AMOSTRA DPPH (IC50 em µg/mL)

FRAP (EC em µmol/L) ORAC (unidades) EEPG 448,19 1972,33 0,82 Barbatusina ** 29,655 0

**_{Não apresentou atividade para a concentração de 5000με}

Avaliou-se a capacidade do extrato em sequestrar os radicais DPPH em distintas concentrações de forma a obter uma curva linear entre a concentração do antioxidante e o sequestro do radical. A partir da curva obtida calculou-se o IC50. Os resultados para o

ensaio de DPPH foram expressos em termos de porcentagem de DPPH remanescente (Figura 16), onde observa-se um decréscimo nessa porcentagem a medida que a concentração da solução do extrato etanólico das folhas de P. grandis aumenta (EEPG),

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indicando um potencial antioxidante. O IC50 (448,19 µg/mL) para a amostra foi

calculado com o intuito de avaliar de forma mais detalhada a ação antioxidante dessa amostra, pois ele determina a massa necessária desse para reduzir em 50% a concentração inicial de DPPH, com isso, se compararmos o IC50 dessa amostra com

dados obtidos da literatura para o extrato etanólico de P. ornatus (IC50 2,63 µg/mL)

(MORAIS et al, 2013) que apresentou atividade antioxidante podendo, assim, afirmar que o extrato etanólico de P. grandis possui baixa atividade frente ao radical DPPH. Não há relatos na literatura do estudo do extrato etanólico das folhas de P. grandis frente ao radical DPPH, no entanto, o óleo essencial dessa espécie apresentou-se como sendo uma fonte antioxidante promissora (ALBUQUERQUE et al, 2007). A barbatusina não apresentou atividade nesse ensaio.

O método FRAP foi utilizado para avaliar a atividade antioxidante do extrato em estudo e da barbatusina. Neste método, o complexo férrico-tripiridiltriazina (FeIII-TPZ) é reduzido ao complexo ferroso (FeII-TPZ), na presença de um antioxidante e em condições ácidas. O complexo formado por esta reação possui uma coloração azul intensa. O resultado obtido para o extrato e para a barbatusina foram de 1972,33 µmol/L e 29,655 µmol/L, respectivamente (Tabela 12), estes foram expresso para a concentração do antioxidante (µmol/L), para a absorbância equivalente a 1mM da solução de Fe(II). Segundo, KATALINIC et al, 2004, pode-se considerar que o extrato etanólico de P. grandis possui baixa atividade antioxidante com relação ao método FRAP, pois este afirma que para extratos vegetais com resultados de FRAP entre 1 e 5 mmol/L a atividade antioxidante desses extratos é considerada baixa.

0 20 40 60 80 100 120 0 200 400 600 800 1000 1200 % DPP H r e m an e sce n te Concentracao EEPG (µg/mL)

78 Figura 16: Avaliação da Atividade Antioxidante frente ao radical livre DPPH

O ensaio da capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC) também foi utilizado nesse trabalho com o intuito de medir a atividade antioxidante do extrato em estudo e da barbatusina. O antioxidante padrão utilizado nesse ensaio foi o trolox, o resultado foi quantificado usando a técnica da área sob a curva de decréscimo da fluorescência e os resultados foram expressos em unidades de ORAC (número de µmoles de trolox que produz a mesma atividade de 100g da amostra).

Conforme observado na Tabela 12, o extrato apresentou 0,82 unidades de ORAC indicando uma baixa atividade antioxidante se comparado com outra espécie do mesmo gênero que apresentou 4,71 µmols de trolox/g (ZHENG & WANG, 2001). O método ORAC possui uma vantagem muito importante com relação aos outros métodos de determinação da capacidade antioxidante que usam a absorbância, que é o uso da fluorescência como medida do dano oxidativo, pois, assim, ocorre menor interferência dos compostos coloridos presentes nas amostras. Outra vantagem é o uso de radicais peroxila ou hidroxila como pró-oxidantes, conferindo maior significado biológico em relação aos métodos que usam oxidantes (LIMA, 2008). A barbatusina também não apresentou atividade nesse ensaio.

