A seguir será apresentado um estudo matemático sobre o processo de purificação empregado nesse trabalho de doutorado. Este estudo matemático foi concebido em parceria com um aluno de pós-graduação do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.
Modelagem e simulação da adsorção de quitosanases produzidas por Bacillus cereus em uma coluna operada em leito expandido
Araújo, Nathália Kelly de1; Padilha, Carlos Eduardo de Araújo1; Souza, Domingos Fabiano de Santana1; Oliveira, Jackson Araújo de1; Macedo, Gorete Ribeiro de1; Santos, Everaldo Silvino dos1
1Laboratório de Engenharia Bioquímica, Departamento de Engenharia Química,Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, Brasil.
Abstract
Neste estudo um modelo matemático foi elaborado para descrever as etapas de carga, lavagem e eluição de uma coluna de troca iônica operada em leito expandido durante a purificação de quitosanases produzidas por Bacillus cereus. A estratégia de estimação híbrida composta pelos métodos particle swarm optimization (PSO) e Gauss-Newton foi adotada para estimar os parâmetros do modelo. A sensibilidade paramétrica foi aplicada para realizar a triagem dos parâmetros relevantes ao modelo e reduzir o esforço do método Gauss-Newton. Através dos testes 2 e das médias dos erros quadráticos foi observado que o desempenho do modelo com os parâmetros re-estimados foi superior àquele obtido apenas com o método de Gauss-Newton. A aplicação do modelo validado sob as condições operacionais ótimas permitiram que fosse alcançado o máximo de 15.03 % de rendimento na eluição 700 mM de NaCl.
Keywords: Modeling, Expanded Bed Adsorption, Chitosanases, Particle Swarm Optimization, Gauss-Newton, Optimization
1. Introdução
Pesquisas sobre quitosanases têm recebido grande atenção devido a sua ampla aplicação em vários campos [1]. Entre essas aplicações, inclui-se a preparação de quitoligossacarídeos bioativos [2-3], de agentes de biocontrole para aumentar a resistência de plantas contra patógenos fúngicos [4], mediar a entrega de gene [5] e a bioconversão de resíduos quitinosos marinhos [2]. Contudo o uso direto do caldo fermentado microbiano contendo atividade quitosanolítica não é recomendável, uma vez que nele podem existir metabólitos secundários indesejáveis e proteases. Por outro lado, a necessidade de etapas de purificação pode aumentar substancialmente o custo total de produção. Assim incentivos têm sido feitos para intensificação e integração das técnicas de downstream processing na ordem de assegurar a viabilidade econômica do processo [6-9].
A adsorção em leito expandido (ALE) é uma técnica cromatográfica que combina remoção de insolúveis, concentração e purificação em apenas um passo [10-12]. Nela, a aplicação de um fluxo ascendente sobre um leito de partículas adsorventes permite não só a passagem de material particulado bem como a adsorção da molécula-alvo [13-14]. A distribuição de partículas ao longo da coluna cromatográfica ocorre pelas variações de tamanho e densidade das partículas, o que torna a análise da cinética da ALE uma tarefa complexa [15].
Uma ferramenta útil para compreender os complexos mecanismos envolvidos na operação da coluna de adsorção em leito expandido, bem como a otimização de condições operacionais é a utilização da modelagem matemática [15,8]. A troca iônica (IEX) é a modalidade do processo ALE com maior número de trabalhos de modelagem e eles abordam as etapas carga, lavagem e eluição. Nesta última etapa faz-se necessário incorporar isotermas que levem em consideração a atuação do sal na adsorção, das quais se destaca a Steric Mass Action (SMA). A isoterma SMA tem mostrado resultados promissores na descrição do comportamento da adsorção de uma única proteína [16-17] ou simples combinações de proteínas [18-19]. Contudo, para sistemas complexos como caldo fermentado com células e/ou quando não se pode realizar ensaios prévios com a proteína-alvo pura, o seu uso é inviável. Para contornar estes problemas uma alternativa simples seria a inclusão de um termo exponencial associado à concentração de sal no modelo de isoterma de Langmuir como visto em Antia and Horváth (1989) [20] e Chen and Sun (2003) [21].
Neste contexto, o presente trabalho propõe a modificação do modelo matemático de sistemas cromatográficos para permitir a descrição das etapas carga, lavagem e eluição do processo ALE durante a purificação de quitosanase a partir de extrato bruto com células. A abordagem híbrida foi usada para estimar os parâmetros do modelo e a análise de medidas estatísticas foi realizada para avaliar o desempenho do modelo. Com o modelo enfim validado, uma rotina de otimização foi usada para maximizar a função rendimento pela manipulação das condições operacionais do processo ALE.
