5-Atividades Biológicas 5.1-Atividade Antioxidante
FRAÇÃO PGFA 2,8827g
1- Extração em Fase Sólida 2- CCD 1- Coluna Cromatrográfica 2- CCD FRAÇÃO PGFA4 (524mg) DEMAIS FRAÇÕES
(Em Estudo) 1- Coluna Cromatrográfica
89 Fluxograma 2 – Obtenção e isolamento de PG3 a partir de PGFA.
6.5- Estudo da Variação Sazonal e Circadiana da Barbatusina no extrato etanólico das folhas de P. grandis por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
Estes experimentos foram realizados no IFCE (Instituto Federal do Ceará) – Campus Maracanaú.
6.5.1- Condições cromatográficas utilizadas
Equipamento: Cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Thermo Electron Corporation, detector UV-VIS, Bomba Finnigan Surveyor, e aquisição de dados via computador tipo Core2Duo 2,93 GHz, usando o software ChromQuest 5.0.
Coluna: As análises do padrão e dos extratos da espécie estudada foi realizada utilizando-se a coluna analítica Phenomenex Kinetex C18, (250 mm x 4,60 mm - 5 µm).
Detector: O detector foi utilizado na região do UV-VIS, com os cromatogramas registrados em 254 nm.
Solventes e Eluentes
Metanol e acetonitrila grau HPLC (Vetec e Teddia).
Água ultrapura, preparada em sistema Milli Q da Purelab Option.
Padrão: Foi utilizado como padrão a barbatusina, substância isolada de P. grandis no Laboratório de Produtos Naturais - UFC.
6.5.2-Preparação das amostras (Clean-up)
Os extratos de P. grandis foram preparados na concentração de 2,5 mg/mL e eluídos em cartuchos SPE VertiPak C18ec (3 mL/500 mg), com MeOH. O padrão
utilizado na análise foi preparado na concentração de 1 mg/mL.
PG3 (15mg) DEMAIS FRAÇÕES (Em Estudo) FRAÇÃO PGFA4/45-49 (245mg)
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Para otimizar a análise por CLAE foi usado um extrato etanólico bruto das folhas de P. grandis como referência. Foram testados onze formas de injeção (Tabela
17) com variações nos intervalos de tempo e no gradiente de polaridade, bem como no solvente utilizado no modo isocrático.
Tabela 17: Condições Cromatográficas realizadas.
Teste 1 Teste 2 Teste 3
Tempo (min) % MeOH % H2O Tempo (min) % MeOH % H2O Tempo (min) % MeOH % H2O 0,01 30 70 0,01 40 60 0,01 30 70 40 100 0 25 100 0 30 100 0 50 30 70 30 40 60 33 30 70 33 40 60 35 30 70
Teste 4 Teste 5 Teste 6
Tempo (min) % MeOH % H2O Tempo (min) % CH3CN % H2O Tempo (min) % CH3CN % H2O 0,01 45 55 0,01 70 30 0,01 30 70 7 45 55 7 70 30 7 50 50 15 70 30 18 30 70 20 30 70
Teste 7 Teste 8 Teste 9
Tempo (min) % CH3CN % H2O Tempo (min) % CH3CN % H2O Tempo (min) % CH3CN % H2O 0,01 40 60 0,01 50 50 0,01 20 80 5 50 50 10 70 30 30 70 30 15 80 20 15 100 0 33 20 80 18 40 60 17 50 50 35 20 80 20 40 60 19 50 50 Teste 10 Teste 11 Tempo (min) % CH3CN % H2O Tempo (min) % CH3CN % H2O 0,01 20 80 0,01 20 80
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25 70 30 20 70 30 27 20 80 22 20 80 30 20 80 25 20 80
Os resultados foram avaliados pela maior resolução dos picos cromatográficos do extrato bruto, sendo que o teste número 10 apresentou a melhor condição cromatográfica.
O método cromatográfico adotado para todas as análises desse trabalho consistiu, portanto, do teste 10, onde o gradiente utilizado foi: 20 a 70% de acetonitrila por 25 minutos.O retorno para a condição inicial, ou seja, tempo de recondicionamento da coluna, foi de 2 minutos, sendo mantida por 3 minutos. Ao final, o tempo de análise foi de 30 minutos. O volume injetado foi de 20 microlitros, o comprimento de onda de 254 nm e fluxo de 0,8 mL/min.
