Universidade Federal de Ouro Preto
Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Davi Silva Moreira
“DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALITICA POR
CROMATOGRAFIA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA
AVALIAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE PERTURBADORES
ENDÓCRINOS EM MANANCIAIS DE ABASTECIMENTO DA
REGIÃO METROPOLITANA DE BELO HORIZONTE.”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título: “Mestre em Engenharia Ambiental –
Área de Concentração: Saneamento Ambiental”
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino
Ouro Preto, MG 2008
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
M838D MOREIRA, DAVI SILVA.
Desenvolvimento da metodologia analítica por cromatografia/ espectrometria de massas para avaliação da ocorrência de pertubadores endócrinos em mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte [manuscrito] / Davi Silva Moreira. – 2008.
123f. : il. color., graf., tabs.
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisa em Recursos Hídricos Pró-Água.
“Por falta de reflexão os projetos
fracassam, mas se realizam quando
há muitos conselheiros.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por sempre estar comigo em todos os momentos. Sem Ele não seria possível completar esta importante etapa na vida.
Ao professor Sérgio por ter acreditado na minha capacidade e ter sido um grande professor nos ensinamentos de vida acadêmica e profissional. Ao professor Robson por ter apoiado o projeto e ajudado valiosamente com seus conhecimentos.
Aos professores do DEQUI pela dedicação em repassar seus conhecimentos a todos nós alunos durante a graduação e mestrado.
Aos colegas da UFMG: Jacson, Lucinda e, principalmente, ao Fábio e a Eliane que ajudaram no projeto sempre que necessário.
Ao professor Valter por ter confiado no DEQUI-UFOP como parceiro no projeto PROSAB 5.
Aos amigos do laboratório Aniel, Danusa, Fernanda e Gustavo pela grande amizade e o intercâmbio de conhecimentos que foram de grande valia para a evolução de nossos projetos. A Miriany pela grande ajuda no final do projeto com as análises complementares.
Aos amigos Flaviane e Leandro que sempre estiveram comigo nos melhores e piores momentos de UFOP, que já são seis anos. Obrigado!
A UFOP pela bolsa concedida.
A COPASA pela colaboração na coleta das amostras.
E finalmente, aos meus pais Luiz Henrique e Iolanda e aos meus irmãos Saulo e Ariel que sempre apoiaram e incentivaram mostrando que todo esforço vale a pena.
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO... 1
2. OBJETIVOS... 4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 5
3.1. O sistema endócrino... 5
3.2. Perturbadores endócrinos... 7
3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos... 9
3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos relatados em animais silvestres e de laboratório... 11
3.2.3. Efeitos dos perturbadores endócrinos relatados em humanos... 13
3.3. Análise e monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas Superficiais... 14
3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos... 15
3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais... 24
3.3.3. Técnicas de remoção de perturbadores endócrinos... 30
3.3.4. Considerações finais.... 32
4. MATERIAIS E MÈTODOS... 34
4.1. Desenvolvimento e Otimização do Método Analítico... 34
4.1.1. Amostragem, filtração e ajuste do pH ... 36
4.1.2. Extração e concentração dos analitos... 36
4.1.3. Secagem e suspensão dos analitos... 38
4.1.4. Análise Cromatográfica... 38
4.2. Validação do método analítico... 42
4.2.1. Estabilidade... 43
4.2.2. Seletividade... 44
4.2.3. Curva analítica... 44
4.2.4. Linearidade e Sensibilidade... 47
4.2.5. Precisão... 47
4.2.6. Ensaio de supressão... 48
4.2.7. Ensaio de recuperação... 48
4.2.8. Ensaio de calibração interlaboratorial... 49
4.3. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos nos Mananciais da Região Metropolitana de Belo Horizonte... 50
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES... 58
5.1.Cromatografia Gasosa com Detecção por Ionização em Chama.... 58
5.2. Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de massas - Desenvolvimento do Método Analítico... 61
5.3. Validação do Método Analítico para LCMS... 65
5.3.1. Estabilidade... 65
5.3.2. Seletividade... 66
5.3.3. Curva Analítica... 67
5.2.4. Linearidade e Sensibilidade... 69
SUMÁRIO (continuação)
Página
5.3.6 Ensaio de Supressão... 71
5.3.7 Ensaio de Recuperação... 73
5.3.8. Ensaio de calibração interlaboratorial... 74
5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos em Mananciais da Região Metropolitana de Belo Horizonte... 76
5.5 Estimativa de valores críticos de toxicidade dos PE estudados... 94
6. CONCLUSÕES... 97
7. PERSPECTIVAS... 99
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 3.1: Órgãos do sistema endócrino... 5
Figura 3.2: Funcionamento do hipotálamo... 6
Figura 3.3: Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais... 8
Figura 3.4: Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito antagonista... 11
Figura 3.5: Diagrama esquemático para preparação e análise dos perturbadores endócrinos... 16
Figura 3.6: Etapas da extração por fase sólida para isolamento de compostos de interesse... 19
Figura 3.7: Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A) Imobilização do receptor específico ao suporte, seguido de incubação após a adição da amostra contendo estrogénios e de anticorpos; B) Adição da solução adequada ao tipo de detecção pretendida... 22
Figura 4.1: Diagrama geral para preparação e análises dos PE. ... 35
Figura 4.2: Cartucho SPE C18 500mg Unitech... 37
Figura 4.3: Sistema de extração em fase sólida utilizado para extração dos analitos de interesse das amostras ambientais... 38
Figura 4.4: Reação de Silanização a partir dos analitos a serem derivatizados (nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o reagente de derivatização utilizado (BSTFA)... 39
Figura 4.5: Diagrama esquemático de funcionamento do espectrômetro de massas íon-trap – time-of-flight... 41
Figura 4.6: Fórmula Estrutural da Fenolftaleína... 45
Figura 4.7: Localização dos 3 mananciais estudados na Região Metropolitana de Belo Horizonte... 51
Figura 4.8: Contribuição das ETAs no abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte... 51
Figura 4.9: Vista aérea ETA Rio das Velhas... 53
Figura 4.10: Local de amostragem para água bruta do manancial Rio das Velhas... 53
Figura 4.11: ETA Vargem das Flores... 54
Figura 4.12: Vista aérea ETA Vargem das Flores... 55
Figura 4.13: Vista aérea da ETA Sistema Morro Redondo... 56
Figura 4.14: ETA Morro Redondo... 56
Figura 5.1: Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeção de mistura de padrões em diferentes concentrações. ... 60
LISTA DE FIGURAS (continuação)
Página
Figura 5.3: Cromatograma típico da análise dos PE em questão: 1 – Fenolftaleína, 2 – Estradiol, 3 – Etinilestradiol, 4 – ms² Etinilestradiol, 5 – ms² Estradiol, 6 – Nonilfenol , 7 – ms² nonilfenol ) ... 63 Figura 5.4: Cromatogramas relativos aos íons precursores ms1 e ms²
(modos negativo) característicos de cada composto... 64 Figura 5.5: Cromatograma do metanol puro (branco). Ausência de picos
para E2, EE2 (Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presença de interfente no tempo de retenção do NP (Segmento 2 - 6,8minutos - direito)... 66 Figura 5.6: Amostra Morro Redondo (água bruta) com adição de estradiol
e etinilestradiol (100 μg.L-1, quadro da esquerda) e n-nonilfenol (200 μg.L-1, quadro da direita). ... 67 Figura 5.7: Curvas analíticas obtidas com soluções-padrão para os quatro
padrões de PE... 70 Figura 5.8: Chuva acumulada mensal na RMBH durante o período de
monitoramento (fev/07 a jan/08).... 76 Figura 5.9: Box-plot da concentração dos três compostos determinados nos
mananciais estudados em todas as campanhas amostrais. Água Bruta... 78 Figura 5.10: Variação da concentração de nonilfenol em água bruta nos
mananciais durante o período de fev/07 a jan/08... 80 Figura 5.11: Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas –
Nov. 2007 e as diferentes fragmentações (ms²) de seus isômeros (esquerda). Exemplos de estruturas químicas de 5 dos 550 Isômeros de nonilfenol existentes (direita).... 81 Figura 5.12: Boxplot da concentração de nonilfenol na água bruta nos 3
mananciais.... 82 Figura 5.13: Índice de remoção de NP (água bruta – água filtrada) durante
as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008... 83 Figura 5.14: Variação da concentração de estradiol em água bruta nos
mananciais durante o período de fev/07 a jan/08... 84 Figura 5.15: Variação da concentração de etinilestradiol em água bruta nos
mananciais durante o período de fev/07 a jan/08... 86 Figura 5.16: Índice de remoção (água bruta – água filtrada) de EE2 durante