2. Materiais e Métodos 2.1. Microrganismo
Uma bactéria identificada como Bacillus cereus foi isolada de amostras de solo em Natal/Brasil (S 05º52’11’’, Wo 35º13’08.4’’). Diluições seriadas de amostras de solo foram inoculadas em placas de petri contendo peptona (6,0 gL-1), quitosana (2,0 gL-1), sulfato de magnésio (0,5 gL-1), fosfato dibásico de potássio (1,0 gL-1) e ágar (15 gL-1), e incubadas a 30ºC por dois dias. Colônias foram isoladas, testadas quanto a atividade quitosanolítica e selecionadas para análises taxonômica, coloração por gram e teste de patogenicidade usando o Kit Siemens PC33. Para uma identificação mais profunda, reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada para amplificação do gene codificador do rRNA 16S. Foram utilizados os iniciadores, direto e reverso, 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) e 1525R (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’), respectivamente. Os produtos do PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose e, depois, purificados, quantificados e usados para sequenciamento. Quatro reações de sequenciamento foram realizadas usando os primers 518F (5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’), 800R (5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’) e 1492R (5’-TAC GGY TAC CTT GTTA CGA CTT-3’). A sequência de nucleotídeos do 16S rRNA da amostra foi determinada por ABI 3730 DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA) e comparada com sequências de 16S rRNA disponíveis no NCBI BLAST.
2.2. Produção das quitosanases
Alíquotas de células, estocadas em ágar nutriente, foram transferidas para 50 mL meio de pré-cultivo dispensado em Erlenmeyer (250 mL), e então incubados a 30º C, 120 rpm, por 30 horas. O meio de pré-cultivo consistiu de: peptona (6,0 gL-1), quitosana (2,0 gL-1), sulfato de magnésio (0,5 gL-1) e fosfato dibásico de potássio (1,0 gL-1). Este foi, em seguida, inoculado assepticamente a um nível de 10% (v/v) em Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL do mesmo meio [3]. Os frascos foram então colocados num agitador rotativo a 120 rpm durante 24 horas, 30° C (Tecnal, TE421). Amostras deste cultivo foram usadas para o ensaio de purificação.
2.3. Ensaios de adsorção em leito expandido
O adsorvente de troca aniônica Streamline DEAE (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) foi usado nos experimentos. Microesferas de vidro foram utilizadas na base da coluna para acomodar o leito adsorvente e permitir a passagem dos sólidos particulados. O fluído foi injetado na coluna usando bomba peristáltica (Perimax 12, Spetec). Foram realizados 5 ensaios de acordo
com a Tabela 1. O correto alinhamento vertical da coluna foi assegurado em todos os experimentos e todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente.
A coluna, com diferente alturas de leito sedimentado, foi equilibrada com tampão Tris- HCl, 50 mM, pH 8,5 (tampão A) para que fosse alcançada a altura uma estável, onde H/H0=1,5. O caldo fermentado com células foi então aplicado (etapa de carga) a uma velocidade superficial variável (de acordo com a tabela 1), seguido de lavagem com tampão A (150 mL). A eluição foi realizada por gradiente salino passo a passo com tampão Tris-HCl, pH 8,5 contendo 0,3 M (tampão B), 0,7 M (tampão C) e 1,0 M (tampão D) de NaCl. As etapas de lavagem e eluição conduzidas a uma velocidade superficial de 100 cm.h-1. Em todas as etapas de purificação, várias frações foram coletadas para realização de ensaio enzimático.
Tabela 1. Condições operacionais dos ensaios de ALE para recuperação de quitosanase
Ensaio Altura do leito fixo (cm) Altura do leito distribuidor (cm) Velocidade superficial (cm.h-1) Atividade enzimática do extrato bruto (U.mL-1)
1 8.00 2.00 100.00 0.440
2 4.00 2.00 200.00 0.430
3 8.00 6.00 100.00 0.210
4 8.00 6.00 200.00 0.298
5* 6.00 4.00 150.00 0.298
* - O ensaio 5 foi usado como validação do modelo matemático 2.4. Determinação da atividade enzimática
A atividade enzimática do caldo bruto e de amostras cromatográficas foram mensuradas pela incubação de 250 μL da amostra enzimática com 250 μL de quitosana 1% (pH 6,0). A mistura foi incubada em banho-maria por 30 minutos e a temperatura ajustada para 55ºC. A reação foi interrompida por fervura durante 10 minutos (De Araújo et al., 2013). A formação de açúcares redutores foi analisada pelo método do ácido dinitro salicilico, usando D-glucosamina
como padrão [22]. Uma unidade (U) de quitosanase foi definida como a quantidade de enzima capaz de gerar 1 µmol de D-glucosamina por minuto nas condições descritas acima.