6.5.3- Quantificação da barbatusina
Para a análise da variabilidade quantitativa da barbatusina nos ciclos circadiano e sazonal, foi utilizado o método de padronização externa onde comparou-se a área da substância a ser quantificada (barbatusina) na amostra com as áreas obtidas com soluções de concentrações conhecidas preparadas a partir da barbatusina. A curva analítica foi preparada a partir de uma solução padrão da barbatusina a 1000 μg/mδ nas concentrações de 25, 50, 100, 250 e 500 µg/mL, a curva foi obtida em triplicata.
6.5.3.1-Validação do Método
Os parâmetros analíticos avaliados para o método de validação foram: linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez.
Para a validação da metodologia de análise foram levados em consideração os parâmetros, métodos e definições apontados por LEITE, 2002; RIBANI et al., 2004 e pela ANVISA, 2003.
a) Linearidade
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados que expressem uma relação de proporcionalidade entre um sinal físico medido e a concentração da substância em exame, dentro de uma determinada faixa analítica. A
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correlação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a massa ou concentração da espécie a ser quantificada gera a curva analítica, a qual pode ser matematicamente expressa pela equação da reta, cuja resolução permite a quantificação do analito.
Além dos coeficientes de regressão a e b, também é possível calcular, a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de correlação r. Este parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.
Para o estudo da linearidade preparou-se uma solução estoque da barbatusina na concentração de 1000 μg/mL, dissolvendo-se a barbatusina em metanol grau HPLC, foram realizadas diluições para a obtenção das seguintes concentrações: 25; 50; 100; 250 e 500 μg/mL. A curva de calibração foi construída plotando-se os valores médios das áreas dos picos cromatográficos em função das concentrações.
b) Precisão
A precisão reflete a concordância entre os resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Pode ser expressa como desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de uma série de medidas. Pode ser considerada em três níveis diferentes: repetibilidade intradia e interdia e reprodutibilidade. É calculada através da seguinte equação:
DPR = DP x 100 CMD
Onde: DPR = desvio padrão relativo DP = desvio padrão
CMD = concentração média determinada
A precisão do método foi avaliada pela repetibilidade (precisão intradia e interdia), injetando-se em triplicata o padrão em três concentrações distintas (25, 100 e 500 μg/mL), registrando-se os valores das áreas dos picos cromatográficos e calculando-se o desvio padrão das determinações.
c) Exatidão
Representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. Os
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processos mais utilizados para avaliar a exatidão de um método são: materiais de referência; comparação de métodos; adição de padrão e ensaios de recuperação.
A recuperação (ou fator de recuperação), R, é definida como a proporção da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada ao material teste, que é passível de ser extraída e quantificada.
Para a avaliação da recuperação, o extrato etanólico do P. grandis coletado no mês de março no horário das 18 hs foi utilizado, pois este extrato apresentou o menor teor de barbatusina dentre os extratos analisados. O extrato foi fortificado com concentrações conhecidas do padrão em três níveis de concentração. As determinações de concentração de cada solução foram feitas em triplicata, e calculadas as porcentagens de recuperação.
R(%) = 100 (Cf)/(Ce + Ca)
Onde: R(%) = percentual de recuperação Cf = concentração do extrato fortificado Ce = concentração do extrato não fortificado Ca = concentração do analito adicionado ao extrato
d) Sensibilidade
A sensibilidade é a capacidade de um método distinguir pequenas variações de concentração, sendo determinada através dos limites de quantificação e de detecção.
Limite de Detecção (LD)
O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em exame que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada. A magnitude do sinal físico medido deve ser três vezes a magnitude do sinal do ruído.
LD = DPc x 3 IC
Onde: DPc = desvio padrão da curva IC = coeficiente angular da reta
Limite de Quantificação (LQ)
O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração da substância em exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental.
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A magnitude dessa concentração limite deve ser dez vezes a magnitude do sinal do ruído.