as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008... 87 Figura 5.17: Confirmação da presença de Bisfenol A na água a partir do
LCMS. Amostra: Rio das Velhas janeiro de 2008... 88 Figura 5.18: Análise quimiométrica das amostras referentes aos meses de
LISTA DE FIGURAS (continuação)
Página
Figura 5.19: Variação do pH nas amostras de água bruta dos três mananciais durante o período de monitoramento... 91 Figura 5.20: Variação da turbidez nas amostras de água bruta dos três
mananciais durante o período de monitoramento.... 91 Figura 5.21: Variação da cor aparente nas amostras de água bruta durante o
período de monitoramento nos 3 mananciais... 92 Figura 5.22: Variação da cor verdadeira nas amostras de água bruta durante
o período de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais... 92 Figura 5.23: Análise da Componente principal (PCA) dos seis parâmetros
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 3.1: Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os Perturbadores Endócrinos... 9 Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em
animais... 12 Tabela 3.3: Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de
Mol et al. 2000)... 15 Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes.. 19 Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de
nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais... 26-28 Tabela 3.6: Principais fontes de perturbadores endócrinos em águas
superficiais... 30 Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoção de perturbadores
endócrinos... 32 Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, fórmula molecular, pureza, marca e
número CAS dos compostos determinados... 35 Tabela 4.2: Descrição do procedimento de extração com cartucho Unitech
C18 (500 mg) utilizado nesse trabalho para a extração simultânea dos três compostos de interesse... 37 Tabela 4.3: Condições de análise dos Perturbadores endócrinos por
cromatrografia gasosa... 40 Tabela 4.4: Condições de análise dos PE por cromatrografia líquida
acoplada à espectrometria de massas... 42 Tabela 4.5: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA Rio das Velhas... 54 Tabela 4.6: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores... 55 Tabela 4.7: Campanhas realizadas para determinação dos Perturbadores
Endócrinos na Região Metropolitana de Belo Horizonte – ETA Morro Redondo... 57 Tabela 5.1: Tempo de retenção, área obtida em relação à concentração e
limite de detecção dos compostos analisados por cromatografia gasosa... 59 Tabela 5.2: Fórmulas moleculares, tempos de retenção, íons primários
(ms1) e secundários (ms2) característicos para cada padrão utilizado... 64 Tabela 5.3: Variação da concentração dos compostos em relação ao tempo
LISTA DE TABELAS (continuação)
Página
Tabela 5.4: Faixa de trabalho, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) dos quatro compostos determinados por LCMS-IT-TOF... 68 Tabela 5.5: Coeficiente de correlação (r) obtido para os 4 padrões
determinados por LCMS-IT-TOF ao longo do monitoramento... 69 Tabela 5.6: Repetibilidade dos resultados obtidos para soluções-padrão dos
três PE expressa por meio do coeficiente de variação (CV)... 71 Tabela 5.7: Resultados dos testes de supressão realizados com amostras
coletadas na entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008)... 72 Tabela 5.8: Variação da supressão nas amostras de água bruta no mês de
janeiro 2008... 73 Tabela 5.9: Valores obtidos pelos ensaios de recuperação de E2, EE2 e NP
em função da fortificação das amostras coletadas na entrada da ETA Morro Redondo... 74 Tabela 5.10: Resultados obtidos pela calibração interlaboratorial
UFOP-CIRRA... 70 Tabela 5.11: Concentração de nonilfenol (ng.L-1) encontrada durante as
campanhas de amostragem... 79 Tabela 5.12: Concentração de 17β-estradiol (ng .L-1) encontrada durante as
campanhas de amostragem... 84 Tabela 5.13: Concentração de 17α-etinilestradiol (ng.L-1) encontrada durante
as campanhas de amostragem... 86 Tabela 5.14: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (água bruta)... 89 Tabela 5.15: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores (água bruta)... 90 Tabela 5.16: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período
de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (água bruta)... 90 Tabela 5.17: Exemplos de pertubação endócrina observada em animais do
LISTA DE NOTAÇÕES
APEO Alquilfenóis Polietoxilados
BPA Bisfenol A
BSTFA N-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida
CAS Chemical Abstract Service
CETESB Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
CG Cromatografia Gasosa
CG-FID Cromatrografia Gasosa com detecção por Ionização em Chama
CGMS Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CSTEE Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment
DAD Detector de Arranjo de Diodo (para cromatografia líquida)
DDE Diclorodifeniltricloroetileno
DDT Dicloro-difenil-tricloro-etano
DES Dietilestilbestrol
DIC Detector de Ionização em Chama (para cromatografia Gasosa)
E1 Estrona
E2 Estradiol
E3 Estriol
EDC Endocrine Disrupting Chemicals
EE2 Etinilestradiol
EM Espectrometria de Massas
ESI Eletronspray ionization
ETA Estação de tratamento de água
ETE Estação de tratamento de esgoto
FE Fase estacionária
FM Fase móvel
H2SO4 Ácido Sulfúrico
HCl Ácido Clorídrico
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
IEH Institute for Ecological Health
IPCS Programa Internacional de Segurança Química
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LC Cromatografia Líquida
LCMS Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas
LCMS-IT-TOF
Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas. Detecção por Ion Trap e Time of Flight
MSTFA N-metil-n-trifluoroacetamida
MTBSTFA N-metil-n-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida
LISTA DE NOTAÇÕES (continuação)
NP Nonilfenol ou n-nonilfenol
NPEO Nonilfenol Polietoxilado
OCDE Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
OMS Organização Mundial da Saúde
PCA Análise de componente principal
PE Perturbadores Endócrinos
POP Poluentes Orgânicos Persistentes
RMBH Região Metropolitana de Belo Horizonte
SPE Extração por fase sólida
SPME Microextração em fase sólida
STP Substâncias Tóxicas Persistentes
UE União Européia
UKEA Agência de Proteção Ambiental do Reino Unido
USEPA Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
UV/VIS Detector ultravioleta na região do visível
RESUMO
Alguns compostos orgânicos classificados como Perturbadores Endócrinos (PE) são encontrados em águas superficiais e têm atraído a atenção da comunidade científica devido à alteração que eles causam no sistema endócrino da fauna aquática e ao potencial risco à saúde humana. Nessa classe de compostos, destacam-se os hormônios (17β-estradiol, 17α-etinilestradiol) e subprodutos da degradação de surfactantes não-iônicos (n-nonilfenol). Devido a atualidade do tema, há poucos trabalhos nacionais publicados abordando o monitoramento e a remoção de PE de águas naturais, não havendo ainda uma legislação que regulamente a emissão de hormônios e nonilfenóis no ambiente ou que estabeleça padrões de potabilidade para tais compostos. Sendo assim, essa dissertação teve como objetivo desenvolver metodologia analítica para quantificação de 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e n-nonilfenol (NP) em amostras de água superficial, de forma a permitir o monitoramento de tais PE em três mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH). A quantificação dos PE nas amostras ambientais foi feita em equipamento de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LCMS) após extração e concentração em cartuchos tipo C18. A recuperação dos PE pelo processo de extração em fase sólida variou de 90 a 96¨% ao passo que os limites de detecção do método foram de 1,4; 0,9 e 4,9 ng.L-1 para o E2, EE2 e NP, respectivamente. Após validação do método analítico, foi feito o monitoramento do afluente e da água filtrada (em filtro de areia) de três estações de tratamento de água (Morro Redondo, Vargem das Flores e Rio das Velhas) da região Metropolitana de Belo Horizonte. Todos os três compostos monitorados foram encontrados em pelo menos uma amostra, sendo que o n-nonilfenol esteve presente em todas amostras de água bruta, na faixa de concentração de 44 a 1.918 ng.L-1. Os compostos 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol foram determinados em apenas 15% das amostras, na faixa de concentração de 2 a 54 ng.L-1. As análises das amostras coletadas nas ETAs após o filtro de areia mostraram que as etapas de pré-cloração, coagulação, sedimentação e filtração não foram capazes de remover, em sua totalidade, os PE monitorados.