Atualmente, existe uma grande dificuldade de comparação entre dados experimentais referentes à atividade antioxidante aferida por diferentes métodos, bem como de comparar dados da literatura. Essa dificuldade se deve à diversidade de compostos antioxidantes, que diferem quanto à classe química, quanto à polaridade, quanto à solubilidade, quanto a matriz alimentar, quanto às especificidades da metodologia e, principalmente, as condições de análises empregadas e a forma de expressão dos resultados, que muitas vezes não permite uma comparação direta (GIADA & MANCINI FILHO, 2006; VILLAÑO et al, 2006). No entanto, pode-se observar uma correlação positiva da atividade antioxidante com os métodos DPPH, FRAP e ORAC.

5.2-Determinação de polifenóis e de flavonoides

A determinação do teor de compostos fenólicos totais se faz muito importante, pois vários estudos têm demonstrado que eles são os principais responsáveis pela a atividade antioxidante.SOUSA et al. (2007) afirmam que as propriedades antioxidantes dos compostos fenólicos são devidas à estrutura química e propriedade redutora dos

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mesmos, sendo estas características importantes no sequestro ou neutralização dos radicais livres, bem como na quelação de metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação quanto na de propagação do processo oxidativo, formando intermediários estáveis por ressonância.

A Tabela 13 apresenta o teor de compostos fenólicos totais e flavonoides totais encontrado no extrato etanólico de P. grandis. O extrato avaliado apresentou baixo teor de compostos fenólicos, quando comparados a dados de outras espécies descritos na literatura (SOUZA et al, 2007; VELIOGLU et al, 1998; KAHKONEN et al, 1999).

Observou-se uma correlação positiva entre os polifenóis totais e os ensaios de atividades antioxidante do extrato de P. grandis, onde a baixa atividade está correlacionada com o baixo teor de compostos fenólicos.

Tabela 13: Resultados do teor de polifenóis e de flavonoides

Metabólito Secundário Resultado ± DP

Polifenóis 59,5 ± 12,37 mg de EAG/g de extrato Flavonoides 5,92 ± 2,40 mg de ERu/g de extrato

Os resultados para o teor de flavonoides totais foram considerados baixos se comparados a estudos realizados com outra espécie do mesmo gênero que apresentou (14,87 mg de ERu/500mg de extrato) baixo teor de flavonoides (ARAÚJO et al, 2008). Segundo GRAYER et al, 2010, trinta e quatro espécies do gênero plectranthus foram pesquisados para flavonoides e apenas cerca de 40% dessas espécies apresentaram esses compostos, sendo que essas espécies se diferenciavam apenas de modo quantitativo uma das outras, com isso, pode-se afirmar que esse gênero não é considerado uma boa fonte promissora para obtenção de flavonoides, no entanto, compostos de outras classes podem ser obtidos a partir desse gênero como, por exemplo, os obtidos nesse trabalho.

5.3-Inibição da enzima conversora de angiotensina I (ECA)

A enzima conversora de angiotensina I (ECA) desempenha um papel importante na regulação da pressão sanguínea no sistema renina-angiotensina (SRA), pois catalisa a conversão da angiotensina I em angiotensina II, um vasoconstritor potente, e inativa a bradiquinina, um potente vasodilatador (SPYROULIAS et al., 2003; WARNER et al., 2004; GUY et al., 2005). Assim, o resultado da ação da ECA contribui de forma significativa para o desenvolvimento da hipertensão arterial e de outras patologias cardiovasculares e renais.