LQ = DPc x 10 IC
Onde: DPc = desvio padrão da curva IC = coeficiente angular da reta
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados pela divisão do desvio padrão da curva de calibração pelo seu coeficiente angular, multiplicados por 3,0 e 10,0, respectivamente. As determinações foram calculadas em triplicatas.
e) Robustez
A robustez pode ser definida como a sensibilidade de um método frente a pequenas variações nas condições analíticas. Nesse trabalho ela foi avaliada variando as condições analíticas seguintes: proporção dos solventes da fase móvel e o fluxo de vazão da análise.
6.6-Avaliação do Potencial Químico e Biológico do extrato de P. grandis e da Barbatusina
Os experimentos das determinações das atividades biológicas do extrato etanólico de P. grandis foram realizados no DKFZ (German Cancer Research Center).
6.6.1-Atividade Antioxidante
A atividade antioxidante do extratos de P grandis foi avaliada através de três métodos: DPPH, FRAP e ORAC e foram determinados os teores de polifenóis e flavonoides para justificar (ou não) a atividade observada. Também foi avaliado o potencial de inibição da enzima conversora de angiotensina I (ECA).
6.6.1.1-Ensaio Antioxidante frente ao radical livre DPPH
A capacidade de eliminação de radicais livres dos compostos foi determinada usando o método de coloração radical DPPH de SILVA et al., 2006. O método baseia-se na transferência de elétrons onde, por ação de um antioxidante ou uma espécie radicalar,
95
o DPPH(2,2-difenil-1-picril-hidrazila) que possui cor púrpura é reduzido formando 2,2- difenil-1-picril-hidrazina, de coloração amarela, com consequente desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres.
Figura 17: Reação genérica entre o radical livre DPPH e um antioxidante.
O extrato etanólico das folhas de P. grandis foi diluído em metanol nas concentrações 0,01-1,0 mmol/L e para a barbatusina as concentrações foram superiores a 1,0 mmol/L, 20 µL de diferentes concentrações do extrato foi adicionado em placas de 96 poços em duplicata. A reação foi inicidada após a adição 180 µL da solução de DPPH (20 µg/mL em metanol). A absorbância foi mensurada após 10 min. em um equipamento Universal micro plate reade (Elx 800 Bio-Tek Instruments, Winooski, Vermont, USA) versus uma solução controle.
A concentração de DPPH foi calculada a partir de uma curva padrão de DPPH entre 1-100 µg/mL medidas simultaneamente. Para a medição do IC50 (Concentração
provinda da inibição de 50% do radical livre DPPH) foi utilizado o programa Table curve (Jandel Scientific, Chicago, IL).
6.6.1.2- Ensaio Antioxidante FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)
Utilizou-se o método descrito por PULIDO et al., 2000. Ele está baseado na capacidade dos metabólitos em reduzir o Fe3+ em Fe2+, quando isto ocorre na presença do 2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina (TPTZ), ocorre a formação de um complexo de Fe3+/TPTZ com a coloração azul do Fe2+.
96 Figura 18: Redução do complexo TPTZ (2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina) com Fe3+ .
O extrato etanólico das folhas de P. grandis foi inicialmente diluido nas concentrações de 0,01-1,0 mmol/L e para a barbatusina as concentrações foram superiores a 1,0 mmol/L, 10 µL das diferentes concentrações são incubadas com 30 µL de água bidestilada e 300 µL do reagente FRAP consistindo 25 mL tampão de acetato (300 mmol/L de acetato de sódio, pH=3,6). 2,5mL TPTZ (10 mmol/L TPTZ em 40 mmol/L de HCl) e 2,5 mL de FeCl3 a 37°C antes de mensurar. Todos os reagentes
foram preparado diariamente. Também foi usada uma curva de calibração de sulfato ferroso (0,01-1,0 mmol/L) e os resultados expressos em mmol/L de Fe2+.
A reação foi mensurada a 595 nm, depois de um tempo de repouso de 5 min. Usando a curva de regressão linear foi calculado o valor de EC, o valor é dado para a concentração do antioxidante (µmol/L), para a absorbância equivalente a 1 mmol/L da solução de Fe(II).