Palavras-chave: Perturbadores endócrinos; microcontaminantes orgânicos; qualidade
ABSTRACT
Some organic molecules classified as endocrine disrupters compounds (EDC) have been found in surface waters and attracted attention from the scientific community due to their hability to tamper with the endocrine system of aquatic fauna, hence due to the potential risk they pose to human health. Among the compunds with endocrine properties, the hormones (17β-estradiol 17α- ethinylestradiol) and a by-product of the degradation of non-ionic surfactants (n-nonylphenol) are of particular importance. There are a handful of papers on the monitoring of EDC in Brazilian waters and there is no Brazilian legislation regulating estradiol and nonylphenol in surface or drinking water. Therefore, this work aimed at developing analytical techniques to quantify 17 β -estradiol (E2), 17 α-ethynilestradiol (EE2) and n-nonylphenol (NP) in samples of surface water from three manancials located in the Belo Horizonte Metropolitan Area, Minas Gerais, Brazil. The quantification of such EDC was performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) after the samples being extracted and concentrated with C18 cartridges. The recovery of EDC by solid phase extraction varied from 90 to 96% and the limit of detection of the whole analytical procedure was determined as 1.4; 0.9 and 4.9 ng.L-1 for E2, EE2 and NP, respectively. After the method validation it was carried out a one year monitoring of raw and filtered water (sand filtration) of three water treatment plants (Morro Redondo, Vargem das Flores and Rio das Velhas) that supply Belo Horizonte Metropolitan Area. The results showed that the three compounds were found in at least one sample, and that the n-nonylphenol was present in all water samples analysed, in a concentration range of 44 to 1,918 ng.L-1. The estrogens 17β-estradiol and 17 α-ethinylestradiol were detected in only 15% of the samples, in a concentration range of 2 to 54 ng/L. The analyses of samples collected in the WTPs after the sand filter indicates that the pre-chlorination, coagulation, sedimentation and sand filtration steps were not capable of completely removing the EDC present in the raw water.
1. INTRODUÇÃO
A água é hoje reconhecida como um dos bens naturais mais importantes do planeta. Seus múltiplos usos são indispensáveis a um amplo espectro das atividades humanas. Devido a crescente degradação dos corpos d’água, as preocupações com o uso e destino têm mobilizado pessoas de diversas áreas acadêmicas a pesquisas científicas com o intuito de preservar e recuperar esse recurso natural.
A partir da década de 70, o interesse da comunidade acadêmica e a criação de órgãos de proteção ambiental, como a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA), promoveram um crescimento de pesquisas envolvendo monitoramento de microcontaminantes orgânicos em diversos setores ambientais. Com isso, o interesse dos setores público e privado por assuntos ambientais resultou em várias organizações governamentais e não-governamentais que hoje debatem, estabelecem normas e discutem práticas de minimização e remediação de substâncias químicas potencialmente poluentes.
Dentre as substâncias químicas potencialmente poluentes, nos últimos anos, destacaram-se alguns compostos denominados perturbadores endócrinos (PE), que são substâncias que podem provocar alterações no sistema endócrino de animais e de humanos. Os PE constituem uma classe de substâncias não definidas pela sua natureza química, mas pelo seu efeito biológico, que pode causar distúrbios no sistema endócrino mesmo em baixas concentrações. Muitos dos perturbadores endócrinos listados por algumas organizações como a USEPA e a Agência Ambiental do Reino Unido (UKEA), também estão classificados numa série de grupos de compostos orgânicos potencialmente tóxicos, tais como as substâncias tóxicas persistentes (STP), poluentes orgânicos persistentes (POP), poluentes emergentes, dentre outros. A União Européia também elaborou um relatório contendo uma vasta lista de 118 compostos suspeitos de interferir no sistema endócrino, tanto de seres humanos como de diferentes espécies animais (Ghiselli e Jardim 2007; Damstra et al. 2002).
envolvendo mulheres grávidas que tomaram o estrogênio sintético dietilestilbestrol (DES), prescrito para evitar o aborto espontâneo e promover o crescimento do feto, no período entre 1948 a 1971. Muitas das filhas dessas mulheres são hoje estéreis e, uma minoria, tem desenvolvido um tipo raro de câncer vaginal (Damstra et al., 2002). Homens adultos que foram expostos a estradiol mostram maior incidência de anormalidades em seus órgãos sexuais, apresentam contagem média de espermatozóides diminuída e podem sofrer um risco maior de desenvolver câncer de testículos (Colucci
et al. 2001; Guillette et al. 1996; Legler et al. 2002).
Dentre a vasta quantidade de PE que já foram avaliados pela comunidade científica, destacam-se três compostos que são comumente avaliados em diversos trabalhos, que pode ser justificado pelos seguintes fatores:
i) n-nonilfenol ou nonilfenol: é um subproduto da degradação dos alquillfenóis polietoxilados (APEO), que são agentes surfactantes de amplo uso tanto em processos industriais como em produtos de uso doméstico, por exemplo, detergentes (USEPA 2001);
ii) 17β-estradiol ou estradiol: é um hormônio natural que nas mulheres é responsável pela síntese de estrogênio circulante, sendo por isso naturalmente e diariamente excretado na urina humana e, assim, descartado no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2003);
iii) 17α-etinilestradiol ou etinilestradiol: é um dos estrogênios sintéticos mais usados como contraceptivos orais, na reposição terapêutica na menopausa ou na prevenção do aborto (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli e Jardim 2007).
De acordo com trabalhos nacionais e internacionais, compostos classificados como PE têm sido detectados em amostras de águas superficiais, principalmente em função da atividade antrópica (Alda e Barceló 2001). Pesquisas também têm mostrado que substâncias estrogênicas são encontradas em rios receptores de esgotos domésticos, tratados ou in natura. Potencialmente danosos à saúde, os PE têm se mostrado
conseguem remover completamente tais micropoluentes, havendo relato da presença de diversos fármacos e de estrogênios naturais e sintéticos no esgoto doméstico e efluentes de ETEs (Jeannot et al. 2002; Körner et al. 2000).
Em relação aos corpos d’água, outro fator importante é que pouco se sabe sobre o real impacto desses compostos sobre o ambiente aquático e, principalmente, sobre a saúde humana. No caso do Brasil, a ausência de ETEs em grande parte dos municípios brasileiros agrava ainda mais o quadro de possível contaminação das águas superficiais por PE.