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Atualmente, vem se intensificando a busca por inibidores da ECA (IECA) derivados de fontes naturais para que possa ser uma alternativa futura para o controle da hipertensão, com redução dos efeitos colaterais ocasionados por IECAs sintéticos consumidos (SERRA et al., 2005). Com isso, o ensaio da atividade inibitória da ECA foi realizado com o extrato etanólico de P. grandis e com a barbatusina, as reações foram submetidas à análise por CLAE-DAD para verificar o valor da área do pico de ácido hipúrico formado, que é o produto da reação entre a ECA com o substrato HHL. Esse valor foi descontado do branco e comparado com o valor de ácido hipúrico formado do controle. O cálculo para encontrar a atividade inibitória da enzima foi realizado em porcentagem de inibição da enzima, onde o extrato etanólico e a barbatusina apresentaram 48,46% e 2,77%, respectivamente, de inibição da ECA. Esse valores de inibição são considerados baixo se comparado ao inibidor sintético captopril (medicamento anti-hipertensivo utilizado como controle positivo) que apresentou 99% de inibição da ECA. No entanto, correlacionando o resultado de inibição da ECA do extrato da espécie em estudo com o resultado de inibição da ECA para espécies que são utilizadas, popularmente, como anti-hipertensivos e diuréticos onde a porcentagem de inibição variou de 7,3 a 72,2% (SERRA et al., 2005), o Plectranthus grandis pode ser considerada uma espécie promissora para estudos futuros com o intuito de se obter uma fonte natural para o controle da hipertensão se comparada às espécies utilizadas popularmente para esse fim.

5.4- Ensaio para inibição da enzima acetilcolinesterase

Diversos estudos relatam a capacidade de plantas com atividade de inibição sobre a enzima AChE, demonstrando um potencial terapêutico para o tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (TREVISAN et al., 2003; ADSERSEN et al., 2006). Abordagens etnofamacológicas e estudos químicos fornecem caminhos para a identificação de plantas e compostos isolados como inibidores de AChE, e consequentemente levam a descoberta de drogas relevantes para o tratamento do mal de Alzheimer (MUKHERJEE et al., 2007; HOMES et al., 2003). Com isso, o ensaio para a inibição da enzima acetilcolinesterase foi realizado com o extrato de P.

grandis (EEPG) e com a barbatusina na busca por novos compostos bioativos, no

entanto, os resultados não foram satisfatórios (Tabela 14), pois tanto o extrato quanto a barbatusina não inibiram a enzima, porém não foi descartada a possibilidade de outros

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estudos com diferentes métodos para determinação da inibição do extrato e da barbatusina sobre a acetilcolinesterase.

Tabela 14: Resultado do ensaio de inibição da enzima acetilcolinesterase

Amostras Resultado Tamanho do halo

Padrão positivo (Eserina) Positivo 0,9 Padrão negativo (Metanol) Negativo **

EEPG Negativo **

Barbatusina Negativo **

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6-PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

6.1-Material Botânico 6.1.1-Coleta

As coletas foram realizadas no Horto de Plantas Medicinais Prof. Francisco José de Abreu Matos da Universidade Federal do Ceará especificamente para atender aos dois objetivos abaixo. As condições ambientais foram monitoradas pela medição da temperatura e umidade relativa do ar de cada horário de coleta. A excicata está depositada no Herbário Prisco Bezerra-UFC sob o Nº 28377.

6.1.1.1-Estudo químico e Isolamento de metabólitos secundários

Folhas frescas de P. grandis foram coletadas às 9h, no mês de abril de 2013, sendo o material botânico seco a temperatura ambiente (m= 425,0 g) e extraído a frio com etanol destilado.

6.1.1.2- Estudo da Variação Sazonal e Circadiana da Barbatusina

As coletas das folhas de P. grandis foram realizadas durante um ano (cerca de 100 a 200 g de folhas), mensalmente, sendo iniciadas no mês de julho de 2013 e, a partir de então, sendo amostradas num período de 24 horas com re-coletas a cada 6 horas. O material botânico foi seco em estufa a uma temperatura de 50°C, triturado e extraído a frio com etanol destilado, a umidade foi calculada colocando-se de 3 a 5 folhas frescas, devidamente identificadas e previamente pesadas. Os dados de temperatura e umidade do ar foram monitorados com o uso de um termo higrômetro.

6.2-Técnicas Espectroscópicas

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN 13C)

Os dados técnicos e as condições operacionais sobre os espectros de RMN 1H e RMN13C unidimensionais foram obtidos junto ao Centro Nordestino de Aplicação e uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN). Os espectros foram obtidos em espectrômetros Bruker, modelo Avance DPX-300 e modelo Avance DRX-500, operando na frequência do hidrogênio a 300 e 500 MHz, e na frequência do carbono a 75 e 125 MHz., respectivamente.

