INSTITUTO DE QUÍMICA
JADSON ZENI DOS REIS
DETERMINAÇÃO DE ORIGEM FLORAL E/OU GEOGRÁFICA DE MÉIS POR GC×GC-QMS ASSISTIDA POR FERRAMENTAS QUIMIOMÉTRICAS
CAMPINAS 2016
JADSON ZENI DOS REIS
DETERMINAÇÃO DE ORIGEM FLORAL E/OU GEOGRÁFICA DE MÉIS POR GC×GC-QMS ASSISTIDA POR FERRAMENTAS QUIMIOMÉTRICAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre(a) em Química na área de Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. FABIO AUGUSTO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO JADSON ZENI DOS REIS, E ORIENTADA PELO PROF. DR. FABIO AUGUSTO.
CAMPINAS 2016
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.”
depositada no meu trabalho e oportunidade de fazer parte de seu grupo. Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado e ao Instituto de Química da Universidade de Campinas pela oportunidade de cursar a pós-graduação.
A Embrapa no escopo do Projeto EMBRAPA/FINEP Melbrasil por fornecer amostras.
Aos amigos de trabalho com quem tive a ilustre oportunidade de partilhar momentos de muita riqueza e alegria: Paloma Prata, Gabriela Mogollón, Lucília Vilela, Bruna Toledo e Leandro Wang.
E a três amigas especiais que sempre me ajudaram, tanto em minha pesquisa quanto no dia a dia, a Paula Lima, Soraia Braga e Mayra Furlan.
A minha família que sempre me apoiou nos estudos desde o início, meu pai João Batista, minha mãe Maria do Carmo e minha irmã Mariana, e que mesmo distantes estavam sempre presentes na minha vida.
E em especial a uma pessoa incrível, sem a qual eu não seria capaz de realizar o mestrado, que sempre me incentivou a buscar mais, a minha namorada Thamires.
de origem floral de méis, ou seja, a análise do pólen presente no mel. No entanto a identificação de compostos voláteis específicos obtidos a partir do próprio mel tem sido uma saída para a classificação deste produto, o que agrega alto ganho de valor a esse produto alimentício. Neste cenário, a análise do mel utilizando apenas uma técnica analítica é por vezes inviável devido à complexidade química dos méis bem como a faixa de concentração desses compostos específicos da florada de origem. Desta forma, o trabalho utilizou a combinação de HS-SPME (Microextração em Fase Sólida) aliada à técnica GC×GC-qMS para a obtenção do perfil metabólico volátil de oito amostras de mel de diferentes origens florais e/ou geográficas, isso na busca por compostos que possam ser utilizados na diferenciação das amostras de méis. Além disso, empregou-se a técnica de GC-TqMS(SRM) a fim de possibilitar a confirmação da identidade de compostos inicialmente identificados por meio da técnica de GC×GC-qMS. A otimização da etapa de extração foi realizada por meio de um planejamento experimental Doehlert sendo utilizadas quatro variáveis, sendo estas: concentração de solução salina, tempo de extração, temperatura de extração e volume de solução salina adicionado. Tudo isso na busca por um método rápido de classificação da origem floral e/ou geográfica de alguns méis. Sendo que foram encontrados possíveis compostos capazes de diferenciar exemplares de mel tanto por origem floral quanto geográfica.
identification of the honey, so the analysis of the pollen present in the honey. However the identifying specifics volatiles compounds obtained from honey itself has been an outlet for the classification of this product, which combines high gain value to that food product. In this scenario, analysis of the honey only using an analytical technique is sometimes not feasible due to the chemical complexity of the honey and the concentration range of these specific compounds of flowering source. Thus, the study used a combination of HS-SPME (Solid Phase Microextraction) coupled to the technique GC x GC-qMS (Comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled to Spectrometry quadrupole mass) to obtain the volatile metabolic profile of eight samples of honey from different floral origin and / or geographical, this to the search for compounds that may be used in the differentiation of honey samples. In addition, it used the GC-TqMs technique (SRM) (gas chromatography-spectrometry Triploquadrupolar pasta in Selected Reaction Monitoring mode) to enable confirmation of the identity of compounds initially identified by the technique of GCxGC-qMS. The optimization of the extraction step was performed through a Doehlert experimental design used with four variables, which are: brine concentration, extraction time, the extraction temperature and volume of added salt solution. All this in the search for a quick method of classification of floral origin and / or geographical some honeys. Since found possible compounds able to differentiate both copies honey floral as geographical origin.
Figura 1: Esquema de dispositivo de SPME. (A) Fibra retraída e (B) Fibra exposta...42 Figura 2. Principais modos de extração em SPME. Adaptado de Valente e Augusto200...43 Figura 3. Natureza multidimensional dos dados gerados a partir de GC-MS...49 Figura 4. Comparativo das capacidades de pico (n) entre as técnicas
MDGC [n1 + (n2×y)] e GC×GC
(n1×n2)...51 Figura 5. Diagrama geral do sistema de cromatografia gasosa bidimensional abrangente. (1) Coluna capilar de GC convencional, referente a primeira dimensão (¹D) da técnica; (2) Modulador e (3) Coluna capilar de dimensões reduzidas, referente a segunda dimensão da técnica (²D)...53 Figura 6. Processo de modulação em (A) e (B) coleta e reconcentração de bandas pela incidência de jatos de ar frio no início da ²D, (C) processo de remobilização do analito na ²D, (D) importância da interface (modulador) em GC×GC. Ilustração da resolução de bandas coeluídas na ¹D e separadas em picos estreitos e intensos após modulação. Modificado de Mondello et al. 2008...54 Figura 7. Ilustração do processo geral de resolução de picos por GC×GC e como a interpretação da estruturação cromatográfica pode ser obtida através de inspeção visual dos cromatogramas em gráficos bi e tridimensionais. (A) cromatograma de um pico coeluido no final da ¹D. (B) Processo de modulação e (C) Cromatograma bruto na saída da ²D. Modificado de Dallüge et al. 2003...55
Figura 9. Cromatograma típico de GC-FID obtido para a extração da mistura de méis por HS-SPME...71 Figura 10. Gráfico de Pareto do planejamento experimental Doehlert desenvolvido para otimizar as condições de extração por HS-SPME de amostras de mel, no qual (L) representa os codificadores lineares e (Q) os codificadores quadráticos...73 Figura 11. Superfícies de resposta, geradas a partir do planejamento experimental Doelhert para o processo de extração de méis. (A) concentração de NaCl (mol/L)x temperatura de extração (°C) da mistura de méis e (B) tempo de extração (min) x volume de solução salina (ml)...74 Figura 12. Cromatogramas unidimensionais típicos obtidos para as amostras de florada de marmeleiro oriundas de localidades diferentes no estado do Piauí. (A) região Saco, cidade Piracuruca; (B) região Mororó, cidade Piracuruca; (C) cidade Campo Maior. Em todos os cromatogramas a fração volátil foi amostrada utilizando fibra de SPME DVB/CAR/PDMS 50/30 m. HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm, 5 % fenilmetilsiloxano) programação de temperatura: 60 °C a 200 °C (3°C/min), 200 °C a 250 °C (10 °C/min); modo de injeção splitless; vazão de 1 mL min-1de H2;
temperatura do injetor e detector a 250 °C e 200 °C, respectivamente; taxa de aquisição de 5 espectros s-1...79 Figura 13. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de laranjeira, oriunda da cidade de Botucatu, no estado de São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 12...82