Tendo em vista a crescente preocupação ambiental dedicada aos “perturbadores endócrinos”, principalmente no Brasil, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma metodologia analítica que permita a detecção e quantificação de três PE (NP, E2 e EE2) em amostras de água superficiais a partir da técnica de LCMS. Serão também discutidos, brevemente, resultados sobre análises dos três compostos a partir da cromatografia gasosa com detector por ionização em chama (CG-FID). Após o desenvolvimento da técnica de análise, será feito o monitoramento de três mananciais de abastecimento da RMBH: Rio das Velhas e Morro Redondo e Vargem das Flores.
2. OBJETIVOS
O objetivo geral do trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a detecção e quantificação dos perturbadores endócrinos nonilfenol (NP), estradiol (E2) e etinilestradiol (EE2) em amostras de água usando cromatografia acoplada a espectrometria de massas (LCMS).
Objetivos específicos:
• Monitorar, pelo período de um ano, a água de três mananciais da região metropolitana de Belo Horizonte para avaliar a presença de NP, E2 e EE2;
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. O sistema endócrino
Dá-se o nome de sistema endócrino ao conjunto de órgãos que apresentam como atividade característica a produção de secreções denominadas hormônios, que são lançados na corrente sangüínea e irão atuar em outra parte do organismo, controlando ou auxiliando o controle de sua função. Os órgãos que têm sua função controlada e/ou regulada pelos hormônios são denominados órgãos-alvo (Guyton 1988).
Os hormônios influenciam praticamente todas as funções dos demais sistemas corporais. Freqüentemente o sistema endócrino interage com o sistema nervoso, formando mecanismos reguladores bastante precisos. O sistema nervoso pode fornecer ao endócrino a informação sobre o meio externo, ao passo que o sistema endócrino regula a resposta interna do organismo a esta informação. Dessa forma, o sistema endócrino, juntamente com o sistema nervoso, atua na coordenação e regulação das funções corporais (Guyton 1988). A Figura 3.1 apresenta os órgãos do sistema endócrino. As propriedas dos órgãos do sistema endócrino serão discutidas a seguir.
Figura 3.1 - Órgãos do sistema endócrino (Fonte: AFH, 2007).
Hipotálamo: responsável pelo controle da hipófise através de conexões neurais e substâncias semelhantes a hormônios chamados fatores desencadeadores (ou de liberação), o meio pelo qual o sistema nervoso controla o comportamento sexual via sistema endócrino. Em mulheres, a glândula-alvo do hormônio gonadotrófico é o ovário; no homem, são os testículos. O hipotálamo é responsável pelo controle de inibição ou liberação destes hormônios. Como a hipófise secreta hormônios que controlam outras glândulas e está subordinada, por sua vez, ao sistema nervoso, pode-se dizer que o sistema endócrino é subordinado ao nervoso e que o hipotálamo é o mediador entre esses dois sistemas A Figura 3.2 apresenta um diagrama de funcionamento do hipotálamo.
Figura 3.2 - Funcionamento do hipotálamo (Fonte: AFH, 2007).
Tireóide: responsável pela produção de hormônios como triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), que aumentam a velocidade dos processos de oxidação e de liberação de energia nas células do corpo, elevando a taxa metabólica e a geração de calor. A calcitonina, outro hormônio secretado pela tireóide, participa do controle da concentração sangüínea de cálcio, inibindo a remoção do cálcio dos ossos e a saída dele para o plasma sangüíneo, estimulando sua incorporação pelos ossos.
Paratireóides: glândulas responsáveis pela secreção do paratormônio, hormônio que estimula a remoção de cálcio da matriz óssea (o qual passa para o plasma sangüíneo), a absorção de cálcio dos alimentos pelo intestino e a reabsorção de cálcio pelos túbulos renais, aumentando a concentração de cálcio no sangue.
Pâncreas: é uma glândula mista, ou seja, apresenta determinadas regiões endócrinas e exócrinas ao mesmo tempo. As funções endócrinas do pâncreas são responsáveis por células que secretam dois hormônios: insulina e glucagon.
3.2. Perturbadores endócrinos
O termo “Pertubador Endócrino” é utilizado nesse texto como sinônimo de disruptores endócrinos, interferentes endócrinos e agentes hormonalmente ativos, que na literatura internacional corresponde aos “endocrine disrupting compounds or chemicals” (EDC). Os termos mais usados são perturbadores endócrinos e disruptores endócrinos. Muitas definições têm sido propostas para tal classe de compostos, entretanto, para todas elas existe um ponto em comum: trata-se de uma substância química que pode interferir no funcionamento natural do sistema endócrino de espécies animais, incluindo os seres humanos.
Alguns pesquisadores definem um interferente endócrino com base nos seus efeitos, ou seja, trata-se de uma substância química que, mesmo presente em concentração extremamente baixa, é capaz de interferir no funcionamento natural do sistema endócrino, podendo causar câncer, prejudicar os sistemas reprodutivos e causar outros efeitos adversos (Mozaz et al. 2007; Yang et al. 2006). Em maio de 1997, a agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (Environmental Protection Agency - USEPA), definiu um interferente endócrino como “agente exógeno que interfere com síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no corpo, que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento dos organismos”.
O Programa Internacional de Segurança Química (IPCS), em conjunto com o Japão, os EUA, o Canadá, a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) e a União Européia, adotou a seguinte definição para os perturbadores endócrinos: “Um perturbador endócrino é uma substância ou um composto exógeno que altera uma ou várias funções do sistema endócrino e tem, conseqüentemente, efeitos adversos sobre a saúde num organismo intacto, sua descendência, ou (sub) populações” (CEC 1999).
produtos de limpeza, agrotóxicos, e cosméticos; pílulas anticoncepcionais e outros fármacos. Desta forma, a exposição aos perturbadores endócrinos pode ocorrer a partir de uma variedade de fontes, de forma voluntária ou não, inclusive por meio da dieta diária e do consumo de água potável (Damstra et al. 2002; Solé et al. 2003; Veras 2006). A Figura 3.3 mostra exemplos de perturbadores endócrinos comumente presentes no ambiente (Laganà et al. 2004).
Figura 3.3 – Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais (Laganà et al. 2004).
Embora desde o início do século XX já existissem hipóteses prevendo alterações no funcionamento do sistema endócrino de algumas espécies animais expostas a determinadas substâncias químicas tóxicas, apenas recentemente esta importante questão tem recebido a devida atenção por parte da comunidade científica. Isso pode ser constatado pelo número crescente de publicações que relatam o aumento da incidência de disfunções no sistema endócrino de seres humanos (incluindo a infertilidade masculina), e mais significativamente, efeitos fisiológicos adversos observados em espécies animais para as quais a relação causa/efeito é mais evidente (Damstra et al. 2002).
Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), investigaram o tema “perturbadores endócrinos”, conforme mostra a Tabela 3.1.
Tabela 3.1: Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os Perturbadores Endócrinos (Bila e Dezotti 2007).