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Na dissolução das amostras foi utilizado clorofórmio deuterado (CDCl3). Os

deslocamentos químicos ( ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e referenciados, no caso dos espectros de RMN 1H, pelos picos dos hidrogênios pertencentes as moléculas residuais não deuteradas do solvente utilizado_{: clorofórmio (} 7,27). Para os espectros de RMN13C, os deslocamentos químic_{os ( ) foram} referenciados pelo pico dos carbonos-13 do sol_{vente: clorofórmio ( 77,0).}

Os conceitos de multiplicidades dos sinais dos espectros de RMN 1_{H foram}

indicados segundo a convenção: s (singleto), d (dubleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto), sl (singleto largo) e dd (duplo-dubleto).

O padrão de hidrogenação dos carbonos em RMN 13C foi determinado através da técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com ângulo de nutação de 135º, CH e CH3 com amplitudes em oposição aos CH2, e foi descrito

segundo a convenção: C (carbonos não-hidrogenado); CH (carbono metínico); CH2

(carbono metilênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não hidrogenados foram

caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135º do espectro RMN 13C-BB.

6.3- Ponto de fusão

Na determinação dos pontos de fusão das substâncias isoladas empregou-se um aparelho de microdeterminação da Microquímica provido de placa aquecedora modelo MQAPF-301. As determinações foram realizadas a velocidade de aquecimento de 2,5º C/min.

6.4- Estudo dos constituintes fixos de Plectranthus grandis

No isolamento dos constituintes fixos de P. grandis foi empregada a técnica de extração em fase sólida além das técnicas cromatográficas descritas abaixo.

6.4.1- Extração em fase sólida

As frações obtidas após um fracionamento do extrato de P. grandis foram submetidos a extração em fase sólida (SPE), sempre mantendo-se a proporção em massa de 1:20 utilizando como fase estacionária C18 (J.T. Baker), 40-60µm, APD, 60 Å. Como

fase móvel, foram empregados os eluentes: hexano, acetato de etila e metanol de acordo com os gradientes apresentado na Tabela 16.

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A fase móvel foi preparada seguindo o cálculo do volume morto dado pela fórmula, segundo FUNARI, 2011.

Onde: Vm = Volume morto ; π= Altura da fase estacionária (cm) e D= Diâmetro da coluna (cm)

6.4.2- Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

As análises por cromatografia de adsorção em camada delgada (CCD) foram realizadas utilizando-se cromatoplacas de vidro, com uma das faces revestida por uma fina camada de sílica gel 60G F254 da VETEC. Também foram utilizadas cromatofolhas de gel de sílica sobre alumínio CCF-C/25 da MERCK, com camadas de 250 µm de espessura e dimensões de 20 x 20 cm (com indicador de fluorescência na faixa de 254 nm).

Os eluentes utilizados como fase móvel, seguiram uma série eluotrópica, que podia ser tanto isocrática ou com aplicação de gradiente de polaridade. Os solventes mais usados foram hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, todos de qualidade P.A. ou previamente destilados.

A revelação das substâncias nas cromatoplacas foi realizada utilizando-se os métodos químicos: com vapores de iodo granulado e pela pulverização com solução de vanilina (C8H8O3), seguido de aquecimento em estufa a 100o C por cerca de 5 min.

6.4.3- Cromatografia em Coluna por Adsorção

A técnica de cromatografia de adsorção em coluna aberta foi amplamente utilizada no isolamento e purificação dos compostos de P. grandis. O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as quantidades de gel de sílica e de material a ser tratado. A fase estacionária (adsorvente) usada foi: gel de sílica 60 da VETEC (Ø µm 70-230 mesh, para cromatografias gravitacionais) para cromatografia em coluna de fase normal. Os eluentes mais utilizados nesses procedimentos foram

Vm =

π

2

4 H

2

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hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, seguindo a ordem crescente de polaridade.