São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 12...84 Figura 15. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de capixingui, oriunda da cidade de Muzambinho, no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 12....86 Figura 16. Cromatogramas unidimensionais típicos obtidos para a amostra de mel de florada de café, oriundas de duas cidades distintas. (A) cidade São Gabriel da Palha no estado do Espírito Santo e (B) cidade Santana da Vargem no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 12...88 Figura 17. Cromatogramas bidimensionais típicos obtidos para as amostras de florada de marmeleiro oriundas de localidades diferentes no estado do Piauí. (A) região Saco, cidade Piracuruca; (B) região Mororó, cidade Piracuruca; (C) cidade Campo Maior. Em todos os cromatogramas a fração volátil foi amostrada utilizando fibra de SPME DVB/CAR/PDMS 50/30
m. Conjunto de colunas HP 5-MS (30 m × 0,25 mm ×0,25 m)/DB-Wax (1 m × 0,1 mm × 0,1 m); programação de temperatura: 60 °C a 200 °C (3°C/min), 200 °C a 250 °C (10 °C/min); modo de injeção splitless; vazão de 0,6 mL min-1de H2; temperatura do injetor e detector a 250 °C e 200 °C,
respectivamente; período de modulação de 6 s e taxa de aquisição de 25 espectros s-1...90 Figura 18. Composição da fração volátil (em quantidade de compostos voláteis) da cidade de Piracuruca em função da região de produção do mel de marmeleiro...94 Figura 19. Cromatograma bidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de laranjeira, oriunda da cidade de Botucatu, no estado de São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 17 ...95
São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 17...97 Figura 21. Cromatograma bidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de capixingui, oriunda da cidade de Muzambinho, no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 17..99 Figura 22. Cromatogramas bidimensionais típicos obtidos para a amostra de mel de florada de café, oriundas de duas cidades distintas. (A) cidade São Gabriel da Palha no estado do Espírito Santo e (B) cidade Santana da Vargem no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 17...100 Figura 23. Cromatogramas unidimensionais obtidos para as amostras de florada de marmeleiro oriundas de localidades diferentes no estado do Piauí. (A) região Saco, cidade Piracuruca; (B) região Mororó, cidade Piracuruca; (C) cidade Campo Maior. Em todos os cromatogramas a fração volátil foi amostrada utilizando fibra de SPME DVB/CAR/PDMS 50/30
m. HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm, 5 % fenilmetilsiloxano) programação de temperatura: 60 °C a 180 °C (3°C/min), 180 °C a 250 °C (10 °C/min), 260 °C durante 5 min; modo de injeção splitless; vazão de 1 mL min-1de H2; temperatura do injetor e detector a 250 °C e 200 °C,
respectivamente; taxa de aquisição de 5 espectros s-1. Monitoramento no modo SRM da transição 81 m/z > 53 m/z...104 Figura 24. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de marmeleiro da região de Saco, oriunda da cidade de Piracuruca, no estado de Piauí. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 108 m/z > 78 m/z...106
Piracuruca, no estado de Piauí. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 154 m/z > 93 m/z...107 Figura 26. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de marmeleiro da região de Mororó, oriunda da cidade de Piracuruca, no estado de Piauí. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 101 m/z > 44 m/z...108 Figura 27. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de marmeleiro da região de Mororó, oriunda da cidade de Piracuruca, no estado de Piauí. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 154 m/z > 93 m/z...109 Figura 28. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de marmeleiro oriunda da cidade de Campo Maior, no estado de Piauí. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 152 m/z > 95 m/z...110 Figura 29. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de marmeleiro oriunda da cidade de Campo Maior, no estado de Piauí. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 124 m/z > 67 m/z...111 Figura 30. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de laranjeira oriunda da cidade de Botucatu, no estado de São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 151 m/z > 119 m/z...112
São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 158 m/z > 60 m/z...113 Figura 32. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de eucalipto oriunda da cidade de Rio Claro, no estado de São Paulo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 114 m/z > 43 m/z...114 Figura 33. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de capixingui oriunda da cidade de Muzambinho, no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 118 m/z > 45 m/z...115 Figura 34. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de capixingui oriunda da cidade de Muzambinho, no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 150 m/z > 95 m/z...116 Figura 35. Cromatogramas unidimensionais típicos obtidos para a amostra de mel de florada de café, oriundas de duas cidades distintas. (A) cidade São Gabriel da Palha no estado do Espírito Santo e (B) cidade Santana da Vargem no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 106 m/z > 91 m/z...117 Figura 36. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de café oriunda da cidade de São Gabriel da Palha, no estado do Espírito Santo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura
Figura 37. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de café oriunda da cidade de São Gabriel da Palha, no estado do Espírito Santo. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 104 m/z > 43 m/z...120 Figura 38. Cromatograma unidimensional típico obtido para a amostra de mel de florada de café oriunda da cidade de Santana da Vargem, no estado de Minas Gerais. Condições cromatográficas idênticas às da Figura 23, com exceção da transição monitorada, neste caso 142 m/z > 57 m/z...121
Tabela 1. Origem floral e geográfica das amostras de mel...59 Tabela 2. Planejamento Doehlert com quatro variáveis contendo os valores codificados e experimentais ...62 Tabela 3. Parâmetros experimentais selecionados para extração de mel por HS-SPME...77
¹D: primeira dimensão
¹tR: tempo de retenção na primeira dimensão
²D: segunda dimensão
²tR: tempo de retenção na segunda dimensão
BBD: Box-Behnken Design CCD: Central Composite Design CE: Eletroforese Capilar
CE-MS: Eletroforese Capilar acoplada à Espectrometria de Massas DB-Wax: coluna capilar contendo fase estacionária de polietilenoglicol DOE: Design of Experiments
DVB/CAR/PDMS: fibra de SPME contendo recobrimento divinilbenzeno, carboxeno e polidimetilsiloxano
GC: Cromatografia Gasosa
GC×GC: Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente
GC-FID: Cromatografia Gasosa com detecção por Ionização em Chama GC-MS: Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
GC×GC-qMS: Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada à Espectrometria de Massas Quadrupolar
GC-TqMS: Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas Triploquadrupolar
polidimetilsiloxano
HS-SPME: Microextração em Fase Sólida por Headspace Kfs: constante de distribuição
LC: Cromatografia Líquida
LC-MS: Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas LLE: Extração líquido-líquido
LTPRI: Índice de Retenção com Programação Linear de Temperatura m/z: razão massa-carga
Matlab: Matrix Laboratory
MDGC: Cromatografia Gasosa Multidimensional por Frações Parciais MS: Espectrometria de Massas
n: capacidade de pico
n1: capacidade de pico na primeira dimensão
