,1999. Artan, M.; Karadeniz, F.; Karagozlu, M.Z.; Kim, M. M.; Kim, S. K. "Anti-HIV-1 activity of low molecular weight sulfated chitooligosaccharides." Carbohydrate Research 345(5): 656-662,2010. Ash, C.; Farrow, J. A.; Dorsch, M.; Stackebrandt, E.; Collins, M. D. "Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA." International Journal of Systematic Bacteriology 41(3): 343346,1991. Azuma, K.; Osaki, T.; Kurozumi, S.; Kiyose, M.; Tsuka, T.; Murahata, Y.; Imagawa, T.; Itoh, N.; Minami, S.; Sato, K.; Okamoto, Y. "Anti-inflammatory effects of orally administered glucosamine oligomer in an experimental model of inflammatory bowel disease." Carbohydrate Polymers 115(0): 448-456, 2015. Beck, J.; Broniszewska, M.; Schwienbacher, M.; Ebel, F. "Characterization of the Aspergillus fumigatus chitosanase CsnB and evaluation of its potential use in serological diagnostics." International Journal of Medical Microbiology 304(5-6): 696-702, 2014. Berg, J. M.; Tymoczko, J. L.; Stryer, L. Biochemistry, Fifth Edition. 5 ed. Nova York: W.H. Freeman, 2002, 1050p. Boeris, V.; Balce, I.; Vennapusa, R. R.; Rodríguez, M. A.; Picó, G.; Lahore, M. F. "Production, recovery and purification of a recombinant β-galactosidase by expanded bed anion exchange adsorption." Journal of Chromatography B 900(0): 32-37, 2012.. Nathália Kelly de Araújo. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO.