Análise Cromatográfica

Análise por cromatografia gasosa (8 e 9)

A re-suspensão do extrato seco em acetato de etila (etapa 7) foi feita para determinar os PE por cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama. Conforme visto na revisão da literatura, as análises de E2, EE2 e NP por cromatrografia gasosa necessitam da etapa de derivatização. Este procedimento consiste em transformar um composto em um derivado, cujas características de volatilização e interação com a fase estacionária da coluna utilizada permitam a análise do composto em questão. No

caso dos PE analisados, a etapa de derivatização é utilizada ainda para aumentar a seletividade e a sensibilidade da análise, pois os compostos formados após a derivatização não são degradados a altas temperaturas. Nesse caso, o derivado obtido será de polaridade menor e volatilidade maior, o que possibilita sua análise por cromatografia gasosa.

  A reação utilizada para derivatizar os PE foi a de silanização, que consiste em substituir o hidrogênio da hidroxila (-OH) pelo grupo trimetil-silil (-Si(CH3)3)

diminuindo assim a polaridade desses compostos e aumentando sua volatilidade. A Figura 4.4 apresenta uma reação geral de silanização e os compostos utilizados nessa etapa.

Figura 4.4 – Reação de Silanização a partir dos analitos a serem derivatizados

(nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o reagente de derivatização utilizado (BSTFA)

O procedimento para derivatização dos compostos a serem analisados por CG- FID consistiu nas seguintes etapas:

• A partir do extrato re-suspendido com acetato de etila (1,0 mL – grau CG, Sigma-Aldrich) (etapa 7), transferiu-se 50µL da solução para outro vial no qual foi novamente secado com nitrogênio.

• No extrato seco, foi adicionado 50µL de BSTFA (sigma-aldrich).

• O vial foi fechado e colocado sob uma temperatura constante de 75°C durante 45 minutos.

O extrato derivatizado foi levado para análise no CG-FID Varian CP 3380 no qual foi analisado de acordo com as condições apresentadas na Tabela 4.3.

Tabela 4.3: Condições de análise dos PE por cromatrografia gasosa

Aparelho Varian CP 3380

Coluna BPX-5 (5% fenil, 95% dimetilpolisiloxano)

Características *Comprimento: 25m

*Diâmetro interno: 0,15 mm *Espessura do filme: 0,25 µm

Gases utilizados N2 (make-up), Ar Sintético (comburente) e

H2 (gás de arraste e combustível) Vazões dos Gases N2: 30mL/min Ar Sintético: 300mL/min H2: 30mL/min

Fase Móvel: 30mL/min

Injeção 2 µL, splitless total

Temperatura do injetor 280°C Temperatura do detector 300°C Programação de temperatura *50°C por 1min; *50 a 120°C a 20°C/min; *120 a 280°C a 10°C/min estabilizando a 280°C por 11minutos.

Tempo total: 32minutos

Análise por cromatografia líquida com espectrometria de massas (etapa 11)

Diferentemente da cromatrografia gasosa, os perturbadores endócrinos a serem analisados não necessitam de ser derivatizados para análise por cromatografia líquida. Portanto, após a secagem do extrato de SPE, foi feito a suspensão com 1 mL de metanol (grau HPLC, J.T. Baker). As análises por cromatografia líquida foram realizadas em um equipamento da Shimadzu, modelo LCMS-IT-TOF (Cromatografia Líquida acoplado a espectrômetro de massas, detector do tipo ion-trap - time-of-flight), e configurado de acordo com a Tabela 4.4. Os solventes utilizados como fase móvel foram degaseificados pelo sistema DGU-20A3 (Shimadzu).

O LCMS-IT-TOF é um equipamento híbrido ideal para identificação de compostos orgânicos não-voláteis. Acoplando ionização a pressão atmosférica com as tecnologias de Ion Trap (IT) e Tempo de vôo (TOF), o LCMS-IT-TOF permite obter alta exatidão de massa e alta resolução (10.000 a 1000 m/z) em todos os modos MS. Disponibiliza a capacidade de MSn (MS/MS, MS/MS/MS, MS/MS/MS/MS.) utilizando o método de ion-trap e também a capacidade de realizar medições de massa de alta resolução e alta precisão utilizando o método TOF, propiciando uma grande seletividade

e especificidade dos íons. Pode ser utilizado para obter uma larga variedade de informações analíticas que são importantes para análise estrutural (shimadzu). A Figura 4.5 mostra o diagrama de funcionamento do espectrômetro de massas de acordo com a metodologia utilizada.

Figura 4.5 – Diagrama esquemático de funcionamento do espectrômetro de massas íon- trap – time-of-flight (fonte: Shimadzu, 2007)

No desenvolvimento da análise cromatográfica foi avaliada a detecção dos compostos usando como fase móvel (FM) acetonitrila/água e metanol/água. Para isso foram estudados três parâmetros: FM, vazão da FM e tipo de eluição (isocrática ou gradiente). A vazão da fase móvel escolhida foi 0,2 mL min-1 com a utilização dos solventes metanol/água definida a partir da análise dos picos dos compostos obtidos com vazões que variaram entre 0,1 e 0,3 mL min-1. O método de eluição por gradiente obteve melhores resultados cromatográficos. O volume de injeção foi mantido em 5 μL durante todas as análises. Uma vez que a concentração da amostra foi multiplicada por um fator de 1000 vezes, grande quantidade e variedade de compostos orgânicos estiveram presente no extrato, o que resultou em uma amostra de elevada complexidade. Devido a isso, foi utilizada uma pré-coluna apenas, uma vez que a separação dos compostos não ocorreria em colunas convencionais (colunas maiores). Para as análises foram utilizadas pré-colunas Phenomenex C18 (4,0 mm x 2,0 mm). A freqüência de troca ocorreu a cada 100 análises aproximadamente, devido a durabilidade menor das pré-colunas. Maiores informações da análise são apresentados na Tabela 4.4.

Tabela 4.4: Condições de análise dos PE por cromatrografia líquida acoplada à

espectrometria de massas

Aparelho Shimadzu LCMS-IT-TOF

Módulos CBM-20A (Controlador de Sistema)

DGU-20A3 (Degaseificador) LC-20AD (Propulsão de Solventes) SIL-20ª (Injetor Automático) IT-TOF (Espectrômetro de massas)

Pré-Coluna Phenomenex C18 (ODS) (4,0 mm x 2,0 mm)

Vazão da Fase Móvel 0,2 mL . min-1 (metanol e água)

Gradiente de concentração (água e metanol)

*Variação de 30 a 85% de metanol em 5 minutos; *Estabilização a 85% de metanol por 3 minutos; *Aumento para 100% de metanol e estabilização por 8 minutos;

*Redução para 0% de metanol e estabilização por 2 minutos;

*Aumento para 30% de metanol e estabilização por 5 minutos.

Tempo total de análise: 23 minutos.

Volume de injeção da amostra 5µl (injeção automática)

Gases Utilizados Argônio (gás de colisão)

Nitrogênio (gás de nebulização). Pressão: 100kPA

Temperatura do CDL1 200°C

Voltagem do detector 1,65 kV

Interface Eletronspray ionization (ESI) - modo negativo

Intervalo de varredura m/z 100 a 350

Íons monitorados Nonilfenol: m/z = 219,17

Estradiol: m/z = 271,17 Etinilestradiol: m/z = 295,17

Tempo de acumulação de íons Nonilfenol: 30 milisegundos

Estradiol: 100 milisegundos Etinilestradiol: 100 milisegundos

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CDL: Curved Dessolvation Line(Kaihara et al. 2002; Schug e McNair 2003)