n2: capacidade de pico na segunda dimensão
NMR: Ressonância Magnética Nuclear PM: período de Modulação
rpm: rotações por minuto SPE: Extração em Fase Sólida SRM: Selected reaction monitoring wb: largura de pico
1 INTRODUÇÃO ...22
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...31
2.1 Mel ...32
2.1.1 Abordagem geral do mel ...32
2.1.2 Conjuntura brasileira ...33
2.1.3 Métodos empregados para a caracterização de méis...34
2.1.3.1 Métodos gerais ...34
2.1.3.2 Análise de compostos voláteis ...38
2.2 Preparo de amostras ...39
2.2.1 Abordagem geral ...39
2.2.2 Microextração em Fase Sólida (SPME)...40
2.3 Planejamento experimental ...45
2.3.1 Planejamento Doehlert ...45
2.4 Instrumentação Analítica ...47
2.4.1 Cromatografia Gasosa ...48
2.4.2 Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) ...50
3 Objetivos.. ...56
3.1 Geral...57
3.2 Específicos ...57
4 MATERIAIS E MÉTODOS. ...58
4.1.2 Sistema GC-FID ...59
4.1.3 Sistema GCxGC -qMS ...59
4.1.4 Sistema GC-TqMS ...60
4.1.5 Dispositivos de Extração ...60
4.1.6 Programas computacionais e hardware...60
4.2 MÉTODOS...61
4.2.1 Método de extração...61
4.2.2 Condições operacionais do GC-FID ...64
4.2.3 Condições operacionais do GC-qMS ...65
4.2.4 Condições operacionais do GCxGC-qMS ...66
4.2.5 Condições operacionais do GC-TqMS ...67
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...69
5.1 Avaliação do planejamento experimental ...70
5.1.1 Construção do modelo quimiométrico e determinação das condições ótimas de extração de compostos voláteis de mel ...72
5.2 Determinação da composição volátil de méis de diferentes origens por GC-qMS ...77
5.2.1 Análises dos Méis de Marmeleiro ...77
5.2.2 Análise do Mel de Laranjeira ...80
5.2.3 Análise do Mel de Eucalipto ...82
5.3 Determinação da composição volátil de méis de diferentes origens por
GCxGC-qMS ...89
5.3.1 Análises dos Méis de Marmeleiro ...90
5.3.2 Análise do Mel de Laranjeira ...94
5.3.3 Análise do Mel de Eucalipto ...96
5.3.4 Análise do Mel de Capixingui ...98
5.3.5 Análises dos Méis de Café ...99
5.4 Confirmação da identificação de possíveis marcadores por GC-MS/MS ...102
5.4.1 Análises dos Méis de Marmeleiro ...103
5.4.1.1 Mel de Marmeleiro da região de Saco ...105
5.4.1.2 Mel de Marmeleiro da região de Mororó ...108
5.4.1.3 Mel de Marmeleiro de Campo Maior ...109
5.4.2 Análises dos Mel de Laranjeira ...111
5.4.3 Análises dos Mel de Eucalipto ...113
5.4.4 Análises dos Mel de Capixingui ...115
5.4.5 Análises dos Méis de Café ...117
5.4.5.1 Mel de Café de São Gabriel da Palha ...118
5.4.5.2 Mel de Café de Santana da Vargem ...120
6 CONCLUSÕES ...122
O mel, produto alimentício gerado a partir do néctar das flores e obtido por meio da secreção de abelhas, ou seja, exudados sacaríneos é um produto de grande importância socioeconômica. É um exudado com elevado teor de açúcares de composição complexa contendo outros carboidratos, aminoácidos, enzimas, ácidos orgânicos, minerais, substâncias aromáticas, pigmentos e grãos de pólen [1,2]. É ainda classificado como um produto de origem natural construído por abelhas a partir de exsudatos sacaríneos de plantas e/ou do néctar de flores (CNNPA, Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos) [3].
O mel de origem floral, tema do presente trabalho, pode ser classificado em duas grandes categorias, como unifloral ou monofloral, quando o produto gerado é constituído de no mínimo 45% de flores de uma família, gênero ou espécie possuindo características sensoriais, físico-químicas e microscópicas próprias; e multifloral ou polifloral, quando o mel é obtido a partir de diferentes origens florais [4,5].
Desta forma, o mel é uma das misturas de carboidratos mais complexa encontrada na natureza [6] e de elevada constituição energética. Além disso, ainda possui propriedades nutritivas importantes que refletem o seu aroma e sabor [6,7]. De forma análoga a culturas agronômicas, sua composição sofre pressões ambientais, como por exemplo, àquelas relacionadas à formação dos sabores e aromas, que são afetados por plantas, flores e condições climáticas presentes na região geográfica em que se localiza a colmeia [8]. Em geral, os méis brasileiros (80% a 90%) são poliflorais sendo originados em grande parte de flores nativas, florestas secundárias e campos de cultivo, onde no estado de São Paulo destacam-se os méis derivados de plantações de laranja e eucalipto [9].
O mel é um produto natural e seu consumo tem aumentado nos últimos anos. A abordagem tradicional para reconhecer a origem botânica do mel depende de um exame microscópico do seu pólen (Melissopalinologia) [10,7]. A Melissopalinologia também pode ser usada para identificar a origem geográfica de mel se o pólen é suficientemente específico na área de interesse [11]. Contudo, a técnica de Melissopalinologia torna-se um tanto quanto subjetiva uma vez que é dependente da avaliação do analista.
Radovic et al. [12] afirmam que o perfil de um aroma é de suma importância na caracterização de um produto alimentar. Os méis detêm aromas extremamente específicos em virtude da presença de compostos voláteis em sua composição, derivados em sua maioria do néctar de origem [13]. Esse elevado número de compostos voláteis, permite que o perfil do aroma do mel possa ser empregado como um fingerprinting do produto [12], podendo ainda ser utilizado na determinação de sua origem floral e/ou geográfica [12,14]. Alguns destes compostos específicos inerentes aos méis originários são conhecidos como marcadores de origem e podem ser empregados para elucidação da composição de sua fração volátil, sendo conhecidos como marcadores [12,15].
Anklam [10] destaca que a avaliação minuciosa da constituição de voláteis pode ser uma ferramenta importante para caracterização da origem floral auxiliando na compreensão dos fatores que acarretam diferenças de sabores. Bentivega et al. [16] destacam que mais de 400 compostos já foram identificados e descritos em méis de diferentes origens florais, entretanto, ainda é esperado que um grande número de outros compostos seja identificado no futuro.
Diversos são os procedimentos analíticos utilizados nos processos de obtenção e identificação de constituintes de amostras orgânicas de maior
complexidade. Geralmente são empregados procedimentos que envolvem mais de uma etapa sendo a primeira delas o preparo de amostras voltado para a obtenção dos constituintes voláteis, voláteis, polares e não-polares, por métodos como extração dinâmica [17,18], extração em coluna [19,20], extração com solventes [17], e análises melissopalinológicas [21]; e a segunda, voltada para a utilização de metodologias de separação e identificação desta composição química com amplo destaque para a cromatografia gasosa, cromatografia líquida de alta eficiência e a espectrometria de massas.
O estudo sobre a composição de méis e seu benefício não é recente [22] e de maneira geral está associado a plataformas analíticas que melhorem a representatividade dos metabólitos, expandindo a faixa de identificação desses mesmos compostos [19,20]. A diversidade química dos compostos associada à composição de méis requer múltiplas abordagens, que vão desde o preparo de amostra até a utilização de plataformas analíticas mais refinadas e elaboradas utilizadas na separação e identificação destes compostos [23,24]. Uma grande variedade de métodos têm sido utilizados na extração de compostos voláteis e semi-voláteis de méis [25], alguns deles com base na extração com solvente, mas, desde sua implementação, a microextração em fase sólida (Solid Phase Microextraction - SPME) tem sido amplamente utilizada nestes estudos [23,24].