6.6.1.3- Ensaio Antioxidante ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
O método ORAC foi originalmente desenvolvido por Cao et al. (1993). Este método, relativamente simples e sensível, mede a capacidade do antioxidante em sequestrar radicais peroxila que são gerados por uma fonte radicalar, AAPH 3,3‟-azo- bis-(2-amidinopropano)-diidroclorodo (AAPH) fluoresceína (0,21 µmol/L em tampão ORAC) como indicador um redox.
A partir de uma solução estoque de Trolox em DMSO (10 mmol/L), é diluída na solução tampão de ORAC para um concentração de 20 µmol/L. A solução tampão de ORAC contém 75 mmol/L de hidrogênio fosfato dissódico, pH=7,4. Todos os reagentes foram preparados para uso imediato.
97
10 µL das soluções das amostras são colocadas em placas de 96 poços em quadruplicata, e 170 µL da solução de fluoresceína e incubadas por 10min. à 37°C. A reação é iniciada ao adicionar 20 µL da solução de AAPH (103,5 mg/2mL) recém preparada no tampão ORAC.
O declínio da fluoresceína foi mensurado a 37°C de 2 em 2 min até a completar 122min usando uma microplaca leitora de fluorescência Cytoflour 4000 (excitação:530/25 nm, emissão:585/30nm) (Perspectve Biosystems, Minnesota, USA).
Os valores finais do ORAC foram calculados usando a equação de regressão entre a concentração do Trolox, expressa em unidades de ORAC, onde 1 unidade de ORAC inibe o declínio produzido por 1 µmol/L de Trolox.
A queda na fluorescência indica a extensão do dano causado pela sua reação com os radicais gerados. O efeito protetor de uma amostra contendo compostos com potencial antioxidante é mensurado pelo cálculo da área sob a curva de decaimento da fluorescência da amostra comparando-se com de uma amostra “branco”, sem nenhum antioxidante presente. O ensaio ORAC permite o monitoramento do tempo e do grau de inibição durante o andamento da reação.
6.6.2- Determinação dos polifenóis
As análises dos extratos foram realizadas para determinação de fenóis totais pelo método Folin-Ciocalteau (FOLIN e CIOCALTEAU, 1927; WATERHOUSE, 2001). Alterações no método foram inseridas visando à adequação aos teores de compostos fenólicos encontrados em cada espécie. O método Folin-Ciocalteau consistiu em adicionar 0,25 mL do extrato em um balão volumétrico de 100 mL contendo 75 mL de água, adicionando-se 5 mL do reagente Folin-Ciocalteau (solução aquosa 10%), 10 mL de solução de carbonato de sódio (7,5%) e volume completado com água destilada. Essa solução foi agitada adequadamente e depois ficou em repouso por 30 minutos. Após esse período, a absorbância foi lida a 760 nm. O mesmo procedimento foi adotado para as soluções-padrões de ácido gálico. A quantidade de fenóis foram expressos em mg /g de extrato ± (desvio padrão) equivalente ao ácido gálico.
6.6.3-Determinação dos flavonoides
Os flavonoides foram determinados pelo método espectrofotométrico, segundo MEDA et al, 2005 utilizando a rutina como solução padrão, onde uma curva linear foi construída. O extrato foi solubilizado em metanol nas concentrações de 1 mg/mL e 2%
98
de AlCl3, também preparados em metanol, 1 mL de cada uma destas soluções foram
misturados e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. E a absorbância foi determinada utilizando um espectrofotômetro Pharmacia Biotech, Ultrospec 3000 no comprimento de onda de 415 nm. As amostras foram lidas em duplicatas e os resultados expressados em mg em equivalente de rutina por grama de extratos (mg ERu/g de extrato) ± desvio padrão.
