Algodão GM

A agricultura no Brasil é um forte contribuinte econômico direta, seja relacionado à capacidade de gerar empregos ou à comercialização de produtos (AVELAR; VILELA, 2006), o que tem providenciado destaque brasileiro para o agronegócio. Dentre as culturas que mais se destacam no Brasil (cana-de-açúcar, soja, milho, feijão, café e algodão), a cotonicultura foi uma das primeiras atividades agrícolas desenvolvidas no País e tem contribuído de forma significativa no aumento do PIB (CEPEA/USP, 2011; MAPA, 2012).

O cultivo e a utilização da fibra do algodão pelo homem foram apresentados há mais de vinte séculos por diversas comunidades espalhadas por diferentes continentes, sendo as principais localizações: Índia, Egito e Peru (BELTRÃO, 1999; HUCKELL, 1993; MOULHERAT et al., 2002). A partir de então, o algodão se tornou a principal fibra natural utilizada no mundo principalmente na indústria têxtil (SANTOS et al., 1999).

No Brasil, os índios utilizavam para fiar e tecer o algodão no início do século XVI. Em 1576, deu-se início aos relatos de suas utilizações: o português Gandavo relatou que as camas eram feitas de teias de fios de algodão, entretanto para os indígenas o algodão tinha muitas utilidades, inclusive se tratando de alimentação (caroço esmagado e cozido) e tratamento de feridas (sumo das folhas) (FREIRE, 1999).

De 1960 a 1970, estima-se que a cotonicultura no Brasil atingiu mais de três milhões de hectares plantados nas regiões centro-sul e nordeste, conhecida como agricultura de pequenas áreas e tecnologia remota. No entanto, na década de 80 deu-se início à grande dificuldade de produção desencadeada pela entrada de uma nova praga, o bicudo-do-algodoeiro (A. grandis), o que reduziu a produtividade nacional e tornou o Brasil de maior exportador de algodão para o maior importador mundial (CONAB, 2006). A partir de então, a cotonicultura migrou para a região centro-oeste, traçando novas metas para a agricultura nacional. No entanto, para o melhor desenvolvimento e estabilidade da cultura, tornava-se necessário o aprimoramento de tecnologias voltadas para as novas condições oferecidas pela região promissora para a cotonicultura (BELTRÃO, 1999).

O surgimento de problemas financeiros e de manejo fitossanitário resultou na mudança de local de produção para uma nova região com ausência da praga, o que promoveu um progresso econômico inesperado: o estado do Mato Grosso conseguiu alcançar um crescimento de aproximadamente 536, 25%, passando de 42,26 mil hectares para 268,87 mil hectares, entre 1998 e 2000, gerando um aumento de produção de 82,21%. Tamanho sucesso pôde ser justificado pela utilização dos cultivares adaptados, bem como de novas técnicas de cultivo, promovendo o controle temporário dos danos causados por pragas (RICHETTI; MELO FILHO, 2002; CONAB, 2006).

Com a expansão da cultura, entre as décadas de 80 e 90, como resposta às mudanças regionais, a cotonicultura passou a se concentrar nas regiões sul, sudeste e nordeste. No entanto, após esse período sua disseminação pela região centro- oeste revelou seu perfil produtivo no cerrado brasileiro, espalhando consigo um crescimento espantoso para a cotonicultura nacional. Em números, o que antes correspondia a 8,8% de área de algodão do país, passou em 2002, para 63% do

total dessa área. Atualmente, somando-se a produção do centro-oeste com a produção da Bahia e do Maranhão, o algodão representa mais de 80% da produção nacional (AMPASUL, 2014).

O algodão é uma das culturas que mais tem se beneficiado dos avanços da biotecnologia, sendo o terceiro principal cultivo transgênico no mundo (JAMES, 2013). Atualmente, a resistência a inseto e tolerância a herbicida são as duas características agronômicas aprovadas e amplamente comercializadas que foram introduzidas no algodão através de engenharia genética (MEHBOOB-UR-RAHMAN, et al., 2012). Nas variedades resistentes a insetos foram incorporados ao genoma do algodoeiro genes que codificam proteínas entomotóxicas provenientes da bactéria

Bt. Esses eventos GM foram genericamente denominados algodoeiros Bt

(MOREIRA et al., 1999). Já as variedades resistentes a herbicida visam aumentar a facilidade de manejo de plantas invasoras, nas quais o transgene inserido é um homólogo do gene alvo insensível ao herbicida ou codifica uma enzima que degrada o herbicida (SAROHA et al., 1998; BECKIE, 2011; ICAC, 2012).

O avanço tecnológico e o aumento da produtividade do algodão permitiram ao Brasil passar de maior importador de algodão do mundo para o terceiro maior exportador do produto em apenas 12 anos. Destinada à indústria têxtil, a produção nacional de algodão no Mato Grosso e na Bahia é responsável por, cerca de, 82% da produção nacional e se destaca pelo investimento em biotecnologia, gerenciamento do setor e novas técnicas de manejo. Apenas a indústria têxtil do Brasil é capaz de consumir mais de um milhão de toneladas do algodão produzido no Brasil, totalizando 70% da produção total de 1,5 milhões de toneladas (MAPA, 2012).