Pawliszyn [26] descreve a técnica de SPME que é muito empregada na extração de compostos orgânicos voláteis de uma variedade de matrizes, como amostras biológicas, ambientais e alimentícias. Baseada no princípio de equilíbrio entre fases, essa técnica emprega um pequeno volume de fase extratora polimérica que é responsável pela extração e concentração dos
analitos de interesse em amostras complexas. Dependendo do tipo do recobrimento polimérico da fibra extratora, a SPME pode envolver os fenômenos de sorção e partição dos analitos entre a amostra e o sorvente [25]. Além de proporcionar a extração dos analitos, a SPME é indispensável quando se trabalha com metabólitos presentes em baixas concentrações uma vez que permite sua pré-concentração, [24], além de ser uma técnica livre do uso de solventes, não-destrutivo, sensível, barato, simples e que promove amostragem rápida e precisa dos resultados [23,24]. O objetivo atual dos procedimentos analíticos para preparo de amostras busca aliar qualidade de extração à pré-concentração dos analitos em estudo, essa preocupação se justifica principalmente na avaliação de matrizes complexas, onde o passo chave é a extração dos compostos, encontrados em baixas concentrações. Desta forma, a escolha de procedimentos que aliem elevado rendimento de extração à pré-concentração é crucial, pois a eficiência desta etapa pode afetar diretamente a obtenção do perfil metabólico representativo de méis em virtude da complexidade de composição desta matriz.
No contexto de buscar elevado rendimento da extração dos voláteis presentes em amostras de mel o uso da técnica de SPME se faz de elevada valia. No entanto, a SPME é dependente de fatores como tempo de extração, quantidade de amostra, entre outros [24]. Tradicionalmente variáveis são estudadas de modo univariado, ou seja, apenas uma variável sofre alteração por vez, enquanto as demais permanecem com valores constantes. Entretanto, essa prática demanda tempo excessivo além de não permitir avaliar a interação entre as variáveis em estudo. A fim de superar esse tipo de problema devem ser empregados métodos quimiométricos que permitam estudar todas as variáveis simultaneamente [27].
A Quimiometria é uma área específica da Química que utiliza métodos matemáticos e estatísticos para extrair o máximo de informações para a interpretação de dados químicos de natureza multivariada [28]. A Quimiometria pode ser separada em duas grandes frentes: a primeira delas está voltada para o estudo e otimização das variáveis experimentais de forma multivariada (DOE, Design of Experiments); a segunda é utilizada para a análise dos dados visando à extração do máximo da informação química relevante por meio de métodos de reconhecimento de padrões, classificação, calibração multivariada, dentre outros [29].
Os métodos de planejamento experimental permitem o estudo multivariado dos fatores que afetam um determinado sistema (método/produto/processo) de forma a quantificar a sua influência em uma resposta de interesse bem como identificar possíveis interações entre os mesmos [30]. O planejamento experimental não visa buscar apenas a simples descrição do experimento, mas sim explicitar a inferência sobre as causas do processo e/ou as relações das condições. Isso permite inferir sobre o que produziu ou contribuiu para tais eventos. Diversas abordagens podem ser empregadas durante o planejamento experimental e de acordo com o objetivo do pesquisador e as variáveis envolvidas podem ser utilizados o planejamento fatorial, o fatorial fracionário, o Doehlert, o composto central (Central Composite Design - CCD), o Box-Behnken (Box-Behnken Design - BBD), entre outros.
O planejamento Doehlert foi sugerido inicialmente na década de 70, em virtude da necessidade de utilização de um menor número de experimentos, sendo essa a principal vantagem quando comparado aos planejamentos do tipo CCD e BBD [31]. O planejamento Doehlert é mais eficiente e permite que a região experimental possa ser deslocada quando a área ótima não foi
atingida, além de permitir avaliar os distintos fatores em diferentes níveis [31]. Estas características tornam o uso do planejamento Doehlert para a otimização de processos um fator de elevada utilidade para laboratórios de analítica.
Uma das técnicas mais utilizadas para a avaliação de perfis voláteis de mel é a cromatografia gasosa (Gas Chromatography - GC) [23,24] essa técnica é de grande valia já que permite elucidar diferentes compostos voláteis por meio de propriedades físico-químicas como a pressão de vapor e interações intermoleculares [32].
No entanto, técnicas de separação convencionais por vezes não são capazes de descrever completamente a composição variável e complexa do mel [23]. Neste sentido, técnicas que fornecem elevada resolução de compostos aliadas a uma estrutura multidimensional podem apresentar-se como determinantes para aquisição da composição de méis de diferentes origens. Assim, uma opção frente a tal problema é o emprego da cromatografia gasosa bidimensional abrangente (Comprehensive two-dimensional gas chromatography - GC×GC).
Desenvolvida em 1991 por Liu e Phillips [33], seu impacto frente à GC unidimensional pode ser comparado ao impacto gerado pela introdução das colunas capilares em relação às empacotadas. A técnica utiliza duas colunas capilares, geralmente consistindo de uma coluna primária (¹D) com dimensões convencionais e uma secundária mais curta e fina (²D), conectadas em série por meio de um dispositivo chamado de modulador. Assim, o eluato oriundo da ¹D é fracionado pelo modulador e é novamente reinjetado na ²D, para que possa ser submetido a uma nova separação. Em GC×GC, a utilização de uma coluna ²D mais curta e eficiente é mandatória, a fim de se garantir que a resolução alcançada na ¹D seja mantida até o final
da corrida cromatográfica. Dessa forma permite-se que espécies co-eluídas na primeira dimensão possam ser separadas na segunda eluição [34,35].
Uma característica importante na cromatografia é o número máximo de picos separáveis, conhecida como capacidade de pico a qual aumenta geometricamente em GC×GC se comparada à GC convencional. Assumindo-se a capacidade de picos da primeira (1D) e da segunda coluna (2D) como, respectivamente, X1 e X2 picos, a capacidade de pico total de um sistema bidimensional será incrementado para X1 × X2 picos.
Dentre as vantagens da técnica de GC×GC frente à GC é possível destacar: (i) maior resolução, (ii) maior capacidade de pico e (iii) ordenamento dos picos em clusters, gerando cromatogramas estruturados. Além do já relatado a possibilidade de hifenação com equipamentos como um espectrômetro de Massas (Mass Spectrometry - MS) permite identificar compostos por meio de comparação espectral em bibliotecas. Isso acaba por tornar a técnica de GC×GC-qMS uma prática rápida e eficiente na identificação do perfil volátil do mel [36].
É importante enfatizar que a análise completa de amostras com elevado grau de complexidade utilizando apenas uma técnica analítica é por vezes inviável devido à magnitude química dos compostos bem como de sua faixa de concentração. Desta forma, o objetivo do trabalho foi empregar a combinação de métodos simples e eficazes de extração e pré-concentração de amostra, como a SPME, aliada a técnica cromatográfica GC×GC-qMS visando o estabelecimento de metodologias analíticas robustas que ampliem e facilitem o estabelecimento de métodos de detecção e identificação de compostos de méis quanto a sua origem floral e/ou geográfica. Neste cenário, o estudo de compostos voláteis e semi-voláteis utilizado como método de identificação de composição poderia
ainda auxiliar no processo de classificação de méis bem como alternativa para adulteração de produtos e sub-produtos de origem melífera.
