Análise do Mel de Capixingui

O capixingui, Croton floribundus (Euphorbiaceae), é uma espécie arbustiva com 5 a 10 m de altura e com 15 a 30 m de diâmetro. A copa arredondada e aberta é composta de folhas simples, alternas, com estípulas, elíptico-lanceolados, com 8 a 12 cm de comprimento. A face superior é brilhante com coloração verde-escura quando nova e com tonalidade

vermelho-alaranjada quando mais velha. A face inferior é branca, com pêlos estrelados. Apresentam ambos os lados bem ásperos, como os de uma lixa, de onde vem o nome popular lixeira. Suas flores são amareladas, reunidas em inflorescências de até 30 cm de comprimento e os frutos são cápsulas secas com deiscência explosiva contendo três sementes [97].

Quanto à forma de estudo da composição volátil do mel de capixingui não houve variação se comparado à avaliação das demais amostras de mel do presente trabalho. Esta análise procedeu com uma amostra de mel de flor de capixingui da cidade de Muzambinho, estado de Minas Gerais. Uma vez que esta é a única dessa origem floral a análise da influência intrarregional ficou comprometida, não sendo possível concluir se a composição volátil é característica da espécie ou se sofre influência geográfica. Em relação à caracterização física, este mel possui coloração amarelo esbranquiçada a temperatura ambiente em virtude de uma leve cristalização, contudo mais amarela se comparada a amostras como a de eucalipto e a de marmeleiro de Campo Maior. Além disso, possui viscosidade mais baixa se comparada a méis como os de marmeleiro de Piracuruca.

A observação do cromatograma da amostra de mel de capixingui (figura 15) possibilitou visualizar alguns picos que se destacam, no entanto uma observação mais criteriosa permitiu confirmar a presença de inúmeras coeluições no decorrer da corrida.

Figura 15. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de capixingui, oriunda da cidade de Muzambinho, no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 12.

De forma análoga às demais amostras de outros méis em avaliação, muitos sinais não possuem razão sinal/ruído considerável para serem utilizados como picos cromatográficos já que possuem baixa intensidade de sinal. Assim, ao se analisar a amostra de mel de capixingui por GC-qMS constatou-se uma dificuldade no processo de identificação por tentativa de possíveis compostos que sejam capazes de separar essas amostras das demais.

5.2.5 Análises dos Méis de Café

O cafeeiro é uma planta da família Rubiaceae, duradoura que geralmente alcança dimensões de um arbusto. É produtora de frutos do tipo baga, contudo seu valor econômico é recorrente em suas sementes. Estas, depois de alguns processos são consumidas na forma de infusão. Dotada de flavor característico, a bebida é nutritiva e estimulante [98].

O estudo da composição volátil de mel de café foi realizado com duas amostras de mel de flor de café de duas cidades diferentes. Um dos méis é proveniente da cidade de Santana da Vargem no estado de Minas Gerais, enquanto o outro provém da cidade de São Gabriel da Palha no estado de Espírito Santo. As amostras de mel de café possuem características físicas próprias quando não misturadas a outros méis. A amostra da cidade de Santana possui um tom amarelo claro, um pouco translúcido a temperatura ambiente, enquanto a amostra de São Gabriel da Palha possui coloração mais amarronzada. Outra diferença física entre essas amostras é o fato de a amostra de Santana possuir viscosidade menor que a da amostra de São Gabriel da Palha.

A observação dos cromatogramas das amostras de mel de café possibilitou visualizar o quanto as amostras são semelhantes entre si. A visualização do cromatograma unidimensional de cada umas dessas amostras permitiu observar que a principal diferença entre as elas é dada pela concentração de alguns compostos, isso evidenciado pela intensidade do sinal de alguns picos (figura 16). Outro ponto a ser destacado nos cromatogramas foi a presença de coeluições, em virtude da presença de um número elevado de compostos com propriedades intermoleculares semelhantes. Isso dificultou o processo de identificação por tentativa dos compostos por comparação com biblioteca espectral, já que há a possibilidade de ocorrência de íons de compostos distintos no mesmo intervalo de tempo da aquisição dos dados.

Figura 16. Cromatogramas unidimensionais típicos obtidos para a amostra de mel de florada de café, oriundas de duas cidades distintas.(A) cidade São Gabriel da Palha no estado do Espírito Santo e (B) cidade Santana da Vargem no estado do Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 12.

Assim como em todas as amostras analisadas até aqui há sinais que não possuem intensidade considerável para serem utilizados como picos cromatográficos, já que possuem baixa razão sinal/ruído. Isso disponibilizou um número pequeno de picos que possam ser identificados de maneira tentativa. Assim, ao se analisar as amostras de mel de café por B A

GC-qMS constatou-se dificuldade em identificar possíveis compostos que sejam capazes de separar essas amostras das demais e de separá-las entre si.

5.3 Determinação da composição volátil de méis de diferentes origens por GC×GC-qMS

Após avaliação e escolha de parâmetros ótimos para extração de compostos voláteis de méis por HS-SPME (Tabela 3) foi iniciado o processo de separação e de identificação por tentativa da composição volátil das oito amostras de méis monoflorais não comerciais, de diferentes origens florais e geográficas (Tabela 1) utilizando-se GC-QMS. No entanto, como já discutido nos itens anteriores a ocorrência de forte coeluição prejudicou o processo de identificação tentativa dos compostos.

Como já mencionado, em casos onde a matriz que contem os compostos a serem separados apresenta-se de forma complexa, ou seja, quando compostos com propriedades intermoleculares semelhantes estão presentes numa mesma amostra, a separação cromatográfica adequada (resolução) pode ser prejudicada, interferindo diretamente no processo de identificação.

Desta forma, a cromatografia multidimensional foi utilizada para avaliação da fração volátil de méis e identificação de possíveis marcadores de origem e florada. E de maneira inédita, a GCxGC-qMS foi empregada também no intuito de comparação entre técnicas mono e multidimensional para identificação de compostos que possam ser utilizados como marcas características que atribuam um firgerprinting dos méis comercializados no país. Ainda, estabelecer um procedimento de extração e separação de compostos de méis a fim de se impedir a venda de uma florada em mistura a outros méis de menor valor comercial.

Como partida para a análise multidimensional, os parâmetros de GC- QMS foram utilizados no processo de otimização da modulação de GCxGC. A mesma programação de temperatura foi utilizada e o período de modulação otimizado foi de 6 s empregando 40 % de gás quente e 60 % de gás frio incidindo sobre o final da primeira dimensão do conjunto de colunas utilizadas.

Dessa forma todas as amostras foram injetadas em duplicata gerando 16 cromatogramas bidimensionais, que serão discutidos a seguir em função da origem floral e geográfica de cinco méis de origens florais distintas: marmeleiro, laranjeira, eucalipto, capixingui e café.

5.3.1 Análises dos Méis de Marmeleiro

Além das diferenças físicas observadas entre as amostras de méis de mesma localidade foi possível verificar diferenças quanto à composição volátil das amostras de marmeleiro. A Figura 17 ilustra os cromatogramas bidimensionais típicos para as três amostras avaliadas.

Figura 17. Cromatogramas bidimensionais típicos obtidos para as amostras de florada de marmeleiro oriundas de localidades diferentes no estado do Piauí. (A) região Saco, cidade Piracuruca; (B) região Mororó, cidade Piracuruca; (C) cidade Campo Maior. Em todos os cromatogramas a fração volátil foi amostrada utilizando fibra de SPME DVB/CAR/PDMS 50/30 m. Conjunto de colunas HP 5-MS (30 m × 0,25 mm ×0,25 m)/DB-Wax (1 m × 0,1 mm × 0,1 m); programação de temperatura: 60 °C a 200 °C (3°C/min), 200 °C a 250 °C (10 °C/min); modo de injeção splitless; vazão de 0,6 mL min-1de H2;

Temperatura da fonte de íons de 200 °C, temperatura da Interface 260 °C, potência da fotomultiplicadora de 0,9 kV, Faixa de massa (m/z) de 50 a 380 m/z e tipo de ionização por EI (70 eV), e temperatura de 250 °C no injetor; período de modulação de 6 s e taxa de aquisição de 25 espectros s-1.

O perfil volátil do mel originado do néctar dessas plantas é uma matriz complexa, assim como qualquer outro mel. As amostras de marmeleiro possuem características únicas, fato esse também observado neste trabalho. Estes compostos característicos de uma espécie são de alto valor, permitindo assim avaliar a presença deste tipo de florada em mistura com outros méis. Moreira et al. [20] relatam que determinados compostos como o ácido isovalérico, o ácido benzóico, a γ-decalactona e a vanilina são constituintes base do aroma característico de mel de marmeleiro. No entanto, tais compostos não foram identificados na composição dos méis de florada de marmeleiro quando submetidos à separação por GC×GC-QMS. Porém, a presença do ácido isovalérico foi identificada na amostra de mel de laranjeira e na de eucalipto, o que não é consistente com o reportado pelos mesmos autores [20], e que será discutido posteriormente. Vale destacar, contudo que no presente estudo o composto 1-metil-1H-Pirrol foi identificado em todas as amostras de mel de marmeleiro aqui avaliadas, possibilitando a classificação deste composto como possível marcador para a espécie em questão.

A identificação tentativa da fração volátil das amostras de marmeleiro revelou a presença de 96 compostos comuns entre todas as

amostras (Tabela 1 – Anexo), dos quais 29% ocorreram somente nas amostras oriundas da cidade de Piracuruca, 12% alocaram-se na região de Mororó e 15% na região de Saco com 21% dos compostos sendo encontrados somente na amostra de Campo Maior. Essas diferenças podem ser suportadas no fator genético das plantas de marmeleiros bem como associada à influência da composição do solo, do ar ou da espécie de abelha que polinizou a flor, ou seja, uma influência específica de determinada região [99], assumidas neste trabalho como diferenças geográficas ou intraflorais.

Além das diferenças na composição volátil para o mesmo tipo de mel também foram verificadas diferenças dentro de uma mesma cidade, como no caso dos méis de Piracuruca. Dos 73 compostos encontrados dentro da região 33% (24 compostos) ocorreram somente na fração gasosa da região de Saco (Figura 18), como por exemplo, metoxibenzeno e o (4-Isopropil-2- cicloexen-1-il)metanol. De maneira análoga, 26% dos compostos foram identificados somente na amostra oriunda da região de Mororó (Figura 18), como no caso do 3,3-dimetil-2-Butanamina, 4-metil-2-Pentanamina e do 2- (4-etilenocicloexil)-1-propanol (p-Ment-1(7)-en-9-ol). Compostos como 3- metil-2-Pentanol, (1R,4R)- 1-metil-4-(1-metiletil)-2-Cicloexen-1-ol (p-cis- Ment-2-en-1-ol), 5-Isopropenil-2-metilcicloexanona (p-Ment-8-en-2-ona), 7-metiloct-3-ino e o 3-metilpirrol só foram identificados na amostra da cidade de Campo Maior. No entanto não foi encontrada referência a esses compostos como possíveis marcadores para a espécie estudada.

Figura 18. Composição da fração volátil (em quantidade de compostos voláteis) da cidade de Piracuruca em função da região de produção do mel de marmeleiro.

Assim, há um indicativo de que compostos identificados numa região/localidade em particular possam ser candidatos a marcadores de região, como aqueles encontrados neste estudo (Tabela 1 - Anexo), uma vez que podem ser utilizados na diferenciação de origens geográficas das amostras de marmeleiro analisadas.

5.3.2 Análise do Mel de Laranjeira

O perfil volátil do mel originado do néctar da flor de laranjeira é evidenciado pelo cromatograma bidimensional típico adquirido para a amostra (Figura 19). A amostra de laranjeira possui características únicas, com compostos exclusivos de sua composição volátil, fato também observado neste trabalho. A partir da identificação tentativa para a florada (Anexo I) foi possível observar a ocorrência de compostos característicos somente de laranjeira, o que possibilita inferir a tais compostos de serem possíveis marcadores para a espécie. Nesta linha de avaliação os compostos 3,7-dimetiloctan-1-ol e o 2,6,6-trimetil-1,3-cicloexadien-1-carboxaldeído se sobressaíram como presentes exclusivamente na amostra de laranjeira disponível e assim não sendo identificados nas demais amostras avaliadas

neste trabalho. No entanto, vale destacar, como já relatado, que aqui não se pode avaliar se essa composição distinta é oriunda de uma espécie diferente ou de uma localização geográfica distinta já que só há uma amostra para essa origem floral.

Figura 19. Cromatograma bidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de laranjeira, oriunda da cidade de Botucatu, no estado de São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 17.

A identificação por tentativa da amostra revelou a presença de 75 compostos característicos para este mel (Tabela 1 – Anexo). Antranilato de metila foi encontrado na fração volátil deste mel, corroborando com os resultados descritos por Ferreres et al. [100] e White e Bryant [101], que destacaram esse composto como um possível marcador para méis de laranjeira. Isômeros de aldeído lilálico também ocorreram nesta fração gasosa e junto com antranilato foram igualmente determinados por Pérez et al. [102] em méis de laranjeira. Os mesmos autores reforçam serem estes compostos os responsáveis ainda pelo odor floral do mel de laranjeira. Em avaliação de méis de laranjeira de origem espanhola [7] isômeros de

aldeído lilálico também foram detectados corroborando com os resultados descritos por Serra e Bonvehi [103].