Ano Organização Objetivos do Estudo
1995 Agência Ambiental Federal Alemã
Discussão sobre evidência e impactos dos PE e riscos potenciais que podem causar em humanos e animais 1995 Agência Proteção Ambiental
Americana (USEPA)
Seminários para avaliar os riscos à saúde e efeitos ambientais dos PE
1995 Ministério do Meio Ambiente e Energia da Dinamarca
Avaliação dos efeitos de substâncias estrogênicas no desenvolvimento e nas funções do sistema reprodutivo masculino
1996 USEPA Seminário para desenvolvimento de estratégia para avaliar o risco dos PE no ambiente
1996 USEPA Desenvolvimento de programa de testes e análises (screening) para avaliar a ação dos PE
1997 USEPA Relatório sobre os PE presentes no meio ambiente 1998 USEPA Revisão e discussão das informações científicas
disponíveis sobre PE 1998 Organização para a Cooperação
e Desenvolvimento Econômico (OCDE)
Desenvolvimento de métodos de ensaio para os PE
1999 Committee on Toxicity,
Ecotoxicity and the Environment
(CSTEE)
Revisão da literatura existente e opinião científica nas evidências dos PE, em particular, avaliação dos riscos ecológicos e diretrizes de ensaios toxicológicos 1999 Comissão das Comunidades
Européias
Identificação do problema dos PE, suas causas, conseqüências e definição das medidas adequadas para dar uma resposta ao problema
2001 Comissão das Comunidades Européias
Primeiro relatório sobre o progresso dos trabalhos da comunidade européia sobre os PE
2002 Comissão das Comunidades Européias
Programa COMPREHEND: Avaliação das
evidências dos PE no ambiente aquático na Europa 2002 OCDE Avaliação dos métodos de ensaios para as substâncias
estrogênicas 2002 Organização Mundial da Saúde
(OMS)
Avaliação global do estado da arte da ciência dos PE
2003 Instituto de Saúde Ecológica (IHE)
Relatório de avaliação do progresso internacional da pesquisa dos PE
2004 Comissão das Comunidades Européias
Segundo relatório sobre o progresso dos trabalhos sobre os PE.
3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos
específicas do DNA presente no núcleo da célula, o que determina a ação dos genes. Certos compostos químicos podem também se ligar ao receptor hormonal e, conseqüentemente, mimetizar ou bloquear a ação do próprio hormônio (Ghiselli e Jardim 2007; Damstra et al. 2002; Soto et al. 1991).
Esta mudança de atividade é transmitida por várias vias metabólicas, através da membrana plasmática, dependendo do tipo de hormônio. Os diferentes processos fisiológicos (em cascata e independentes) obtidos são controlados por mecanismos complexos, que são ativados ou desativados de acordo com os níveis dos hormônios encontrados no organismo. Embora muitas destas vias metabólicas possam ser influenciadas por estimulações externas ao organismo, a grande maioria das disfunções endócrinas observadas é atribuída ao funcionamento das gônadas, responsáveis pelas características sexuais secundárias e pelo desenvolvimento e funcionamento dos órgãos sexuais (Ghiselli e Jardim 2007; OMS 2002).
Um receptor hormonal possui elevada sensibilidade e afinidade por um hormônio específico produzido no organismo. Por isso, concentrações extremamente baixas de um determinado hormônio geram um efeito, produzindo uma resposta natural (Figura 3.4a). Entretanto, estes receptores hormonais também podem se ligar a outros compostos químicos, e isso explica o porquê de determinados perturbadores endócrinos presentes no organismo, mesmo em baixíssimas concentrações, serem capazes de gerar um efeito, provocando conseqüentemente uma resposta (Damstra et al., 2002).
A alteração no sistema endócrino ocorre quando o PE interage com os receptores hormonais modificando a sua resposta natural, e para isso dois processos distintos podem ser desencadeados. O PE pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma resposta, atuando então como um mimetizador, ou seja, imitando a ação de um determinado hormônio, processo este denominado de efeito agonista (Figura 3.4b). Se o PE se ligar ao receptor, mas nenhuma resposta for produzida, ele estará agindo como um bloqueador, ou seja, estará impedindo a interação entre um hormônio natural e o seu respectivo receptor. Este processo é denominado de efeito antagonista (Figura 3.4c) (Ghiselli 2006).
efeitos de feminização são conhecidos como estrogênicos, enquanto que os que produzem efeitos de masculinização são conhecidos como androgênicos.Assim, se um determinado composto é considerado anti-androgênico como a flutamida (fármaco utilizado no tratamento de câncer de próstata) ele certamente inibirá a ação biológica dos androgênios, ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de androgênios presentes nos tecidos-alvo. Já um composto anti-estrogênico como o tamoxifeno (fármaco utilizado no tratamento de câncer de mama) inibe a ação biológica dos estrogênios ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de estrogênios presentes nos tecidos-alvo (Joon Kang et al. 2002; Panter et al. 2000).
Figura 3.4 - Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito antagonista (Ghiselli, 2006).
3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos em animais silvestres e de laboratório
Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em animais (Bila e Dezotti 2007)
Espécie Contaminante Efeitos Referência
Feminização de Peixes (Allen et al. 1999) Declínio da Reprodução (Robinson et al. 2003) Efluente de
ETE
Indução da síntese de VTG
(Allen et al. 1999; Solé et al. 2000; Solé et al. 2003) Feminização de Peixes (Körner et al. 2000)
Alteração nas gônadas (Panter et al. 2000) Hermafroditismo (Hartley et al. 1998) Incidência de Testículo-Ovulos nas
gônadas (Joon Kang et al. 2002) Declínio da Reprodução (Shioda e Wakabayashi 2000) Mortalidade elevada dos
descendentes (Knorr e Braunbeck 2002) 17β-Estradiol
Indução da síntese de VTG (Routledge et al. 1998) Indução da síntese de VTG (Folmar et al. 2000)
Mortalidade da espécie (Schmid et al. 2002) 17α
-etinilestradiol
Declínio da Reprodução (Robinson et al. 2003) Estrona Indução da síntese de VTG (Routledge et al. 1998)
Declínio da Reprodução Indução da síntese de VTG
(Jobling e Sumpter 1993; Routledge et al. 1998) Octilfenol
Nonilfenol Butilfenol
Mortalidade elevada dos descendentes
Feminização de Peixes (Knorr e Braunbeck 2002) Peixe
Bisfenol A Declínio da Reprodução (Shioda e Wakabayashi 2000)
Bisfenol A
Anomalia no sistema reprodutivo de
ratos (Markey et al. 2002) Mamífero
PCB Alta mortalidade de golfinhos (Aguilar e Borrell 1994)
DDE e DDT
Concentrações anormais de hormônios sexuais no plasma e anomalias morfológicas nas gônadas
(Guillette et al. 1996; Guillette et al. 1999; Milnes
et al. 2002)
Réptil
17β-Estradiol
Indução da síntese de VTG no sangue e alterações na produção de
ovos de tartaruga (Irwin et al. 2001) Feminização de Gaivotas machos (Fry e Toone 1981) DDT
Anomalia no sistema reprodutivo (Bitman et al. 1968) Aves
DDE Nascimento prematuro de aves (Damstra et al. 2002)
Anfíbio
Efluente de ETE
Indução à síntese de VTG no sangue
e hermafroditismo (Bogi et al. 2003)
peixes, Oncorhynchus mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a concentrações de E2 e estrona (E1) ambientalmente relevantes (1, 10, 100 ng.L-1). Os resultados mostraram que as espécies do sexo masculino são sensíveis para E2 e E1 nas concentrações utilizadas, pois ocorreu aumento na concentração de VTG no plasma sanguíneo durante o período de exposição. Entre as fêmeas da espécie Rutilus rutilus ocorreu diminuição do tamanho do ovo.
De acordo com esses e outros pesquisadores, os resultados confirmaram que os estrogênios identificados em efluentes domésticos estão presentes em quantidades suficientes para induzir o surgimento de órgãos masculinos em peixes fêmeas, conhecido como “imposex”, ou imposição sexual (Ghiselli 2006). Este fenômeno é irreversível e provoca a esterilização das espécies, podendo causar declínio considerável nas populações de espécies mais sensíveis. Segundo o estudo de Fernandez et al (2002), os PE encontrados nas águas estudadas (organoestânicos) interferiram na síntese da testosterona (hormônio masculino), ocorrendo aumento na produção deste pelas fêmeas. Consequentemente, a alteração hormonal faz surgir estruturas sexuais masculinas não funcionais, mantendo-se, porém, a anatomia interna do organismo (Fernandez et al. 2002; Damstra et al. 2002).
Foram observadas anomalias em embriões machos e fêmeas de trutas, como por exemplo, a feminização dos machos (Körner et al. 2000; Damstra et al. 2002). Várias espécies de peixes são usadas como modelo para detectar os efeitos de perturbadores endócrinos no desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo. O estudo de Legler et al (2002) mostrou que as substâncias com atividade estrogênica não só são importantes na fase aquosa, mas também podem acumular-se em sedimentos marinhos e expor os organismos em ambientes aquáticos a substâncias com atividade estrogênica.
3.2.3. Efeitos dos perturbadores endócrinos em humanos
Uma variedade de substâncias químicas é suspeita de causar efeitos adversos na saúde humana, resultando em alterações no sistema endócrino, incluindo efeitos no sistema reprodutivo feminino e masculino. Os efeitos dos PE em humanos foram revisados em alguns estudos como o relatório “Global Assessment of the
State-of-the-Science of Endocrine Disrupters” do estudo feito pela International Pannel on
Chemical Safety (IPCS) encomendado pela Organização Mundial da Saúde (Damstra et
alterações na saúde humana, como o câncer de testículo, mama e próstata. A conseqüência da exposição aos PE foi relacionada ao declínio das taxas de espermatozóides, deformidades dos órgãos reprodutivos e disfunção da tireóide.
Vários grupos de pesquisas acreditam que grande parte da população masculina sofre com o decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas, e que isso parece estar relacionado à presença de estradióis nas águas (Damstra et al., 2002). De 1973 a 1994, analisaram a qualidade do sêmen de um grupo de homens férteis saudáveis, levando em conta o volume do fluido seminal, a concentração de esperma e a mobilidade e morfologia dos espermatozóides. Os autores observaram um declínio na concentração e mobilidade dos espermas nos homens por um período de 20 anos, e esse decréscimo da qualidade do sêmen coincide com o aumento na incidência de anomalias no sistema reprodutivo masculino, incluindo câncer testicular (Auger et al. 1995).
O desenvolvimento e as funções do sistema reprodutivo feminino dependem do balanço e das concentrações dos hormônios (estrogênios, andrógenos e tireoidianos). Portanto, uma disfunção no sistema endócrino pode resultar em algumas anomalias, tais como, irregularidades no ciclo menstrual, prejuízos na fertilidade e ovários policísticos. No entanto, devido à capacidade dos PE em modular ou alterar a intensidade dos hormônios, resta saber se essas substâncias podem realmente afetar as funções do sistema reprodutivo feminino. Alguns fatos demonstram que isso pode realmente ocorrer, como o uso de dietilestilbestrol (DES) em mulheres grávidas na década de 70. Uma das conseqüências foram anomalias do sistema reprodutivo feminino (câncer vaginal, gravidez anormal e redução na fertilidade) de crianças nascidas a partir de mães que fizeram uso desse medicamento. Este fato é, sem dúvida, uma evidência dos efeitos à exposição aos perturbadores endócrinos (Damstra et al. 2002).
Apesar de alguns pesquisadores não sugerirem uma correlação entre a exposição aos perturbadores endócrinos e efeitos danosos em humanos, revisões como a da OMS (Damstra et al. 2002) indicam que há claras evidências experimentais e epidemiológicas dessas substâncias na disfunção no sistema reprodutivo humano (Ghiselli 2006).
3.3. Análise e Monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas Superficiais
esgoto doméstico (ETEs) foram estrogênicas para peixes, e que a proporção da intersexualidade nos peixes estava correlacionada com a quantidade dos efluentes lançados nas águas dos rios estudados (Folmar et al. 2000; Solé et al. 2003; Van den Belt et al. 2004). Além das emissões pontuais de efluentes doméstico e industrial, emissões difusas, associadas à chuva e ao escoamento que dela resulta, chegam aos corpos de água e podem contribuir para o aporte de PE. A poluição difusa pode ocorrer devido às deposições atmosféricas (poluição industrial e veicular), à lixiviação de solo contaminado (Ex. drenagem de lixões) e ao escoamento de águas pluviais em ambientes rurais (Ex. pesticidas) e urbanos (Ex. óleos, lixo). A Tabela 3.3 mostra as classes de alguns perturbadores endócrinos e a Figura 3.3 mostra a estrutura química de alguns perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais.
Tabela 3.3: Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de Mol et al. 2000)
Tipo de composto Uso
Pesticidas Agricultura (ex: DDT) Hormônios naturais e
sintéticos
Contraceptivos, agentes de crescimento (ex: estradiol e etinilestradiol)
Alquilfenóis polietoxilados
(APEOs)
Detergentes, cosméticos, agroquímicos
Alquilfenóis Produtos de degradação dos APEOs (ex: nonilfenol, octilfenol), anti-oxidantes PCBs / dioxinas Fluidos para refrigeração / subprodutos da
combustão Ésteres ftalatos Plastificantes
Fitoestrogênios Ocorrência natural em plantas
Bisfenol A Produção de polímeros, degradação de plásticos (policarbonatos)
3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos
2004) ou de cromatografia gasosa (Wang et al. 2005; Yang et al. 2006). Em ambos os casos, a quantificação dos perturbadores endócrinos nas concentrações ambientais é normalmente feita com espectrômetros de massa, dada à sua elevada especificidade. Outro método de análise baseado em técnicas enzimáticas ou bioensaios também têm sido estudados, todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do método tem favorecido o uso das técnicas cromatográficas na análise de perturbadores endócrinos (Farré et al. 2007)
Basicamente, a determinação dos PE em amostras aquosas envolve três etapas: amostragem, pré-concentração e análise. Para a determinação de perturbadores endócrinos é necessário usar critérios analíticos rigorosos para que as várias etapas, como amostragem, transporte, estocagem e análise, tenham o menor erro possível, tendo em vista a baixa quantidade dos PE (µg.L-1 a ng.L-1) nas amostras ambientais (Liu et al. 2004b). A Figura 3.5 mostra um diagrama simplificado do protocolo de análise dos PE.
Figura 3.5 - Diagrama esquemático para preparação e análise dos perturbadores endócrinos
Amostragem, filtração e ajuste de pH
o procedimento de extração e concentração. O tempo máximo recomendado entre a coleta e a extração é de 48 horas (Fountoulakis et al. 2005; Wang et al. 2005), sendo a coleta feita em frascos de cor escura uma vez que alguns estrogênios, como estradiol, podem ser foto-degradados (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005).
A quantidade de água coletada pode variar de acordo com as propriedades intrínsecas da água analisada, tipo de composto, método de extração e aparelho utilizado para quantificação. Aparelhos com grande sensibilidade, águas com nível alto de poluição e alguns métodos de extração como a microextração por fase sólida (SPME) geralmente necessitam de pouca quantidade de amostra (Yang et al 2006). Contudo, para a maioria dos casos é necessária uma quantidade maior de água, que normalmente varia de 250 a 1000 mL (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005). Como exemplo, Lagana et al (2004) fizeram análise de perturbadores endócrinos em diferentes matrizes, e o volume de amostra variou de 110 mL para esgoto bruto a 1000 mL para água de rio.
Após coletada a amostra, a primeira etapa de preparação consiste na sua filtração. A filtração tem a finalidade de retirar os sólidos presentes na água, evitando assim o comprometimento (entupimento e queda na taxa de filtração) da etapa posterior de concentração em cartuchos de extração em fase sólida. Embora a maioria das membranas utilizadas e citadas na literatura seja de acetato de celulose, recomenda-se a utilização de membranas de materiais mais inertes (teflon, fibra de vidro, nylon) para evitar a adsorção de perturbadores durante a etapa de filtração. As membranas mais utilizadas na filtração são de 0,45µm feitas de acetato de celulose. Etapas preliminares de filtração, como a utilização de filtros de 8µm, podem ser necessárias dependendo da quantidade de sólidos presentes na água. Isso é particularmente importante durante a amostragem de água de mananciais superficiais durante períodos chuvosos.
Em seguida é feito o ajuste do pH da amostra, que tem como finalidade aumentar a afinidade dos perturbadores endócrinos, principalmente aqueles de caráter ácido como nonilfenol, bisfenol e estrona, pela fase estacionária do cartucho de extração, aumentando assim sua extração da fase aquosa (Raimundo 2007). De fato, Liu
variando entre 2 e 3, sendo 3 o valor de pH mais utilizado (Gibson et al. 2007; Wang et
al. 2005). Os ácidos mais utilizados para a correção do pH são o clorídrico (HCl) ou o sulfúrico (H2SO4).
Concentração e eluição dos compostos de interesse
Os PE são, em sua maioria, compostos orgânicos hidrofóbicos encontrados em baixas quantidades no ambiente, e como a maioria dos equipamentos não consegue detectá-los nas concentrações usualmente encontradas, uma etapa de concentração é usualmente necessária (Ghiselli e Jardim 2007). Atualmente existe um considerável interesse no desenvolvimento de novos métodos seletivos para extração e isolamento dos componentes de matrizes ambientais complexas (Kasprzyk-Hordern et al. 2007). A seletividade da fase estacionária é um importante parâmetro, uma vez que um dos principais objetivos seria remover os interferentes e facilitar as análises posteriores feitas nos equipamentos de LC-MS e CG-MS (Mozaz et al. 2007). A alternativa mais utilizada para contornar esses problemas tem sido a extração em fase sólida (Solid
Phase Extration - SPE). A SPE é uma técnica de separação líquido-sólido que, do ponto de vista prático, pode ser descrita como uma cromatografia líquida, onde se usa uma pequena coluna aberta, denominada cartucho de extração, que contém a fase sólida (o correspondente à fase estacionária em cromatografia).
No procedimento de extração a amostra contendo o analito de interesse é colocada no topo do cartucho e aspirada através dele pela aplicação de um pequeno vácuo. Ao passar a amostra pelo cartucho o analito fica retido (adsorvido) na fase sólida, de forma a ser posteriormente eluído com um pequeno volume de solvente, e essa etapa de eluição permite a determinação do grau de concentração necessário para a análise uma vez escolhido o volume inicial de amostragem e o volume final de solvente eluído. Se houver contaminantes que possam interferir na análise, uma lavagem e/ou
Figura 3.6 - Etapas da extração por fase sólida para isolamento de compostos de interesse (Lanças 2004a)
Atualmente um grande número de cartuchos de SPE está disponível de modo que possa ser utilizado por uma grande faixa de aplicações. Um adsorvente genérico é capaz de adsorver uma grande variedade de PE, mas alguns compostos específicos exigem cartuchos mais seletivos. O mecanismo mais utilizado é a interação hidrofóbica e as fases sólidas mais reportadas nos trabalhos são as compostas de octadecil (C18) e sílica. A Tabela 3.4 mostra os cartuchos mais utilizados na extração por fase sólida para os perturbadores endócrinos nonilfenol e estradióis.
Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes
Cartuchos Descrição Fabricante Oasis HLB Poli(divinilbenzeno-co-N-vinilpirrolidona) Waters
C18 Polimericamente ligado, octadecil (18% C) Vários C18/ENV+ C18 hidroxilado poliestireno-divinilbenzeno IST
Liu et al (2004b) fizeram um estudo a respeito da eficiência de recuperação dos PE em relação ao tipo de cartucho SPE. A conclusão obtida foi que o melhor cartucho para adsorção de alquilfenóis e estrogênios é o conhecido como Oasis HLB 500mg. O maior inconveniente na utilização deste tipo de cartucho é o preço, cerca de cinco vezes superior aos cartuchos de eficiência de recuperação semelhante, como o DSC-18. Dessa forma, fases estacionárias compostas de octadecil (C18) possuem melhor relação custo-benefício.
estradiol natural, etinilestradiol e nonilfenol devido ao grande volume de amostra utilizado, que chegou a 5 litros com uma pré concentração de 5000 vezes.
Uma das soluções apresentadas seria a microextração por fase sólida (SPME), a qual possui as mesmas funcionalidades da SPE e reduz consideravelmente a quantidade de amostra e tempo de extração para análise. Yang et al (2006) compararam as metodologias SPME e SPE e os resultados obtidos mostraram que a SPME é bastante promissora para a análise de estrogênios, anabolizantes e alquilfenóis, sendo possível utilizar apenas 3mL de amostra para obter fatores de concentração de 100 vezes. Recentemente, Wang et al (2008) criaram um método alternativo de extração utilizando filtros de cigarro como cartuchos de SPE. Uma vez que os filtros de cigarro são utilizados para a retenção de parte dos poluentes orgânicos gerados pela fumaça, avaliou-se a capacidade destes em reter alguns PE como o estradiol. Uma das grandes vantagens seriam o baixo custo e a facilidade de aplicação. Os resultados obtidos chegaram a 100% de recuperação do estradiol para amostras do rio monitorado.
A eluição do cartucho, ou seja, a dessorção dos compostos de interesse vai depender do tipo de composto a ser analisado. Trabalhos publicados utilizam geralmente metanol, acetato de etila e acetona, puros ou misturados, como agentes de eluição (Alda e Barceló 2001; Gibson et al. 2007; Laganà et al. 2004; Wang et al. 2005). É importante destacar que a eluição é normalmente feita com um volume maior de solvente (5 a 15 ml) para assegurar a completa dessorção dos analitos de interesse. Desta forma, para se obter um elevado grau de concentração é preciso secar o extrato orgânico e re-solubilizar o analito em volume adequado de solvente.
Além de obter o grau de concentração adequado, a secagem permite ainda adequar o solvente ao método de análise tendo em vista que o solvente utilizado na eluição pode ser incompatível com o equipamento cromatográfico. Um exemplo é o diclorometano, que não é recomendado para análises em cromatografia líquida devido a sua alta volatilidade, mas que foi utilizado (junto com o metanol em solução 1:1) por Laganà et al (2004) para a eluição de fitoestrogênios, micoestrogênios, estrogênios e alquilfenóis.
utiliza-se acetonitrila e metanol como solventes de reconstituição, ao passo que para cromatografia gasosa é comum o uso de solventes mais voláteis como acetona e acetato de etila (Jeannot et al. 2002). Outros métodos analíticos, como a utilização de kits enzimáticos, exigem a reconstituição em soluções tampão de fosfato (Farré et al. 2007).