3. Formulação do Modelo
A elaboração do modelo matemático que descreve todo o ciclo de operação de uma coluna de ALE voltada para purificação da quitosanase em uma resina de troca iônica foi baseada nas seguintes hipóteses:
i. As partículas adsorventes foram consideradas como esferas de densidade uniforme e grupos funcionais igualmente distribuídos na superfície. Variações axiais do raio das partículas adsorventes (Rp) e da porosidade do leito (ε) foram assumidas conforme Li et
al. (2005) [23].
ii. O comportamento hidrodinâmico da fase fluida pode ser descrito pelo modelo de dispersão axial [24-25].
iii. A adsorção do componente quitosanase (1) ocorreu apenas na superfície do adsorvente, logo não foi considerada a difusão interna.
iv. A interação entre biomassa e leito adsorvente foi negligenciada.
v. O comportamento reológico da fase fluida é diferente em cada etapa do processo de ALE. Para descrever todo o ciclo de operação ALE foi necessário incluir o componente sal (2) para a etapa de eluição e foi assumido que ele não interage com o adsorvente.
vi. A isoterma de Langmuir modificada foi usada para descrever o equilíbrio de adsorção da quitosanase nas três etapas do processo de ALE.
O balanço de massa do componente i na fase fluida pode ser expresso como
2 , , , 2 3 1 p f i i i r R i i i ax i p k z C C C C U C D t z z z z R z (1)onde Dax,i é o coeficiente de dispersão axial do componente i (cm2.s-1), kf,i é o coeficiente de
transferência de massa no filme líquido do componente i (cm.s-1), U é a velocidade superficial (cm.s-1), t é o tempo (s), C e i ,
p
i r R
C é a concentração do componente i na fase fluida e na superfície da partícula adsorvente, respectivamente.
As condições iniciais e condições de contorno da etapa carga são:
CI :t0, C zi ,0 0 (1a) 0 CC : 0, 0, , 0 i i i t z C C C z H z (1b)Assumindo que todas as resistências à transferência de massa se resumem a razão entre a constante de adsorção (b1) e a constante de dessorção (b2), o balanço de massa da quitosanase na
fase sólida pode ser simplificado como é visto a seguir:
1 1 max 2 q b C q q b q t (2)onde q é a concentração de quitosanase adsorvida pela resina e qmax é a capacidade máxima de adsorção de quitosanase na resina. A condição inicial da etapa carga é dada por:
CI :t0, q z,0 0 (2a)
De maneira a promover a recuperação de quitosanases na etapa eluição, o termo qmax foi considerado como inversamente proporcional à concentração de sal na fase fluida em um dado estágio da coluna, conforme a Equação 3.
'
max max exp 1 2
q q k C (3)
Assumindo que a taxa de adsorção na resina é equivalente ao decréscimo de sua concentração na fase fluida, o termo ,
p
i r R
C pode ser fornecido através de manipulações matemáticas entre as Equações 1 e 2, resultando na Equação 4. Como o componente sal não possui equação de balanço no sólido teremos 2, 2
p
r R
C C , de modo que o terceiro termo da Equação 1 torna-se nulo.
2 1 , 1 1, 1 max , 1 1 3 1 1 3 p p f r R p f z R z b q C k z C z b R z q q k z (4)As Equações 1-4 também podem ser usadas para descrever as etapas lavagem (C ,10 0 20 0
C ) e eluição (C 10 0,C 20 0), exceto nas duas condições iniciais dadas pelas Equações 1a e 2a, que devem corresponder ao término das etapas carga e lavagem, respectivamente. Cada etapa possui um conjunto próprio de parâmetros para a quitosanase, porém os valores de qmax, b1 e b2 foram fixados, o que totaliza 11 parâmetros. Os subscritos l, w e e foram usados para informar sobre os parâmetros que pertencem às etapas carga, lavagem e eluição, respectivamente.
