As análises foram realizadas em parceria com a Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra, do Departamento de Biofísica e Farmacologia da UFRN e com o auxílio da mestranda Valéria Costa.
4.9.1 Ensaio da enzima mieloperoxidase (MPO) a partir dos modelos de edema de pata induzido por carragenina e bolsa de ar induzido por zimosam
No modelo de edema de pata induzido por carragenina, após a eutanásia dos animais, as patas direitas posteriores foram coletadas para a quantificação da enzima MPO segundo procedimento descrito por Bradley (1982), com algumas modificações. Os tecidos foram pesados, triturados e homogeneizados em tampão brometo de hexadeciltrimetilamônio 0,5% em tampão (1 mL de tampão para cada 50 mg de tecido). Em seguida, os tecidos foram sonicados (Sonic-Tech, São Paulo, Brasil) em banho de gelo por 3 min e submetidos a três ciclos de congelamento-descongelamento, seguidos de 3 minutos de sonicação para extração de MPO. Posteriormente, os tecidos foram centrifugados a 10.000 g durante 10 minutos a 4 °C e do sobrenadante foi coletado 20 µL e misturados com 200 μL de tampão fosfato de potássio 50 mM a pH 6,0 contendo 0,0005 % peróxido de hidrogênio e 0,167 mg/mL o- dianisidina. A mensuração da atividade foi realizada a 460 nm em leitora de microplacas (Epoch-Biotek, Winooski, VT, EUA). As patas esquerdas do grupo controle (que não receberam nenhuma tipo de tratamento) foram utilizadas como controle (valor basal). Uma unidade de MPO foi definida como o equivalente ao consumo de 1 μmol de peróxido de hidrogênio por minuto e 1 μmol de peróxido de hidrogênio fornece uma mudança de absorbância de 1,13 × 102 (DO/min) (POSADAS et al., 2004). Os resultados foram expressos como unidade de atividade de MPO por grama de tecido da pata (UMPO/g).
Para a quantificação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam, o exsudato (100 µL) foi coletado e suspenso em solução tampão de brometo de hxadeciltrimetilamônio (HTAB) 0,5%, pH 6.0, na proporção de 1:20 (p/v). Em seguida, as amostras foram então sonicadas (Sonic-Tech, São Paulo, Brasil) e submetidas a três ciclos de congelamento-descongelamento. O homogeneizado foi centrifugado e o sobrenadante obtido foi utilizado para o ensaio de MPO. A reação da enzima MPO com o reagente cromogênico (o-dianisidina, tampão fosfato e peróxido de hidrogênio) resulta na formação de um cromóforo que possui uma absorbância máxima a 450 nm.
A atividade de MPO foi determinada por interpolação em uma curva padrão, construída a partir dos dados obtidos da atividade da enzima MPO em neutrófilos humanos. Levando em consideração que uma unidade de MPO (U) degrada 1 nmol min− 1 de peróxido de hidrogênio a 25 °C, os resultados foram expressos como U/g de tecido.
4.9.2 Ensaio de malondialdeído (MDA) dos exsudatos da bolsa de ar
A concentração do MDA foi determinada de acordo com o ensaio descrito por Esterbauer e Cheseman (1990), com pequenas modificações. As amostras de exsudato da bolsa de ar foram coletadas e homogeneizadas durante 2 min com um homogeneizador automático e em seguida foram centrifugadas a 2500 g durante 10 min a 4 °C. Posteriormente, foi transferido 300 µL do sobrenadante para um eppendorf e adicionado750 μL do reativo cromogênico (1-metil-2-fenilindol 10,3 mM em acetonitrila 3:1) e 225μl de HCl (37%). As amostras foram incubadas em banho maria em temperatura não superior a 45 °C. Foram arrefecidas e novamente centrifugadas a 2500 g durante 10 min a 4 °C. Por fim, os sobrenadantes foram transferidos para uma placa de 96 poços e determinada a absorbância a 586 nm através de um leitor de ELISA. Os resultados foram expressos em nanomols de MDA por mL do exsudato (nmol/mL).
4.9.3 Determinação de proteínas totais dos exsudatos da bolsa de ar
A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o ensaio descrito previamente por Bradford e colaboradores (1976), com pequenas modificações. Do exsudato da bolsa de ar, foi coletado 10 µL e transferido para uma placa de 96 poços e em seguida foi adicionado 200 µL do reagente de Bradford e feita a leitura num leitor de microplacas ELISA (BioTek®, Winooski, VT, EUA) a 595 nm. Os resultados foram expressos em µg/mL.
4.9.4 Quantificação das citocinas TNF-α e IL-10 dos exsudatos da bolsa de ar
As amostras de exsudato da bolsa de ar foram coletadas para a quantificação de citocinas. Para os ensaios foram utilizados kits comerciais de ensaio de imunoenzimática ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN, EUA), com anticorpos específicos para cada citocina, de acordo com o protocolo do fabricante. Os resultados foram obtidos usando um leitor de microplaca de ELISA (Epoch, BioTek®, Winooski, VT, EUA) a 450 nm.
4.9.5 Contagem de leucócitos nos exsudatos da bolsa de ar
As amostras de exsudato da bolsa de ar foram coletadas, diluídas em 1 mL de PBS, centrifugadas e uma alíquota (20µL) do sobrenadante foi utilizada para a preparação das lâminas que foram coradas com corante panótico rápido (LaborClin; Brasil). Em seguida, as lâminas foram analisadas utilizando um microscópio óptico (Nikon ECLIPSE E200®, Minato, Tóquio, Japão), através da objetiva de imersão, com aumento de 100 vezes. A contagem de células mononucleares foi determinada com base na contagem de 100 células utilizando um hemocitômetro. Os valores foram expressos como contagens de leucócitos por mL.
4.9.6 Ensaio de inibição de óxido nítrico (NO) in vitro
A avaliação do efeito dos EH das folhas e das cascas do caule na inibição de NO foi realizada segundo o método descrito por Jung e colaboradores (2010), com pequenas modificações. Uma linhagem celular de macrófagos murino (RAW 264.7) (3 x 105 células/poço) foi cultivada numa placa de 24 poços e expostas a 2 µg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) e extratos nas concentrações de 1, 10, 100, 200 µg/mL e incubadas por 24 horas numa atmosfera umidificada, a 37 °C com 5% de CO2. Após a incubação, a
quantidade de NO nos sobrenadantes (100 µL/poço) foi quantificada com a adição de 100 µL de reagente de Griess. Após 10 minutos foi feita a leitura num leitor de microplacas a 540 nm. O nitrito de sódio foi utilizado como padrão e os resultados foram expressos como a porcentagem de NO liberada por RAW 264 na presença das amostras em comparação com o controle positivo (células tratadas apenas com LPS).