2.1 Mel
2.1.1 Abordagem geral do mel
O mel é uma das mais complexas misturas de carboidratos produzida pela natureza [6], sendo um alimento energético muito importante pelas suas propriedades nutritivas, pelo seu aroma e sabor [6,7]. Dentre os fatores influentes no flavor do mel vale destacar como principais as plantas, flores e condições climáticas presentes na região geográfica onde está localizada a colmeia [8]. O mel é originado do néctar de flores, esse é um líquido pegajoso e é produzido por glândulas específicas das flores e armazenado nas pétalas. Esse néctar é coletado por abelhas que o irão digerir no próprio trato digestivo e depositar em favos no interior de suas colmeias.
A abelha armazena o néctar coletado em uma estrutura conhecida como papo, esse é capaz de conter até 60 μL de líquidos. Há um destaque quanto a presença de ácidos carboxílicos na composição do mel, isso pois em geral o néctar originário contem o respectivo aldeído em sua composição, e no caso o propenso ambiente oxidante no interior da colmeia promove essa conversão. Nas abelhas, a glândula hipofaringeana produz enzimas que presentes na saliva da abelha possuem a capacidade de degradar glicosídeos e sacarose, esta no caso originando glicose e frutose como produtos. Essa mistura então terá 3 destinos, parte é deslocada para o intestino da abelha e sofre completa digestão para propiciar energia para a sobrevivência da abelha, outra parte sofre o mesmo trato e é usada para hibernação. A parte restante é regurgitada nos favos da colmeia para alimentação das abelhas da colmeia e para maturação [37].
A classificação do mel se estrutura ou em propriedades físicas ou por sua origem. A resolução 89/99 do Mercado Comum do Sul (Mercosul) [1] classifica por sua origem floral (unifloral ou multifloral), pelo processo de como o favo foi obtido (escorrido, prensado ou centrifugado) além de
outras propriedades. O mel de origem floral, foco deste trabalho, é subdividido em duas classes: unifloral ou monofloral, para produtos que procedem primordialmente de flores de uma família, gênero ou espécie e possuem características sensoriais, físico-químicas e microscópicas próprias; e multifloral ou polifloral, quando é obtido a partir de diferentes origens florais.
2.1.2 Conjuntura brasileira
A produção melífera do Brasil, últimos dados encontrados, já era superior a 40 toneladas/ano no ano de 2013 [38]. Já no ano de 2005, há 10 anos, as exportações somaram 14,5 mil toneladas (equivalentes a 18,94 milhões de dólares), sendo que o país é o 5º maior exportador de mel do mundo [39]. A aceitação brasileira quanto ao produto mel é boa em virtude da qualidade deste produto. O acidental cruzamento de abelhas brasileiras com africanas acabou por gerar abelhas mais resistentes a infecções, isso fez com que essas abelhas dispensassem o uso de antibióticos [40]. Além das características das produtoras naturais, o país ainda possui condições climáticas e a diversidade floral que permitem uma produção por todo ano além de uma variedade de flavors.
Marchini [41] afirma que a produção brasileira de mel poderia ser dez vezes maior, mas a necessidade de uma padronização nacional e o aperfeiçoamento das técnicas de produção acabam por travar esse crescimento. Em estudo da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo comprovou que muitos méis brasileiros estão fora dos padrões físico-químicos exigidos pelos padrões brasileiros [42]. A possibilidade de análises mais minuciosas que permitissem identificar os minerais presentes e a origem floral atestaria qualidade e ganho de valor ao produto, além de impossibilitar possíveis tentativas de falsificação uma vez
que a composição e o valor nutritivo de mel dependem principalmente da origem floral.
Outro estudo, agora realizado em 2005 pela Agência Norte-Americana para o Desenvolvimento Internacional (USAID) constatou que a demanda mundial de mel cresce 2,4 % ao ano [43]. Esse fato torna o mercado extremamente propenso a necessidade de investimento no setor melífero com o objetivo de suprir a demanda necessária.
É importante destacar que diversidade da flora apícola brasileira é uma vantagem natural que deveria ser melhor explorada dessa forma tornar-se-ia fundamental conhecer a composição e as qualidades dos produtos obtidos em cada região, a fim de caracterizá-los e determinar padrões. Além disso, considerando o enorme potencial do país para produção do mel orgânico o estabelecimento de normas permitiria uma expansão ao mercado internacional do produto brasileiro, acarretando a um desenvolvimento da apicultura no país [41].
2.1.3 Métodos empregados para a caracterização de méis 2.1.3.1 Métodos gerais
Anklan e Radovic [44] afirmam a inexistência de um único método que proporciona resultados precisos, sendo assim um trabalho de extrema dificuldade a identificação da origem floral. Além da existência de inúmeras fontes florais, a influência climática e regional dificultam o processo de identificação em virtude da oscilação do formato dos grãos de pólen.
Há discussão sobre as possíveis estratégias que podem ser usadas na caracterização de méis. Anklan [10] discute a possibilidade do uso de análise enzimática, análise do produto de fermentação, determinação de
resíduos como hidroximetilfurfural como possíveis análises para a qualidade do mel, mas que não ajudam na identificação da sua origem floral. No entanto, análises como avaliação de flavonóides por Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e análise de alguns perfis composicionais – de ácidos orgânicos alifáticos, aminoácidos e compostos do aroma – pode ser útil para este propósito, em combinação com análise estatística multivariada.
Um estudo realizado por Moreira e De Maria [45] discute a possibilidade do uso do perfil de glicídios como auxiliador à análise microscópica do mel na identificação da origem floral. Vale destacar que em virtude do metabolismo das plantas seria possível ainda usar esse recurso como ajuda na identificação da origem geográfica da flor. De forma mais abrangente Anupama et al. [46] afirma que a cor e o flavor são as principais características que variam com as mudanças geográficas, climáticas e florais. Sendo que esses parâmetros seriam, de acordo com Anupama et al. [46], os mais adequados na avaliação da qualidade do mel.
A técnica clássica de obtenção da origem floral de um mel é por meio da análise do pólen que está presente nas amostras do produto, esta técnica recebe o nome de melissopalinológica [10]. O fato de alguns tipos de méis serem mais apreciados pelo mercado consumidor que outros faz com que a identificação da origem floral do mel seja de extrema importância para a indústria apícola [13], uma vez que essa maior apreciação eleva o preço do produto. Como já relatado a técnica habitual utilizada para esta determinação é a análise melissopalinológica [21,47-49]. Esta técnica está alicerçada no preceito de que flores de diferentes espécies vegetais possuem distintos grãos de pólen. Ao se observar que a origem floral e geográfica do mel é estabelecida por meio da identificação
microscópica e contagem dos grãos de pólen presentes nas amostras, essa técnica tornou-se a mais corriqueira no processo de identificação.
A melissopalinologia é a ciência que associa o tipo de grãos de pólen com as abelhas e com seus produtos, sendo que a técnica se baseia em métodos estabelecidos pela International Commission for Bee Botany [50]. A análise melissopalinológica é utilizada comumente para caracterização e classificação de méis [51]. Esta técnica foi inserida nas práticas brasileiras no de 1961 e até hoje é utilizada na qualificação do mel por cooperativas e associações de apicultores em vários estados [52].
Barth [52] afirma que é possível definir a origem floral de um mel a partir do reconhecimento dos grãos de pólen dominantes, uma vez que suas características morfológicas indicam a espécie floral originária, valendo destacar ainda que a quantidade de determinado pólen pode indicar a qualidade do mel. Isso ocorre pois quando as abelhas coletam o néctar das flores há elevada probabilidade de que os grãos de pólen fiquem aderidos as suas patas e a seu abdômen e dessa forma são transportados até a colmeia, onde são transferidos junto com o néctar até as celas de estocagem para secar e originar o mel.
