A identificação e a elucidação das substâncias isoladas foram obtidas por análises espectroscópicas e espectrométricas.
As análises espectroscópicas e espectrométricas foram realizadas em colaboração com o Prof. Dr. Wagner Vilegas do Laboratório de Bioprospecção de Produtos Naturais (LBPN) da UNESP, com auxílio da doutoranda Ana Zanatta.
4.6.1 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os compostos isolados foram analisados por RMN de 1H 1D e 2D em um equipamento espectrômetro Bruker® (400 MHz). As amostras soram solubilizadas em MeOD (Euriso-top®). Foram obtidos os espectros de RMN de 1H e número de scans foi variável de 8
à 32 a depender da concentração da amostra. Os espectros obtidos foram analisados e comparados com os dados da literatura.
4.6.2 Análise por Espectroscopia de Massas (EM)
Os EH das folhas e das cascas do caule e as substâncias isoladas foram analisados FIA-ESI-IT-MS/MS. Para análise, foi utilizado um Espectrômetro de massas LCQ FLEET (ESI-IT-MSn, Thermo Scientific®), equipado com um dispositivo de injeção direta da amostra via análise por injeção em fluxo contínuo (FIA). Ionização por electrospray (ESI) e analisador do tipo íon-trap (IT). Inicialmente, foi realizada uma varredura completa (full-scan) do espectro de massas para adquirir os dados dos íons na faixa m/z estabelecida. Posteriormente foram realizados experimentos de MS/MS a partir dos dados da primeira varredura para íons precursores pré-selecionados, com energia de colisão de 30 V.
Para obtenção do perfil dos extratos por LC-MS/MS foi utilizado um espectrômetro de massas LC-QTOF HR-ESI (Waters Synapt G2, Manchester, UK). Os espectros de massas foram obtidos no modo positivo e negativo, sendo o modo negativo selecionado. A faixa de trabalho dos íons variaram de m/z de 100−2000 Da. O software XcaliburTM versão 1.3 (Thermo Scientific®) foi utilizado para tratamento dos dados.
Para a preparação das amostras, os extratos foram submetidos a um pré-tratamento em extração de fase sólida por clean up em cartucho SPE C18. Para análise do EH das folhas de C. leptophloeos, 10 mg do extrato foram dissolvidos em 1,5 mL de MeOH/H2O (85:15,
v/v). O cartucho SPE C18 (Chromabond® C18 ec, 500 mg, 3 mL cartucho) foi previamente condicionado com 4,5 mL de MeOH e 4,5 mL de MeOH / água (85:15, v/v). Em seguida, 1 mL da amostra do extrato foi adicionada ao cartucho e eluída com 1,5 mL MeOH/ H2O
(85:15, v/v) seguido de MeOH para a limpeza do cartucho.
Para o EH das cascas do caule de C. leptophloeos, 10 mg do extrato foi dissolvido em MeOH/ H2O (50:50, v/v). O cartucho SPE C18 (Chromabond® C18 ec, 500 mg, 3 mL
cartucho) foi previamente condicionado com 4,5 mL de MeOH e 4,5 mL de MeOH / H2O
(20:80, v/v). Em seguida, 1 mL da amostra do extrato foi adicionada ao cartucho e eluida com 1,5 mL de MeOH/ H2O (20:80, v/v) e 1,5 mL de MeOH/ H2O (50:50, v/v) seguido de MeOH
4.7 VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA AO DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD) E AO DETECTOR EVAPORATIVO DE ESPALHAMENTO DE LUZ (CLAE-ELSD)
As análises obedeceram ao disposto nas resoluções nacionais e internacionais vigentes, abrangendo os parâmetros descritos pela RE Nº 166/2017 e o guia internacional ICH (BRASIL, 2017; ICH, 1996). Pretendeu-se avaliar os parâmetros de seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e robustez (BRASIL, 2017).
A repetibilidade do método foi avaliada utilizando 3 concentrações do padrão isovitexina, a saber: uma concentração baixa (31,25 µg/mL), uma média (125 µg/mL) e uma alta (500 µg/mL). Cada uma das concentrações (em triplicata) foi analisada três vezes, somando no total 9 análises cromatográficas. A avaliação da precisão intermediária foi realizada no mesmo laboratório em 2 dias diferentes.
O EH das folhas foi analisado em um equipamento CLAE JASCO® constituído de bomba quaternária, detector de arranjos de diodos (DAD) e injetor automático. Foi utilizada uma coluna de fase reversa C18 modelo Thermo Scientific® (250 x 4,6 mm d.i.; 5 μm). Inicialmente, foi desenvolvido o método para o EH das folhas e a partir desse método foi realizado o teste de linearidade para o padrão isovitexina.
Foi preparada uma solução estoque do padrão isovitexina com concentração de 1 mg/mL, a partir da qual foi realizada diluição seriada para obtenção de seis soluções nas concentrações de 7,81; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250 e 500 µg/mL. O volume de injeção foi de 10 µL. Para otimização do método, o gradiente de eluição foi constituído de água (solvente A) e metanol (solvente B), ambos acidificados com 0,1% de ácido fórmico. O programa de corrida foi de 30-75% de MeOH em 50 minutos. O fluxo foi mantido constante em 1,0 mL/min e a detecção realizada a 254 e 340 nm com a aquisição de espectros UV na faixa de 190 a 450 nm. As análises foram realizadas em triplicatas.