Análise Instrumental
Do ponto de vista analítico, os métodos mais adequados para monitoramento dos PE em amostras ambientais incluem, genericamente, métodos biológicos e métodos de separação (Farré et al. 2007). Dentre os métodos biológicos destacam-se, principalmente, os imunoensaios, cujos princípios são a produção de anticorpos e/ou receptores que se ligam especificamente a substâncias que apresentam atividade estrogênica. A Figura 3.7 exemplifica os dois passos genericamente associados aos imunoensaios. Inicialmente ocorre a imobilização do receptor específico a um suporte, seguido de adição da amostra contendo estrogênios e anticorpos, ocorrendo então um período de incubação, que varia de 1 a 4 horas. Em seguida, por adição de uma solução adequada ao tipo de detecção pretendida, procede-se à quantificação por medidas de fluorescência ou isotópicas (Ex. ELRA: "Enzyme Linked Receptor Assay"; ELISA: "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay"; RIA: "Radio Immuno Assay") (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003).
Figura 3.7 - Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A) Imobilização do receptor específico ao suporte, seguido de incubação após a adição da amostra contendo estrogênios e de anticorpos; B) Adição da solução adequada ao tipo de detecção pretendida (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003).
Os métodos cromatográficos implicam em interações fisico-químicas entre os compostos presentes na amostra e a coluna cromatográfica, e sua aplicação permite a análise qualitativa ou quantitativa de vários microcontaminantes de interesse ambiental. A cromatografia permite separar constituintes de uma mistura através de sua distribuição em duas fases: uma estacionária (fixa na coluna cromatográfica) e outra móvel. A cromatografia acoplada à espectrometria de massas, seja líquida ou gasosa, apresenta-se como a técnica analítica mais robusta, abrangente, reprodutível e sensível, para o monitoramento de amostras ambientais. A instrumentação disponível combina baixos limites de detecção e reprodutibilidade analítica através do monitoramento de íons pré-selecionados.
estudo comparando os três compostos e mostrando que o MTBSTFA é mais seletivo e o MSTFA o mais reativo. Apesar da derivatização ser mais comum quando se usa cromatografia gasosa, Matsumoto et al (2002) utilizaram o anidrido de pentafluorpropionil (CDPP) em cromatografia líquida, reduzindo assim os limites de detecção para os estradióis analisados. As desvantagens do procedimento de derivatização estão relacionadas ao maior trabalho laboratorial para preparo das amostras, ao maior tempo de análise, e à possibilidade de perdas de analito, uma vez que a baixa eficiência da hidrólise dos conjugados a estrogênios livres, via derivatização, pode compor erros nos estágios de recuperação, extração e quantificação. Tais desvantagens têm dado mais popularidade à cromatografia líquida para a determinação de estrogênios (Reis Filho et al. 2006) e outros contaminantes ambientais pouco voláteis.
A cromatografia líquida tem várias vantagens para análise de compostos orgânicos em água, e uma delas refere-se ao fato de os compostos voláteis serem apenas uma pequena fração de poluentes usualmente presentes em água e esgotos. De fato, a maior parte dos perturbadores endócrinos não é volátil, tornando a cromatografia líquida a técnica mais adequada para sua análise. Isto é especialmente verdade para esgotos, os quais contêm muito material húmico e compostos orgânicos polares, tais como os carboidratos. Vários detectores podem ser acoplados à cromatografia líquida, tais como ultravioleta-visível, arranjo de diodos, fluorescência e espectrômetro de massas (Alda e Barceló 2001; Mao et al. 2004; Matsumoto et al. 2002; Raimundo 2007; Solé et al. 2000; Wang et al. 2008).
Os detectores de arranjo de diodos e fluorescência são menos utilizados como alternativas devido a sua especificidade, mas são poderosas ferramentas adicionais para análise ou confirmação de alguns grupos específicos de PE (Mozaz et al. 2007). Conforme mencionado anteriormente, a detecção de perturbadores endócrinos por espectrometria de massas (MS) tem sido a técnica preferida pela comunidade científica devido à sua elevada sensibilidade, reprodutibilidade, abrangência e robustez. A instrumentação atualmente disponível combina a diminuição dos limites de detecção e excelente reprodutibilidade analítica e elevada seletividade seja no modo de varredura (modo Full-SCAN), seja através do monitoramento de íons selecionado (modo SIM) (Hu et al. 2005; Liu et al. 2004b).
ensaios de imunoextração que consistem no isolamento seletivo de classes restritas de PE de amostras ambientais com a utilização de "immunosorbents", que seria uma SPE contendo anticorpos muito específicos na constituição da fase estacionária. Os compostos de interesses que ficariam retidos na fase estacionária seriam analisados por cromatografia. Atualmente pouco se desenvolveu neste tipo de técnica, mas a expectativa para a criação ainda existe, pois o desenvolvimento de uma metodologia de alta especifidade onde baseia-se em reações enzimáticas é possível. A principal vantagem deste método estaria na minimização de interferentes durante a análise cromatográfica.
3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais
A Tabela 3.5 resume resultados disponíveis na literatura do monitoramento de três perturbadores endócrinos encontrados em águas superficiais: um estrogênio natural (17β-estradiol ou E2), um estrogênio artificial (17α-etinilestradiol ou EE2) e um produto da degradação dos surfactantes alquilfenóis etoxilados (nonilfenol ou NP), que foram escolhidos pelo potencial de risco aos seres vivos e pela freqüência com que foram reportados em trabalhos nacionais e internacionais.
O 17β-estradiol (conhecido também como estradiol ou pela sigla E2) é um hormônio natural que nas mulheres é responsável pela síntese de estrogênio circulante. Esses estrogênios são naturalmente e diariamente excretados na urina humana e, assim, descartados no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). O 17α -etinilestradiol ou -etinilestradiol é um dos estrogênios sintéticos mais usados como contraceptivos orais (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). Os alquilfenóis, por sua vez, apresentam uma variedade de aplicações, incluindo detergentes industriais e domésticos, lubrificantes, emulsificantes, formulações de pesticidas, de tintas, bem como produtos de higiene pessoal (maquiagem, cremes de pele, produtos para cabelo e banho). Nas ETEs e mananciais, os alquilfenóis polietoxilatos (APEOs) são inicialmente biodegradados, derivando em metabólitos persistentes e altamente lipofílicos que incluem os alquilfenóis etoxilatos e, finalmente, os alquilfenóis, tais como nonilfenol (NP) e octilfenol (OP).
comuns para tal finalidade. Os resultados compilados mostram ainda que as técnicas de cromatografia (tanto gasosa como líquida) acopladas à espectrometria de massas são as mais utilizadas, sendo usada ainda, em menor freqüência, cromatografia acoplada a detector de arranjo de diodos ou a detector de fluorescência. Quando a cromatografia gasosa é utilizada percebe-se que a derivatização por reações de silanização é preferida e que os reagentes mais utilizados para tanto são o MTBSTFA, o MSTFA e o BSTFA. As técnicas preferidas pelos pesquisadores resultam em limites de detecção na ordem de 0,15 a 2,0 ng.L-1 para os PE investigados. Valores baixos de limite de detecção dependerão do tipo de equipamento utilizado e volume de amostragem, e todas as técnicas de análise listadas na Tabela 3.5 resultam em limites de detecção semelhantes.
A Tabela 3.5 mostra que para amostras de rios e mananciais o estradiol (E2) e o nonilfenol (NP) são os compostos frequentemente presentes, sendo o etinilestradiol (EE2) sempre presente em menor quantidade. Em esgotos domésticos in natura, os compostos E2 e EE2 foram encontrados com mais freqüência que o NP. Um dos possíveis fatores é a maior degradação/adsorção dos alquilfenóis ao longo da rede de coleta. A Tabela 2.5 mostra ainda que apenas o trabalho de Beck et al (2005) investigou a presença de PE em água marinha. As amostras foram coletadas em um estuário próximas da ETE municipal de uma cidade alemã com 90.000 habitantes. Os valores médios encontrados para EE2 e NP foram de 17,9 e 6,3 ng.L-1, respectivamente.