A análise empregando a técnica de melissopalinologia se baseia em coletar uma amostra de cerca de dez gramas de mel, aquecê-la, homogeneizá-la e diluí-la em água. Algumas gotas dessa solução são então transferidas para uma lâmina e com o auxílio de um microscópio o analista identifica e conta os grãos de pólen de cada espécie encontrada. Normalmente há a contagem de pelo menos 500 grãos (quando possível) e a geração de esquema ou foto de cada tipo polínico encontrado nas amostras. Quando ocorrer o relato de mais de uma espécie do mesmo gênero parte-se para uma visão geral com tipos polínicos, até que ocorra a avaliação correta do nome da espécie.
Na avaliação é realizada a contagem total de pólen encontrado nas amostras de mel. Posteriormente, os tipos polínicos são agrupados em quatro classes de frequência relativa: pólen dominante (mais de 45%); pólen acessório (entre 15 a 44%); pólen isolado importante (entre 3 a 14%); pólen isolado ocasional (menos de 3%). Ramalho et al. [21] descrevem a análise de grãos de pólen como útil para caracterização da origem botânica de méis. Anklan [10] destaca ainda que as análises melissopalinológicas são úteis para determinar a origem geográfica quando se tem plantas que crescem em áreas específicas.
No entanto, esta metodologia é apontada como inconveniente por diversos pesquisadores uma vez que a técnica é dependente da experiência do analista, além disso a técnica ainda requer uma elevada capacidade de discriminação de tipos polínicos para classificação de gênero e espécie [48,49]. Guyot et a. [53] relata ainda outros problemas referentes a técnica clássica, tal como: a quantidade de pólen de uma planta pode variar entre as estações do ano; abelhas podem coletar pólen sem coletar o néctar de plantas (de plantas não nectaríferas); o mel pode ser filtrado antes do processo de embalagem; Além do mais, ainda é possível a adição intencional de grãos de pólen a fim de fraudar uma amostra [10].
Outros caminhos observados para a identificação da origem de um mel são análises físico-químicas e avaliações sensoriais [13]. No entanto, Guyot et al [53] afirmam porém que a identificação da origem do mel apenas por técnicas de análises físico-químicos ou de pólen isoladas não satisfazem no trabalho de determinar a origem floral de um mel. Vale destacar ainda que análises sensoriais são ainda mais subjetivas que a metodologia tradicional. Salva guarda que não existem garantias de que estas classificações definam as propriedades organolépticas do produto que chega ao consumidor final.
2.1.3.2 Análise de compostos voláteis
Radovic et al [12] afirmam que a composição do aroma é característica de suma importância para um produto alimentar. O mel, assim como qualquer outro produto alimentar, possui aroma característico, sendo que é possível destacar a presença de compostos voláteis únicos, esses derivados em sua maioria do néctar da flor de origem [13]. Sendo assim, é possível então identificar a flor de origem por meio dessa composição única de compostos voláteis específicos de cada mel [12,14]. Determinados compostos são específicos de alguns méis com origem floral e/ou geográfica já determinada; o uso destes chamados marcadores é uma possibilidade para a determinação de origem a partir da determinação da composição de sua fração volátil [12,15].
Anklan [10] destaca que ao se fazer uma análise minuciosa da composição volátil do mel os resultados seriam de grande valia na identificação da origem floral desta amostra, além de possibilitar entender melhor os fatores que causam as diferenças dos sabores dos mais distintos méis. Bentivega et al [16] vão mais adiante e expressam que mais de 400 compostos já foram identificados e descritos em méis de diferentes origens florais, mas que no entanto ainda é esperado que um grande número de outros compostos seja identificado no futuro haja vista a variedade floral.
É visto, porém, que os resultados de análises das substâncias dos aromas obtidos dos méis são dependentes da metodologia de isolamento dos tipos de análises de detecção [10]. Diversas são as técnicas, em sua maioria associadas à cromatografia, utilizadas para análise dos compostos voláteis de méis, dentre as quais se pode citar: extração-destilação simultâneas em aparato de Likens-Nickerson [54,55], extração por solventes [56,57], extração em fase sólida [58] e headspace dinâmico [12,48].
As técnicas citadas anteriormente exibem desvantagens, as quais se pode citar a necessidade de grandes quantidades de amostra (15 g a 50 g) e a utilização de solventes extratores como diclorometano [59]. Em contra partida técnicas como a microextração em fase sólida (Solid Phase Microextraction - SPME) se destacam pela pequena quantidade de amostra necessária, além de dispensar o uso de solventes.
2.2 Preparo de Amostra 2.2.1 Abordagem geral
É visto que o tipo de processamento a ser utilizado para a análise da amostra bruta é fundamental já que tem-se como principal função evitar interferências e incompatibilidade com a equipamentos analíticos são requeridas. Logo, é de se supor, que para uma análise química , a utilização de um procedimento adequado de preparo de amostra é de suma importância. Isso permite o isolamento e concentração do(s) analito(s) em avaliação da forma mais correta [60]. Já é de saber comum que técnicas de preparo de amostra devem ser aplicadas principalmente para aumentar a detectabilidade do analito e auxiliar no isolamento do mesmo da matriz da amostra [61].
É recorrente o uso de técnicas de extração líquido-líquido (LLE, Liquid-Liquid Extraction) e extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction) [62] para o preparo de amostra quando se trabalha com bioanalítica. Mesmo quando moderna instrumentação analítica é empregada [63] há a necessidade do uso de técnicas de preparo de amostra, isso se faz necessário em virtude do elevado número de componentes presentes em matrizes biológicas complexas como o mel.
A eficiência de uma extração é dependente do tipo de método utilizado, sendo que no caso de analitos voláteis ainda há a preocupação do
fato desses compostos possuírem entre si variações em suas propriedades físicas e químicas. Uma variedade de métodos pode ser utilizada para extrair e concentrar metabólitos voláteis a partir de uma amostra biológica, o que torna os perfis de voláteis altamente dependentes do método de amostragem e da manipulação das amostras. Há basicamente duas abordagens utilizadas: a amostragem direta de compostos voláteis a partir do headspace (uma pequena dimensão espacial definida) da amostra ou a extração com solvente dos compostos voláteis que a constitui.
O processo de extrair os analitos contidos no headspace de uma amostra é uma técnica livre do uso de solventes. Há duas formas de conduzir esse tipo de análise: (i) o modo estático, no qual os analitos presentes em uma amostra são mantidos em equilíbrio com o seu headspace sendo a quantidade extraída proporcional ao volume da fase gasosa ou ainda (ii) o modo dinâmico, nesse caso um determinado volume de gás, purgado sobre a amostra, arrasta os analitos presentes concentrando-os num material sorvente [26,64].
2.2.2 Microextração em Fase Sólida (SPME)
A busca por menores erros em análises e por menor contato do analista com a amostra nos leva ao uso de técnicas de extração que possuam um menor número de etapas. A etapa de amostragem é parte essencial para o preparo de amostra uma vez que permite representar os analitos alvo presentes. Dessa forma pode-se dizer que é a ligação entre a identidade química dos constituintes de uma matriz química e o instrumental analítico a ser empregado [60].