No caso do algodão GM, a grande maioria das plantas resistentes a insetos- praga, expressa toxina Cry. A utilização dessa entomotoxina tem resultado em eventos capazes de promover a cultura dessa planta, entretanto, além disso, novas alternativas vêm sendo estudadas para o controle de insetos. Dessa maneira, na última década a técnica do RNA interferente tornou-se uma importante ferramenta genética que fez com que o estudo funcional de genes em insetos não-modelos se tornasse possível. Estudos de validação funcional por RNAi de genes que codificam para enzimas da via de síntese de quitina mostraram que esses genes são essenciais para o desenvolvimento de insetos (ALVES et al., 2010; ZHANG et al.,

2010; AMPASALA et al., 2011; ARAKANE et al., 2011). Quando a expressão desses genes foi inibida no coleóptero modelo, Tribolium castaneum, fenótipos letais foram observados (ARAKANE et al., 2008). Ademais, a validação da vitelogina, proteína precursora do vitelo presente no interior dos ovos de insetos, evidenciou a importância de se estudar o possível silenciamento desse gene em progênies de A.

grandis, resultando na inviabilidade de parte dos ovos decorrentes da diminuição

significativa da síntese dessa proteína (COELHO, 2013). Portanto, uma vez que a quitina está ausente em plantas e vertebrados, e o desenvolvimento e crescimento dos insetos dependem da biossíntese deste polímero, a identificação, a caracterização e o uso do silenciamento de genes envolvidos na síntese de quitina, assim como na síntese de vitelogenina, apresentam-se como estratégia promissora para desenvolvimento de novos métodos mais seguros e eficazes de controle desta praga.

1.6 JUSTIFICATIVA

Há muitos séculos a cotonicultura nacional tem sofrido com ataques e perdas graves causados por A. grandis. Mesmo com o surgimento de medidas de controle, principalmente, agrotóxicos, não tem sido muito eficaz pela grande quantidade necessária para controlar a emergência das infestações, o que implica em onerar o produto. O bicudo-do-algodoeiro possui uma estrutura adaptada para se nutrir e ovipor nos botões florais de plantas de algodão e, é completamente dependente dessa estrutura para a garantia de desenvolvimento de sua progênie, o que torna difícil o acesso e o desenvolvimento de um inseticida alvo especifico que interfira no metabolismo e no ciclo de vida do inseto. Dessa forma, os agrotóxicos ainda apresentam certa toxicidade para o humano, além do que, ocorre o desenvolvimento de variantes resistentes de outros insetos e de ciclos biológicos concomitantes. Por esta razão, é imperativo o desenvolvimento de novas alternativas biotecnológicas que não apresentem efeitos colaterais extremos. Nesse sentido, estudos envolvendo a inserção de transgenes em plantas de algodão que apresentem a capacidade de interferir no ciclo de vida e/ou na atividade desse inseto-praga têm demonstrado o potencial de serem utilizados como bioinseticidas. Assim, o presente estudo visa obter eventos GM de plantas de algodão resistentes ao A. grandis, por meio da

expressão de genes que codificam a proteína Cry e do silenciamento gênico por RNAi dos genes da quitina sintase II e da vitelogenina. Além disso, o estudo objetiva a caracterização molecular dos eventos transgênicos e a validação in planta dos referidos genes por meio de bioensaios.

2 OBJETIVO

2.1 OBJETIVO GERAL

Validar genes essenciais de A. grandis, o bicudo-do-algodoeiro, e a entomotoxina Cry8Ka5, a fim de obter plantas de algodão GM resistentes ao inseto- praga.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Sintetizar a construção pBSKdsCH2vitCry8Ka5, contendo dsRNA para os genes Quitina Sintase II e Vitelogenina, sob controle do promotor constitutivo UCeA 1.7 e, sequência do gene que expressa a proteína Cry8Ka5, sob domínio do promotor tecido-específico GhPGFS1;

2. Transformar embriões de sementes de algodão da variedade BRS-372, através da técnica de biobalística com a construção pBSK-dsCH2vitCry8Ka5, visando a superexpressão da toxina Cry e o silenciamento gênico de quitina e vitelogenina;

3. Caracterizar molecularmente as plantas de algodão GM por meio das técnicas PCR, ELISA e qRT-PCR;

4. Desafiar os eventos transgênicos com o inseto alvo, bicudo-do-algodoeiro, visando o seu controle.

3. METODOLOGIA

3.1. CONSTRUÇÃO GÊNICA

Foi utilizado o cassete pBSK-dsCHSvitCry8Ka5 para transformação de plantas de algodão, contendo dsRNA para os genes CHS2 e vitelogenina, sob domínio do promotor constitutivo, UceA 1.7, visando o silenciamento dos dois genes alvo de A. grandis. Agrupados in tandem (figura 5), na construção pBSK- dsCHSvitCry8Ka5, os transcritos dos genes alvos contêm 200pb específicos para cada um dos genes, cujos agrupamentos possuem direção invertida interrompida por intron, o que promove a formação de alça após a obtenção do transcrito, auto anelamento e dsRNA resultante. Além disso, o cassete contém a sequência que codifica para a proteína Cry8Ka5 sob domínio do promotor botão floral-específico GhPGFS1 para expressão direcionada para botão-floral. Como marca de seleção, o cassete possui o gene AHAS que confere resistência ao herbicida, Imazapyr.

Figura 5. Representação esquemática do cassete de expressão contendo o gene de seleção AHAS,

que confere resistência ao herbicida Imazapyr e o gene para super-expressão do dsRNA-CHS2vit, sob domínio do promotor UCeA 1.7 e o gene para a proteína Cry8Ka5 controlado pelo promotor tecido-específico GhPGFS1.