6.6.4- Potencial de Inibição da enzima conversora de angiotensina I (ECA)
O método foi baseado segundo LAHOGUE et al, 2010. O substrato HHL (5 mmol/L-2,15 mg/mL) foi dissolvido em 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,3) contendo 0,3 mol/L NaCl. A solução de extrato (10 mg/mL) e de barbatusina (1 mg/mL) foi adicionada a solução de substrato (100 µL) e incubados a 37°C por 10min. A solução de ECA (200 miliunidades/mL) em 50mmol/L Tris-HCl, pH 8,3 contendo 0,3 mol/L NaCl, adicionado e incubado a 37°C por 30min, com agitação contínua a 450 rpm. A reação é cessada ao adicionar HCl (100 µL). Somente para as amostras que apresentam uma inibição da enzima maior que 50%, calcula-se o IC50.
O anti-hipertensivo Captopril foi usado como controle positivo na concentração de 2ng/mL e o metanol utilizado como controle negativo. A análise da mistura reacional em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi conduzida no aparelho Hewlett-Packard (HP) 1090, da seguinte forma: o detector UV foi ajustado a 228 nm, injeção de 5µL, fluxo 1mL/min. e pressão máxima de 400bar, com um tempo de 17 minutos de corrida, utilizando o seguinte gradiente de eluição: Eluente (A): 0,05% ácido ácido trifluoroacético em água e eluente (B): 0,05% ácido trifluoroacético em acetonitrila.
Tabela 18: Condições cromatográficas do ensaio da ECA Tempo Eluente A Eluente B
10 min 40%A 60%
7 min 95%A 5%
6.6.5- Ensaio para inibição da enzima acetilcolinesterase
Este ensaio é baseado em procedimento descrito por Ellman et al.(1961), adaptado para CCD por Rhee et al. (2001). É considerado um método colorimétrico e
99
que pode ser utilizado de forma qualitativa e quantitativa, mas nesse trabalho foi utilizada somente a forma qualitativa. É um método rápido e sensível para a seleção de amostras com ação anticolinesterásica. A metodologia consiste em retirar uma alíquota de 5μδ do extrato na concentração de 10 mg/mL e 2 mg/mL para a barbatusina e aplicar em uma cromatoplaca. Após a evaporação do solvente, foi borrifado uma mistura (1:1) de iodeto de acetilcolina (ATCI) 1 mmol.L-1 com o reagente de Ellman (ácido 5,5‟ –
Ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB, 1 mmol.L-1), deixando em repouso por 3 minutos para
a secagem da placa. Em seguida foi borrifado a enzima acetilcolinesterase (15 U/mL). Após 10 minutos, ocorre o surgimento de uma coloração amarela, porém, onde há inibição da enzima, observa-se um halo branco em torno dos “spots” onde foram aplicadas as amostras. Em 20-30 minutos a coloração desaparece. O ensaio foi realizado em triplicata.
Como controle positivo, foi utilizada a solução do padrão sal de Eserina e como controle negativo, foi utilizado o solvente que foi usado para a diluição das amostras.
100
7-ENSAIO IN SILICO DOS CONSTITUINTES ISOLADOS DO
GÊNERO PLECTRANTHUS
A Química Medicinal tem evoluído significativamente nas duas décadas como resultado dos avanços científicos e tecnológicos notáveis no processo de descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (ANDRICOPULO & MONTANARI, 2005). Esse processo tem sido um grande desafio para indústria farmacêutica moderna, pois é um processo longo, complexo, de alto custo e elevado risco (BERNDT et al., 2005).
Os modelos tradicionais de desenvolvimento de fármacos, baseados principalmente em química e biologia básica, estão sendo progressivamente substituídos pela integração de especialidades que atuam em caráter multidisciplinar (MODA, 2007). Assim, os estudos interdisciplinares que aliam interação entre a química e a farmacologia, como a avaliação das relações estrutura-atividade e das interações entre compostos bioativos e receptor, combinados à realização de estudos farmacocinéticos e toxicológicos, experimentais e in silico (via computacional), se apresentam como ferramentas úteis que favorecem a obtenção de novos compostos a partir de estruturas químicas protótipo (ARROIO et al., 2010).
A necessidade de novas substâncias terapêuticas mais eficazes, com baixa toxicidade e maior especificidade tem levado a indústria farmacêutica e pesquisadores a intensificarem esses estudos para a descoberta de novos fármacos (BARREIRO, 2009). As plantas medicinais apresentam uma importância histórica na terapêutica de diversas enfermidades sendo utilizadas na forma de matérias-primas em fármacos ou como substâncias ativas isoladas sendo potenciais fontes de protótipos de fármacos.