Uma das técnicas difundidas para o preparo de amostra é a microextração em fase sólida (SPME, Solid-Phase Microextraction), é uma técnica de extração de equilíbrio [63], esta é contrária a outras técnicas de
extração exaustivas que empregam o uso de um grande volume de fase extratora para extração do analito de uma matriz (amostra) tal como a LLE faz. A SPME, desenvolvida nos anos 90[65] é uma técnica de preparo de amostra livre de solvente e que em uma única etapa realiza-se a extração e a limpeza da amostra [66], o que evidencia seu grande potencial no preparo de amostras.
Dentre suas vantagens há destaque por ser uma técnica livre do uso de solventes, não-destrutivo, sensível, barato, simples e que promove amostragem rápida e precisa dos resultados [26]. Assim, a SPME como o nome a prescreve é uma técnica de extração em escala micro no qual os processos de extração e pré-concentração dos analitos emprega uma pequena quantidade de fase extratora (sorvente que pode ser um sólido ou líquido adsorvido) e esse extrai apenas uma pequena porção dos analitos que estão presentes na matriz da sua amostra, mas de maneira representativa de todo o perfil químico presente nela [60]. É por essas características que a SPME tornou-se uma técnica bastante empregada para análise de substâncias voláteis quando se trabalha com amostras de grande complexidade.
O primeiro relato da SPME se deu por Arthur e Pawliszyn, atualmente é uma das técnicas mais difundidas quando o assunto é a extração de compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis de uma variedade de matrizes [67]. A teoria base da técnica se estrutura na cinética de transferência de massa entre fases e na termodinâmica que estabelece o equilíbrio de partição ou adsorção (no caso de recobrimentos sólidos) do analito, entre a fase extratora e o meio que os envolve [60].
A estrutura base para SPME consiste no recobrimento de uma haste de sílica fundida com um fino filme de um polímero, este podendo ser de PDMS ou PA [68,69], sendo ainda possível mesclar utilizando materiais
adsorventes recobertos com polímeros, como DVB/PDMS [66,70]. Essas estruturas são escolhidas em concordância com o tipo da composição da matriz amostral, sendo que estão comercialmente disponíveis [61]. Um esquema de um dispositivo básico de SPME pode ser observado na 1.
(A)
(B)
Figura 1: Esquema de dispositivo de SPME. (A) Fibra retraída e (B) Fibra exposta.
No dispositivo de SPME, além do suporte da fibra, há também uma agulha, que é responsável por proteger o polímero responsável pela extração (em cinza na figura 1 (a) e 1 (b)) [61,68]. O processo de extração se fundamenta na exposição da fibra, recoberta pelo polímero escolhido, à amostra. Vale ressaltar que essa exposição é feita com o controle de tempo e de temperatura pré-determinados. Decorrido o tempo de exposição a fibra é protegida pela agulha e levada ao injetor do cromatógrafo, onde os analitos sorvidos sofrerão o processo de dessorção térmica [68].
Há duas maneiras mais discutidas quando se relata a prática de SPME, mas vale salientar que extração a partir do headspace é a mais encontrada na literatura [61,66,68]. A extração direta se baseia na exposição da fibra diretamente na amostra, enquanto que na do headspace a exposição é realizada na fração gasosa em equilíbrio com a amostra. Há ainda uma terceira forma de extração por SPME, menos discutida, a extração protegida por membrana, no qual a fibra também é mantida em contato direto com a amostra líquida e os analitos da matriz são
diretamente da matriz para o polímero extrator [71]. Os três modos podem ser observados na figura 2.
Figura 2. Principais modos de extração em SPME. Adaptado de Valente e Augusto 2000.60
Em relação aos mecanismos que regem o processo de extração dos analitos na amostra os equilíbrios presentes são baseados em partição caso a fase extratora seja um polímero líquido. Já quando a fase extratora é uma fase misturada, sendo uma das fases um polímero sólido, fala-se em equilíbrios de adsorção [70].
O uso de fibras com recobrimento sólido gera uma competição dos analitos por estes sítios uma vez que há um limitado número de sítios de adsorção [70]. No entanto, o tipo de fase extratora não muda o fato de que as moléculas extraídas sempre iniciam o processo de extração se conectando à superfície [72].
A teoria por trás da técnica se estrutura num processo de extração dos analitos que é governada pela constante de distribuição entre a fase extratora (polímero de recobrimento da fibra de SPME) e o analito de interesse contido na matriz, dada por Kfs. Já que esta constante irá
representar a capacidade de interação do composto pela fase extratora sua estrutura também promoverá a seletividade da extração. Desta forma, a quantidade do analito alvo extraído (n) no equilíbrio pode ser representada pela equação 1 [26] a seguir:
(Equação 1)
onde C0 é a concentração inicial do analito, n é a quantidade de analito
extraído, Vs é o volume da amostra e Vf é o volume da fibra. No entanto,
sob condições negligenciáveis de VfKfs, ou seja, Vs>>VfKfs a quantidade de
analito extraída (n) por SPME é independente do volume da amostra (Vs) e
será dada por (Equação 2) [26]:
(Equação 2)
Assim, sob aspectos termodinâmicos, a quantidade de analito extraída no equilíbrio será função de sua afinidade pela fase extratora. Entretanto, em termos cinéticos é necessário que haja um intervalo de tempo para que o equilíbrio entre as duas fases seja atingido, experimentalmente fundamental e dependente da transferência de massa no sistema [60].
Processos de extração são influenciados por diversas variáveis, um estudo univariado de cada variável influente é o caminho tradicional utilizado em seu estudo. No entanto, um vertente que já vem com destaque em estudos é a abordagem multivariada, essa possibilitada por meio da Quimiometria. De forma simplificada a Quimiometria está dividida em duas frentes: Planejamento experimental e Análise de dados.
2.3. Planejamento experimental
Uma das ferramentas mais importantes no atual desenvolvimento de métodos analíticos é o planejamento de experimentos (Design of Experiment - DOE), esta possibilita a redução de elevada variabilidade de resultados, a redução de tempos de análises além da redução dos custos envolvidos [73]. Diversas aplicações de métodos quimiométricos são descritas na literatura em química analítica, sendo de grande valia em extração uma vez que há vários fatores influentes neste processo.
O planejamento experimental não visa buscar apenas a simples descrição do experimento, mas sim explicitar a inferência sobre as causas do processo e/ou as relações das condições. Isso permite inferir sobre o que produziu ou contribuiu para tais eventos. Vale destacar a existências de variadas abordagens que podem ser empregadas durante o planejamento experimental, sendo que a escolha é determinada de acordo com a necessidade da avaliação. Dessa forma um planejamento pode ser executado usando-se o modelo fatorial, o fatorial fracionário, o Doehlert, o composto central (Central Composite Design - CCD), o Box-Behnken (Box-Behnken Design - BBD), entre outros [74].
Planejamento Doehlert é um tipo de planejamento experimental que é de grande utilização em investigações cujas variáveis que influenciam a resposta já são conhecidas e permite ainda quantificar a extensão desta influência [31].
2.3.1 Planejamento Doehlert
O planejamento Doehlert foi proposto primeiramente na década de 70, a principal vantagem quando comparado aos planejamentos do tipo CCD e BBD é o menor número de experimentos quando há a necessidade
de deslocamento na região de trabalho. Se comparado aos demais modelos, o Doehlert requer um número menor de experimentos para a construção de superfícies de resposta, essa característica o impõe neste quesito como mais eficiente que os demais. Já que a eficiência de um planejamento experimental é definida como o número de coeficientes do modelo estimado dividido pelo número de experimentos [31].