5.3.3 Análise do Mel de Eucalipto

Um perfil cromatográfico bastante distinto dos outros méis aqui avaliados foi verificado para a amostra de eucalipto. O espaço cromatográfico foi mais bem aproveitado se comparado as amostras de marmeleiro.

De maneira análoga ao mel de laranjeira foi possível verificar a presença de compostos de ocorrência única desta florada e, portanto passível de ser utilizado como marcador para a espécie (Tabela 1 – Anexo). Desta forma, compostos como os 1-cloro-2-Propanol, 2-hidróxipropanoato de metila, Hexano- 2,3-diona, 4-Metilexan-3-ol, 1-Sec-butoxibutano, Oct- 1-en-3-ona, Heptan-1-ol, 2-hidroxi-4-metilpentanoato de metila, Propanoato de 2-oxo-3-metilbutila, (5E)-3,6-Dimetiloct-5-en-2-ona, 3,5,5- trimetilcicloex-2-en-1-ona (Isoforone), Ácido octanóico, 3-Metil-1,3,5- pentanotriol, 3,4-dihidroxi-3,4-dimetilexano-2,5-diona, Ácido Nonanóico e 4-(2,2,6-Trimetilciclohexil)-2-butanona ocorreram unicamente na amostra de eucalipto, não sendo identificados nas demais amostras deste trabalho. No entanto, vale ressaltar, como já relatado, que não foi possível avaliar se essa composição diferenciada ocorreu em virtude de ser uma espécie diferente ou de ser de uma localização geográfica distinta, uma vez que só há uma amostra para essa origem floral.

Figura 20. Cromatograma bidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de eucalipto, oriunda da cidade de Rio Claro, no estado de São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 17.

A identificação dos compostos da amostra revelou a presença de 58 compostos característicos para este mel (Tabela A1 – Anexo). Como já exposto alguns compostos se destacaram com possibilidade de uso na separação da amostra de mel de eucalipto das demais amostras do trabalho, ou seja, marcador entre-espécies. Castro-Vázquez et al. [104] sugere que elevadas concentrações de dicetonas e hidroxicetonas são amplamente relacionados à marcadores para méis de eucalipto, sendo que a presença desses mesmos compostos foi verificada neste trabalho com a ocorrência de Hexano- 2,3-diona e 3,4-dihidroxi-3,4-dimetilexano-2,5-diona, compostos observados somente na amostra de mel de eucalipto.

De maneira análoga, ácido nonanóico também ocorreu na amostra de mel de eucalipto, sendo destacado por Piasenzotto et al. [105] como um dos possíveis marcadores de origem floral para este mel.

5.3.4 Análise do Mel de Capixingui

Se comparado aos demais méis o perfil volátil do mel originado do néctar da flor de capixingui é a matriz mais complexa, com perfil volátil evidenciado pelo cromatograma bidimensional típico adquirido para a amostra (Figura 21). A amostra de capixingui possui suas características únicas, possuindo compostos exclusivos de sua composição volátil, como também observado neste trabalho. Com a construção da tabela de identificação (Anexo I) dos compostos presentes na amostra deste trabalho se pôde identificar compostos presentes apenas nessa, sendo, portanto possíveis marcadores para a espécie. Assumindo os valores já relatados para identificação pode-se assinalar compostos como 2,4,5-Trimetil-1,3- dioxolano, 2-hidroxipropanoato de etila, 2-Furanometanol, (3E)Hex-3-en- 1-ol, Octan-3-ol, Benzoato de etila, 3,5,5-trimetil-2-hidroxicicloex-2-en-1- ona, Hexanoato de etila, 3-metilbutanoato de etila (3E)Hexa-3,5-dien-2-ol, Feniletanoato de etila presentes unicamente na amostra de capixingui disponível e não sendo identificados nas demais amostras deste trabalho. Contudo, vale ressaltar que aqui não se pode avaliar se essa composição distinta é oriunda de uma espécie diferente ou de uma localização geográfica distinta.

Figura 21. Cromatograma bidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de capixingui, oriunda da cidade de Muzambinho, no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 17.

A identificação dos compostos da amostra revelou a presença de 74 compostos característicos para este mel (Tabela 1 – Anexo). No entanto o fato de não haver um número considerado de exemplares dessa planta, se comparado a laranjeira, por exemplo, é difícil encontrar exemplares de mel de tal origem floral o que torna difícil encontrar dados na literatura para comparação.