Para a integração numérica do modelo contemplando todas as etapas, foi aplicado o Método das Linhas [26]. Neste modelo a altura da coluna cromatográfica (coordenada espacial z) foi discretizada em n elementos utilizando o método de diferenças finitas centrais. Em cada elemento, a derivada parcial no tempo, foi aproximada por uma derivada ordinária. O sistema de equações diferenciais ordinárias discretizados nos n elementos foram resolvidos utilizando a subrotina numérica DASSL [27].
3.5. Estimação de parâmetros do modelo
O enxame de partículas (PSO) é um algoritmo de busca heurística baseado na movimentação gregária de animais. Nele, a estimação é realizada por uma população de partículas que se movimenta no espaço multidimensional trocando entre si informações sobre a função objetivo [28-30]. A função objetivo (FO) a ser minimizada é do tipo mínimos quadrados ponderados, que estabelece a diferença entre os valores experimentais (Ciexp) e calculados (Cicalc
) associada ao erro de medição (i).
exp calc
2 2 1 N i i i i C C FO
(5)Neste trabalho foram usados 20 partículas e 20 iterações com valores dos parâmetros inicial, cognitivo e social fixados em 0.7, 1.0 e 1.0, respectivamente. Os intervalos de busca dos parâmetros do modelo foram: Dax,1l, Dax,1w, Dax,2
[5 x 10-3,0.75] cm2.s-1, kf,1l, kf,1w
[5 x 10-3,0.75] cm.s-1, q
max
[0.25,1] U.g-1, b1
[10-2,0.5] g.U-1.s-1, b2
[5 x 10-4,5 x 10-2] s-1, Dax,1e
[5x 10-5,2.5 x 10-3] cm2.s-1, kf,1e
[5 x 10-5,5 x 10-2] cm.s-1, k1
[5 x 10-3,0.75] L.mmol-1. Como ociclo de operação ALE é formado por três etapas onde a seguinte depende da anterior, pensou-se a princípio em estimar primeiramente os parâmetros referentes à carga seguidos dos parâmetros da lavagem e da eluição. Entretanto, esta estratégia não obteve resultados satisfatórios (resultados não mostrados neste trabalho), então a alternativa foi a estimação simultânea de todos os parâmetros do modelo.
Com o conjunto de parâmetros já calibrado pelo algoritmo PSO e finalizada a sensibilidade paramétrica, alguns parâmetros foram re-estimados pelo método Gauss-Newton. O pacote computacional Estima desenvolvido na COPPE-UFRJ foi usado para este propósito, buscando minimizar a função objetivo descrita na Equação 5. Através dele foi possível também obter a matriz de covariância e desvios-padrão dos parâmetros do modelo.
3.7. Otimização do rendimento da adsorção em leito expandido
A principal vantagem da modelagem matemática é a possibilidade de simular o processo em condições experimentais não testadas baseando-se no conjunto de parâmetros estimados [29]. Assim, nesta etapa foram avaliados os efeitos da concentração inicial da carga, altura do leito fixo, altura do distribuidor e a velocidade superficial sobre a recuperação do adsorbato. A função objetivo escolhida a ser maximizada foi o percentual de rendimento na eluição a 700 mM de NaCl descrito a seguir:
2 1 1 10 carga Yield (%) 100 e e t t C dt F C V
(6)Onde 2 1 1 e e t t C dt
representa a quantidade de quitosanase recuperada a 700 mM de NaCl, F é a vazão volumétrica e Vcarga é o volume de extrato bruto contendo quitosanase aplicado na carga. A rotina DBCONF, baseada no algoritmo quasi-Newton, foi usada para buscar o maximizador dentro do espaço delimitado pelas condições empregadas na calibração dos parâmetros.4. Resultados e Discussões
No caso de sistemas super parametrizados, como no atual trabalho, o modelo pode carregar parâmetros praticamente não-identificáveis, o que dificulta o uso de um método baseado em gradientes [31]. Dessa forma, partiu-se para uma estratégia de estimação de parâmetros híbrida, tendo como chute inicial do método determinístico o conjunto de parâmetros estimados pelo método heurístico. Por suas características vantajosas, o algoritmo PSO foi escolhido para realizar a estimação dos 11 parâmetros do modelo com os dados experimentais provenientes dos Ensaios 1, 2, 3 e 4. Os valores estimados pelo algoritmo PSO são mostrados na primeira coluna da Tabela 2.