Uma matriz ou planejamento Doehlert é delimitado nos vértices de um hexágono gerado de um simplex regular, sendo que o número total de pontos experimentais o planejamento é igual a k2+k+pc, em que k é o número de fatores e pc é o número de experimentos no ponto central. Isso imprime que o domínio experimental do planejamento Doehlert assume uma forma esférica e uniforme no espaço de trabalho. É importante destacar a necessidade da realização de réplicas no ponto central a fim de validar o modelo pela estimativa da variância experimental. Mesmo que as matrizes não sejam rotacionais nem ortogonais elas não apresentam divergências significativas que comprometam a qualidade necessária para seu efetivo uso.
Outro ponto destacável no planejamento do tipo Doehlert está relacionado ao número de níveis do planejamento, no caso do Doehlert o número de níveis não é idêntico para todas as variáveis. Por exemplo, em um planejamento Doehlert com duas variáveis, uma variável será estudada em 5 níveis enquanto a outra em 3. Essa característica possibilita escolher qual fator ou fatores serão avaliados em um número maior ou menor de níveis. A recomendação dada é a de que variáveis com maior efeito possuam o maior número de níveis, já que isso permitirá obter mais informação a cerca de suas variações no sistema.
No caso do planejamento Doehlert regiões experimentais adjacentes são facilmente explorado pelo ajuste de poucos experimentos o que
promove um menor número de experimentos solicitados para se chegar à região ótima, isso decorre do fato de que o próximo hexágono utiliza pontos experimentais já explorados pelo hexágono anterior.
Cada planejamento Doehlert é definido considerando o número de variáveis e os valores codificados (xi) da matriz experimental. A relação entre os valores codificados e os valores reais é dada pela Equação 3.
(Equação 3)
Neste caso o xi corresponde ao valor codificado para o nível do fator
i; ∆zi é a distância entre o valor experimental no ponto central e o valor
experimental no nível superior ou inferior; zi é o fator que correspondente
ao valor experimental; zi 0
é o valor experimental no ponto central; e α é o maior valor limite codificado na matriz para cada fator (variável ou coluna). É importante destacar que cada variável experimental gerará um valor determinado para α, isso irá ocorrer em acordo com o número de variáveis e com os níveis para cada variável do planejamento [75,76].
2.4 Instrumentação Analítica
O estudo de amostras biológicas imprime a necessidade de técnicas analíticas capazes de caracterizar e determinar uma variedade de classes de compostos químicos [77]. Considerando a necessidade de se obter uma representação metabólica completa, técnicas como a espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry) e a ressonância magnética nuclear (NMR, Nuclear Magnetic Resonance) são as mais amplamente empregadas [78,79].
A prática de hifenação de técnicas têm sido altamente utilizada nos estudos de amostras biológicas [79]. Um elevado número destas ferramentas já é utilizado para aquisição de informações estruturais de difícil resolução, vale destacar que a GC-MS, na detecção de compostos voláteis ou volatilizáveis é a mais utilizada. De maneira análoga, a técnica de LC-MS, na detecção de compostos não-voláteis polares e não-polares recebe destaque perante as demais técnicas [80,81].
A técnica de espectrometria de massas é atualmente uma das mais estabelecida para análise de amostras biológicas, isso em função de sua alta sensibilidade e de sua ampla faixa de cobertura de metabólitos. Vale destacar, que o uso de um espectrômetro de massas permite que tanto análises por infusão direta quanto por meio de separação cromatográfica pode ser empregadas. É importante destacar que a área de atuação da espectrometria de massas aumenta ainda mais quando acoplada a outras técnicas de alto desempenho como a cromatografia gasosa (GC, Gas Chromatography), cromatografia líquida (LC, Liquid Chromatography) e mais recentemente a eletroforese capilar (CE, Capillary Electrophoresis) [82].
2.4.1 Cromatografia Gasosa
A técnica de cromatografia gasosa recebe destaque sempre que a análise envolvida tem por objetivo avaliar o perfil volátil de uma amostra, em especial a hifenação com um espectrômetro de massas (GC-MS). Como técnica multidimensional, a GC aliada à espectrometria de massas proporciona um sistema de expressiva resolução. Isso recorre, pois mais de uma dimensão está adicionada a separação cromatográfica, ou seja, espectros de massas são obtidos em conjunto a análise [83].
Munido dos espectros de massas dos analitos é possível agora proporcionar análises eficientes e reprodutíveis quando se trabalha com elevado número de amostras, uma vez que a identificação não fica mais presa a somente os tempos de retenção (Figura 3) [79,83].
Figura 3. Natureza multidimensional dos dados gerados a partir de GC -MS. No eixo X encontra-se os tempos de retenção referente à separação cromatográfica e no eixo Y os espectros de massas. As intensidades dos sinais encontram-se no eixo Z. Reproduzido de Górecki et al. 2003.81
Uma das técnicas mais utilizadas para a avaliação de perfil volátil de mel é a cromatografia gasosa (GC) [23,24] essa técnica é de grande valia já que permite elucidar diferentes compostos voláteis por meio de propriedades físico-químicas como a pressão de vapor e interações intermoleculares [32].
No entanto, quando o objetivo é a completa resolução dos compostos voláteis de interesse em um tempo mínimo de análise, a GC-MS apresenta limitações [84]. Nos estudos de amostras biológicas, tal como o mel, onde centenas de compostos voláteis estão presentes em uma ampla faixa dinâmica de concentração, a limitação da técnica encontra-se na ocorrência frequente de coeluição dos analitos, mesmo quando a capacidade máxima do sistema é elevada. Esse fato recorre, pois os metabólitos voláteis se apresentam de maneira aleatória, como consequência direta desta resolução
insuficiente tem-se como resultados dificuldades ou erros durante o processo de identificação e quantificação de componentes alvos [82].
É visto que caso haja demanda por melhor resolução nas separações a Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) têm sido a técnica empregada para a caracterização de amostras complexas, sendo destaque na busca por fingerprints e biomarcadores de normalidade/anormalidade [85].
2.4.2 Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC)
A cromatografia gasosa convencional (GC) possui suas limitações, dentre as principais pode-se destacar a dificuldade em resolver todos os constituintes de amostras complexas tais como petroquímicas, de alimentos, fragrâncias, dentre outros [86], estudos já discutem que algo próximo a apenas 37% dos picos cromatográficos sejam totalmente resolvidos [87].
O fato mais destacável na técnica de GC×GC no âmbito da cromatografia multidimensional está associado à circunstância de que uma mesma amostra é sujeita a duas separações analíticas diferentes. A Cromatografia Gasosa Multidimensional (MDGC, Multidimensional Gas Chromatography) também conhecida como "heart-cutting" ou frações parciais surgiu como resposta a necessidade de aumentar o poder de resolução, sendo bem efetiva.
Na técnica em questão duas colunas são utilizadas para resolver os analitos de uma amostra, isso ocorre, pois frações de picos coeluídos na primeira dimensão (selecionados por meio de GC convencional) são reinjetados e separados numa segunda dimensão (coluna). Desta forma, a capacidade de pico (n) do sistema é igual à soma da capacidade de pico de primeira dimensão (n1) com o produto da capacidade de pico da segunda