Para a análise do EH das cascas do caule foi utilizado o mesmo equipamento de CLAE e a mesma coluna como descrito anteriormente. Para a detecção foi utilizado o detector evaporativo de espalhamento de luz (ELSD) da JASCO® modelo ELS-2040/2041.
Inicialmente, foi desenvolvido o método para o EH das cascas do caule e a partir desse método foi realizado o teste de linearidade para o padrão procianidina dimérica do tipo B.
Foi preparada uma solução estoque do padrão procianidina dimérica do tipo B com concentração de 3 mg/mL, a partir da qual foi realizada diluição seriada para obtenção de cinco soluções nas concentrações de 250; 500; 1000; 1250 e 1500 µg/mL.
O gradiente de fase móvel utilizado foi: água acidificada em ácido fórmico 0,1% (solvente A) acetonitrila (solvente B), com 10-20%, de 0-7 min; 20%, de 7-25 min; 20-60 %,
de 25-45 min. O volume de injeção foi de 10 µL e o ELSD foi operado com temperatura do
drift tube em 40 °C e pressão do gás nebulizador de 3,5 bar. O fluxo foi mantido constante em 1,0 mL/min. As análises foram realizadas em triplicatas.
O software EZChrom Elite 3.1.7 foi utilizado para controle, coleta e processamento dos dados para todas as análises.
4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA/UFRN) pelo parecer de nº 019.026/2017 e está em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).
4.8.1 Animais de experimentação
Foram utilizados para o estudo camundongos albinos Swiss machos e fêmeas, com período de vida de 6 a 8 semanas, pesando em torno de 30 a 35 g, mantidos sob temperatura controlada (22 ± 2 ° C), ciclo claro/escuro de 12/12 horas e com acesso livre a água e comida. Cada grupo foi composto por cinco animais (n = 5). Os animais foram procedentes do Biotério do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRN.
Os experimentos foram realizados em parceria com o Prof. Dr. Matheus Freitas Fernandes Pedrosa, do Departamento de Farmácia da UFRN e com o auxílio das doutorandas Manuela Torres Rêgo e Allanny Furtado.
4.8.2 Modelo de edema de pata induzido por carragenina
O efeito anti-inflamatório do pós-tratamento por via oral (v.o) dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na inflamação aguda foi avaliado conforme o procedimento descrito por Posadas e colaboradores (2004), com algumas modificações. Inicialmente, o edema de pata nos animais foi induzido através de injeção subplantar (s.pl.) de 50 µL de λ-carragenina 1% (500 µg/pata). Após 30 minutos os animais foram tratados por v.o
com 100 µL de solução salina estéril (0,9 mg/mL), dexametasona (0,5 mg/kg) e EH nas doses 100, 200 e 400 mg/kg. O edema foi quantificado por meio da mensuração da espessura individual das patas, através de um paquímetro digital, nos tempos 1, 2, 3 e 4 horas após a injeção do inflamógeno. A resposta edematogênica foi determinada através da diferença entre a espessura da pata depois (nos respectivos tempos) e antes (valores basais) da injeção de carragenina. Ao final dos experimentos, os animais foram eutanasiados com overdose de xilazina e cetamina (10 mg/kg, 100 mg/kg), realizado o descolamento cervical e suas patas foram coletadas para a extração e posterior quantificação da enzima mieloperoxidase (MPO) (marcador quantitativo indireto de migração leucocitária). O edema de pata foi expresso em milímetros (mm) e foi calculado como a porcentagem de edema. A área sob a curva de tempo- curso (AUC0-4 h) também foi determinada usando a regra trapezoidal.
4.8.3 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam
O efeito anti-inflamatório dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na inflamação aguda também foi avaliado usando o modelo de bolsa de ar induzida por zimosam segundo o procedimento de Yoon e colaboradores (2005), com algumas modificações. Inicialmente, foi coletado ar estéril no fluxo laminar em condições assépticas. Em seguida, os animais receberam 5 mL de ar estéril no dorso por via subcutânea, para a formação da bolsa de ar. Após 2 dias, a bolsa já formada, foi reforçada com a injeção de mais 2,5 mL ar estéril no mesmo local. Seis dias após a formação da bolsa de ar inicial, a inflamação foi induzida pela injeção de solução de zimosam dentro da bolsa de ar e logo em seguida receberam pós tratamento por v.o de solução salina estéril (0,9 mg/mL), dexametasona (2,0 mg/kg) e extratos nas doces de 100, 200 e 400 mg/kg. Passadas 6 horas, os animais foram eutanasiados por via intraperitoneal com overdose de xilazina e cetamina (10 mg/kg - 100 mg/kg), realizado o deslocamento cervical e o exsudato da bolsa foi coletado, por aspiração, com 2 mL de solução salina estéril (0,9 mg/mL). As amostras foram centrifugadas numa rotação de 1500 rpm por 10 minutos a 4° C. O pellet celular foi utilizado para contagem total de leucócitos utilizando câmara de Neubauer, diluindo a amostra na solução de Turk. Para isso foram utilizados 10 µL do pellet celular em 90 μL de solução de Turk (VIGIL et al., 2008; YOON et al., 2005). Os resultados foram expressos como número total de leucócitos (106/mL). Posteriormente, também foi realizada a contagem de leucócitos, quantificação de MPO, interleucina IL-10 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) dos exsudato da bolsa de ar.