Tabela 2. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e pelo pacote computacional baseado no algoritmo Gauss-Newton.
Parameter
Estimated values
PSO Algorithm Gauss-Newton algorithm
Dax,1 l (cm2.s-1) 1.065 x 10-2 1.144 x 10-2 ± 1.441 x 10-3 kf, 1l (cm.s-1) 0.430 0.430 qmax (U.g-1) 0.756 0.645 ± 6.376 x 10-2 b1 (g.U-1.s-1) 3.134 x 10-2 3.345 x 10-2 ± 4.637 x 10-3 b2 (s-1) 1.000 x 10-3 4.091 x 10-4 ± 1.749 x 10-4 Dax, 1w (cm2.s-1) 3.953 x 10-2 3.814 x 10-2 ± 5.058 x 10-3
kf, 1w (cm.s-1) 0.474 0.474
Dax, 1e (cm2.s-1) 1.710 x 10-3 1.710 x 10-3
kf, 1e (cm.s-1) 3.995 x 10-3 3.995 x 10-3
Dax, 2 (cm2.s-1) 6.291 x 10-4 6.291 x 10-4
k1 (L.mmol-1) 0.488 0.488
Uma análise de sensibilidade paramétrica foi realizada sobre o conjunto calibrado pelo algoritmo PSO seguindo a metodologia de Brun et al. (2001) [31] e Prunescu and Sin (2013) [32]. A medida de sensibilidade paramétrica
msqr foi obtida para cada etapa do processo comoloadingmsqr
,
washingmsqr , elutionmsqr , representando as etapas carga, lavagem e eluição, respectivamente. Também foi realizada uma avaliação global dada pelo indicador totalmsqr e um threshold selecionado. Os parâmetros estão posicionados de acordo as etapas do processo ALE e estão mostrados na Figura 1.Os resultados de sensibilidade paramétrica indicaram que o coeficiente de dispersão axial
Dax l,1
a capacidade máxima de adsorção,
qmax
, e as constantes de adsorção
b e 1 dessorção
b da quitosanase na carga, bem como o coeficiente de dispersão axial da 2quitosanase na lavagem
Dax w,1
foram os parâmetros que causaram maior impacto na resposta do modelo. As perturbações no coeficiente de dispersão axial da quitosanase na eluição
Dax e,1
, nos coeficientes de transferência de massa no filme líquido da quitosanase nas três etapas
kf l,1, kf w,1 , kf e,1
, no coeficiente de dispersão axial do sal
Dax,2
e no termo de deslocamento da proteína pela presença de sal
k pouco afetaram a medida 1 totalmsqr, sendo considerados não-relevantes a nível de 0.15 e por isso foram fixados. Os parâmetros relevantes podem ser expressos na forma vetorial como é visto a seguir:,1 max 1 2 ,1 T S Dax l q b b Dax w
(7)
Os parâmetros s foram re-estimados sobre o mesmo conjunto de dados para se obter melhor ajuste. A estratégia de estimação em um único passo também foi mantida. Os parâmetros re-estimados e seus respectivos desvios padrões são mostrados na segunda coluna da Tabela 2.
A)
C)
D)
Figura 1. Os três primeiros gráficos mostram
msqr para a etapa carga (
loadingmsqr ) (a), etapa lavagem (
washingmsqr ) (b) e etapa eluição (elutionmsqr ) (c). O gráfico de fundo mostra a medida de sensibilidade total totalmsqr com respeito aos parâmetros do modelok e a threshold delimita os parâmetros relevantes ao modelo (d).Na Figura 5 estão dispostos os perfis simulados de concentração de quitosanase na saída da coluna de ALE em diferentes condições operacionais com os parâmetros estimados do
algoritmo PSO e do algoritmo Gauss-Newton. A diferença de valores nos cinco termos de s alterou significativamente o comportamento do modelo nas três etapas. As curvas de ruptura geradas com os parâmetros do PSO estão posicionadas mais a direita e apresentaram o formato S característico, enquanto que as curvas de ruptura com os parâmetros re-estimados saturaram antecipadamente e atingiram maiores valores de concentração na saída. Na lavagem a queda da concentração de quitosanase foi mais branda com os parâmetros do PSO do que com os parâmetros re-estimados. A inclusão do termo exponencial na equação de Langmuir realmente provocou a subida na concentração de quitosanase pela injeção da solução eluente, assim como ocorreu experimentalmente. Na eluição os picos simulados com os parâmetros PSO surgiram tão logo foi injetada a solução eluente a 700 mM de NaCl, enquanto que os picos com os parâmetros re-estimados foram mais largos e surgiram posteriormente no cromatograma. Independente do conjunto paramétrico usado, é de se destacar um grande desvio entre os resultados da simulação e os dados experimentais na etapa de eluição a 300 mM de NaCl, onde foi registrado um pequeno degrau de concentração de quitosanase na saída da coluna. Isto pode ser atribuído ao efeito do decréscimo da porosidade do leito pela mudança do regime expandido na lavagem para o regime compactado na eluição, causando o aumento da dessorção das quitosanases nas simulações do que observado experimentalmente.