Visando a obtenção de novos fármacos a partir de estruturas químicas protótipo cálculos computacionais foram realizados, após a revisão bibliográfica dos constituintes isolados do gênero Plectranthus, utilizando os programas molinspiration (www.molinspiration.com) e GOLD 5.1.0 (COLE et al., 2005) para a determinação dos parâmetros físico-químicos (estudos farmacocinéticos) e para prever conformações de um complexo teórico (interações entre compostos e os receptores) e como elas se relacionam com suas atividades anti-malárica, antitumoral e anti-inflamatória.
101 7.1-Materiais e Métodos
Banco de Dados
Duzentos e setenta (270) compostos isolados de 40 espécies de Plectranthus foram identificados através de uma pesquisa utilizando a ferramenta de busca
Scopus.com utilizando como palavra-chave “Plectranthus”.
As estruturas moleculares em 3D foram obtidas usando o pacote Marvin 5.2.1_1 (MARVIN, 2015). As estruturas moleculares foram minimizadas energeticamente usando um campo de força MMFF94x e exportados em formato MOL2 usando Molecular Operating Environment (MOE) versão 2014.1.
Geração in silico dos descritores moleculares
O potencial dos compostos isolados de Plectranthus spp. como candidatos a fármacos foram analisados com aplicação da Regra dos cinco de Lipinski (Lipinski, 2004), através do emprego dos programas computacionais Molinspiration (www.molinspiration.com) e MOE versão 2014, determinando-se valores de vários descritores como a área de superfície polar (PSA), peso molecular, Log P (partição de uma substância entre as fases aquosa e orgânica no sistema água/octanol), número de grupos aceptores e doadores de ligação de hidrogênio (nON e nOHNH, respectivamente) e solubilidade. A solubilidade (log S) foi calculada pelo emprego do programa Virtual Computational Chemistry Laboratory (www.vcclab.org) e MOE.
Preparação de proteínas e ligantes
As estruturas cristalográficas foram obtidas a partir do Protein Data Bank RCSB. Inibidores cristalizados, moléculas de água e outras moléculas coordenadas foram removidas. Os resíduos e os ligantes foram protonados (pH = 7,0) usando o algoritmo protonar 3D dentro do programa Molecular Operating Environment (MOE) (MOE, 2014). Empregou-se o modelo rígido para as estruturas das proteínas utilizadas.
Protocolo Virtual
A triagem virtual baseada no docking molecular foi realizada com o software GOLD 5.1.0 (COLE et al., 2005), usando as opções default, a função GoldScore como critério de pontuação e 5 poses por estrutura molecular foram armazenados para posterior análise. O algoritmo de acoplamento foi fixado em interações de 100 corridas por cada ligante. Para a validação do ensaio, os ligantes de todas as estruturas
102
cristalográficas obtidas do PDB, foram removidos e re-docados nas estruturas das proteínas, segundo as condições citadas anteriormente e comparação com os dados relatados de pontuação de energia. O ensaio foi considerado adequado para valores de RMSD <1,00 A °.
O estudo da atividade antimalárica foi realizado utilizando a estrutura de raios-X do complexo de citocromo bc1 bovino (código PDB: 4D6T) no sítio de ligação Qi (CAPPER et al., 2015) e empregando um modelo de homologia do complexo citocromo
bc1 da Saccharomyces cerevisiae desenvolvido com base em estruturas de raios-X para
o sítio de ligação Qo (CARRASCO, 2014). Quatro resíduos de aminoácidos foram designados para este estudo: Asp228 e Ser35 para docking no sítio de ligação Qi e Glu261 e His91 para docking no sítio de ligação Qo.
Para os ensaios de atividade anti-inflamatória, o screening virtual foi realizado para COX-1 (código PDB: 1HTX) e COX-2 (código PDB: 1CX2). Dois resíduos de aminoácidos foram selecionados Glu140 e Tyr242 para COX-1, e o resíduo Ser353 para