6.4.4-Fracionamento preliminar do extrato etanólico das folhas de P. grandis

O estudo cromatográfico iniciou-se com a utilização de uma coluna filtrante, usando-se gel de sílica como fase estacionária e o extrato etanólico em estudo (EEPG) (11,0060 g), que foi pulverizado em gral de porcelana e acondicionado sobre gel de sílica utilizando-se 205,93 g da fase estacionária. Utilizou-se como eluentes os seguintes solventes em ordem crescente de polaridade: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol. Todas as frações obtidas foram concentradas em evaporador rotativo. A quantidade de material de cada fração é apresentada na Tabela 15.

Tabela 15: Dados oriundos do tratamento cromatográfico de EEPG

ELUENTES FRAÇÕES (Rótulo) PESO (g)

HEXANO PGFH 0,0737

DICLOROMETANO PGFD 0,4807

ACETATO DE ETILA PGFA 2,8827

METANOL PGFM 5,0912

RENDIMENTO =77,5 %

6.4.5-Isolamento de PG1 e PG2 a partir de PGFH e PGFD.

O tratamento cromatográfico do extrato etanólico de P. grandis forneceu as frações hexânica (PGFH) e diclorometânica (PGFD) que foram reunidas após serem analisadas em CCD. Em seguida, essas frações foram submetidas à extração em fase sólida utilizando C18 como fase estacionária e como eluentes: hexano, AcOEt e MeOH,

em diversas proporções, como apresentado na Tabela 16.

Tabela 16: Gradiente da fase móvel utilizada na extração em fase sólida das frações de

P. grandis utilizando C18. Fração Hexano (%) Acetato de Etila (%) Metanol (%) Massa (g) 1 100 0 0,3000 2 80 20 0,2157 3 60 40 0,0250

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4 40 60 0

5 20 80 0

6 0 100 0

7 100 0

A fração hexânica (PGFH1) obtida desse fracionamento foi submetida à separação dos constituintes detectados, através de cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP). As placas foram previamente deixadas na estufa à 120°C por 10 min, a amostra foi dissolvida na menor quantidade de solvente (diclorometano) e foi realizada a aplicação do material em 2 placas.

A placa após ser eluída 3 vezes em hexano/diclorometano (9:1) apresentou-se de forma bastante resolvida, pois as faixas podiam ser vistas naturalmente apresentando uma distância considerável entre elas, por este motivo não se fazia a necessidade de utilização de métodos físicos de revelação. Desta forma as faixas foram retiradas das placas por raspagem e deixadas em contato com diclorometano por 30 min, depois filtradas em papel de filtro e submetidas à evaporação em evaporador rotativo à pressão reduzida. O tratamento de PGFH1 forneceu um sólido branco com uma faixa de fusão de 189-192 oC. A amostra foi denominada PG1 (74,6 mg).

A fração hexânica/acetato de etila (8:2), (PGFH2), também obtida da extração em fase sólida das frações PGFH e PGFD foi adsorvida em 1,478g de gel de sílica, pulverizada em gral de porcelana e devidamente acondicionada sobre 8,314g de gel de sílica em coluna cromatográfica. Usando como solvente hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol puros ou em combinações binárias seguindo uma escala crescente de polaridade.

As frações de 1-6 eluídas com hexano, as frações 7-18 foram eluídas com hexano/diclorometano (8:2), 19-23 com hexano/diclorometano (6:4), 24-28 com hexano/diclorometano (4:6), 29-33 com hexano/diclorometano (2:8), 34-38 com diclorometano, 39-43 com diclorometano/acetato de etila (8:2), 44-45 com diclorometano/acetato de etila (6:4), 46-47 com acetato de etila, 48-49 com metanol. As frações coletadas foram reunidas segundo os resultados observados pela análise em CCD de acordo com a semelhança do Rf.

Após a análise em CCD de PGFH2 foram reunidas as frações 14-17, 18-21, 22-27 e denominadas PGFH2 14-27 (115,0 mg), que se apresentava como um sólido amorfo

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amarelado. Após sucessivas purificações com hexano resultou no isolamento de um sólido branco em forma de agulhas solúvel em diclorometano e com faixa de fusão entre 212-214°C que foi denominada PG2 (34,6 mg). O Fluxograma 1, ilustra resumidamente as etapas envolvidas para a obtenção de PG1 e PG2.