Figura 2. Perfis dos cromatogramas da adsorção de quitosanases em uma coluna operada em leito expandido. A - Ensaio 1; B - Ensaio 2; C - Ensaio 3; D - Ensaio 4; E - Ensaio 5. (■) são os dados experimentais. As linhas sólidas são as respostas da simulação com os parâmetros do PSO. As linhas tracejadas são as respostas da simulação com os parâmetros re-estimados.
A qualidade do ajuste das curvas simuladas em relação aos dados experimentais foi avaliada pelo teste (Eq. 8) e pela medida estatística mean square error (MSE) (Eq. 9). 2
exp calc
2 2 1 calc N i i i i C C C
(8)
exp calc
2 1 N i i i C C MSE N
(9)A Tabela 3 mostra os valores de MSE e 2 obtidos nos ensaios de calibração e validação para os conjuntos de paramétricos PSO e Gauss-Newton. Em relação aos ensaios responsáveis pela calibração dos parâmetros foi observado que o conjunto de parâmetros PSO gerou valores baixos de MSE e 2, tendo a hipótese de igualdade aceita nos quatros ensaios a nível de 95 % de confiança e grau de liberdade igual a 41 (c2 56.94). A re-estimação dos parâmetros s apenas permitiu aumentar a qualidade global de ajuste, muito embora tenha ocorrido o aumento do valor de MSE na simulação da corrida 2. Ademais, bons resultados foram obtidos na simulação do Ensaio 5, mesmo ele não participando da estimação dos parâmetros do modelo. A re-estimação dos parâmetros por Gauss-Newton reduziu o valor de MSE de 9.634 x 10-4 para e 8.671 x 10-4 e o valor de 2 de 0.90 para 0.88, mostrando que a estimação híbrida é um caminho interessante para estimação de parâmetros para modelos general rate.
Tabela 3. Valores das medidas estatísticas 2 e MSE obtidos da simulação do modelo com o conjunto de parâmetros do algoritmo PSO e da re-estimação.
Parameter set Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5
Without re- estimation 2 3.98 (Significant) 9.77 (Significant) 0.97 (Significant) 4.19 (Significant) 0.90 (Significant) MSE 2.560 x 10-3 8.364 x 10-4 9.215 x 10-4 3.258 x 10-3 9.634 x 10-4 With re- estimation 2 1.49 (Significant) 3.68 (Significant) 0.33 (Significant) 0.59 (Significant) 0.88 (Significant) MSE 1.800 x 10-3 1.699 x 10-3 2.327 x 10-4 9.497 x 10-4 8.671 x 10-4
Com o modelo já validado, ele foi usado para a otimização das condições operacionais da ALE tendo como função objetivo o rendimento na eluição 700 mM de NaCl descrito na Equação 11. Neste procedimento foram preservados os volumes usados na carga, lavagem e eluição, o fluxo volumétrico na eluição e as concentrações de sal nas soluções eluentes. A solução da otimização revelou que as condições operacionais H 0 8 cm, Hdis 2 cm, u 100 cm/h e
10 0.21
C U/mL permitiram que o rendimento na eluição 700 mM de NaCl alcançasse o máximo de 15.03 %. Este valor é superior ao rendimento obtido na mesma etapa no Ensaio 4, 12.41 %, o maior alcançado nos experimentos. A Figura 3 mostra o comportamento da concentração de quitosanase na saída da coluna durante o processo ALE nas condições operacionais ótimas.
Figura 3. Perfil simulado do cromatograma de adsorção de quitosanases em uma coluna operada em leito expandido sob condições ótimas.
5. Conclusões
Neste trabalho buscou-se elaborar um modelo matemático que descreva o comportamento