Estabilidade

A estabilidade das amostras e padrões foi verificada em termos de temperatura e tempo. Nesse trabalho foi construída uma curva analítica com novos padrões a cada análise e os extratos eluídos das amostras foram analisados em um período máximo de

15 dias. Além disso, todos os padrões e amostras foram conservados em freezer a -20ºC e protegidos da luz, envoltos em papel alumínio.

A estabilidade dos padrões foi analisada com cinco soluções contendo os três compostos de interesse em concentrações de 5 a 400 μg.L-1 em três momentos diferentes: logo que o padrão foi preparado; depois de 1 mês de preparo; 24 horas após ter sido analisado, porém tendo ficado a temperatura e luz ambiente. A estabilidade das amostras foi avaliada através da análise do extrato da amostra do Rio das Velhas na primeira campanha amostral em três momentos: imediatamente após ter preparado o extrato; após 1 e 6 meses que o extrato foi preparado e mantido sob as condições de preservação (freezer a -18°C).

4.2.2. Seletividade

A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medição pelo detector selecionado, sem causar um sinal visível no teste de especificidade. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito também pode depender da sua concentração (INMETRO 2007).

A seletividade do método cromatográfico foi determinada por meio da avaliação da pureza dos picos cromatográficos obtidos, tanto para os padrões como para os compostos presentes nas amostras, comparando-se os espectros de massas obtidos para os padrões empregados na calibração do LC/MS com amostras que continham os compostos. A avaliação foi feita por meio dos íons primários (ms1) e secundários (ms2) obtidos para cada composto, portanto uma maneira segura de diferenciar o composto analisado de um interferente presente na matriz (IMMETRO 2007; Ribani et al. 2004).

4.2.3. Curva analítica

A quantificação dos compostos de interesse nas amostras ambientais foi obtida por padronização externa e interna. A padronização externa foi utilizada para a quantificação de NP, enquanto que para E2 e EE2 foi utilizado esse método apenas durante os meses de fevereiro a junho de 2007. A determinação por padronização interna foi utilizada a partir do mês de julho/2007 para E2 e EE2 com o objetivo de minimizar os interferentes da matriz para o efeito supressivo.

O método de padronização externa compara a área da substância a ser quantificada na amostra com as áreas obtidas com soluções de concentrações conhecidas preparadas a partir de um padrão. Preparam- se soluções da substância a ser quantificada em diversas concentrações; obtém-se o cromatograma correspondente a cada uma delas e, em um gráfico, relacionam-se as áreas obtidas com as concentrações. Utilizando este gráfico ou a equação da curva resultante, pode-se calcular a concentração desta substância na amostra a partir da área da substância obtida no cromatograma resultante de uma injeção separada (Ribani et al. 2004).

O método de padronização interna consiste na preparação das soluções padrão de concentrações conhecidas da substância de interesse, às quais se adiciona a mesma quantidade conhecida de um composto chamado padrão interno. Após análise dessas soluções, constrói-se um gráfico, relacionando a razão de áreas (área da substância/ área do padrão interno que tem concentração constante) com a concentração (variada) da substância. A amostra também é analisada após a adição da mesma quantidade conhecida do padrão interno. Através da razão de áreas obtidas no cromatograma tem-se a concentração da substância na amostra. Idealmente, a substância usada como padrão interno deve ser similar à substância a ser quantificada, ter tempo de retenção próximo a esta substância, não reagir com a substância ou outro componente da matriz, não fazer parte da amostra (Ribani et al. 2004).

Usualmente, para adequar-se aos critérios de um padrão interno ideal, são escolhidos os compostos deuterados dos analitos de interesse. Devido à dificuldade de obtenção e o alto custo de aquisição, essa opção tornou-se inviável para o desenvolvimento do método. Como solução, foi proposto o uso da fenolftaleína (Figura 4.6). A fenolftaleína possui estrutura semelhante, em alguns aspectos, aos perturbadores endócrinos estudados. Além disso, a fenolftaleína é estável, altamente sensível ao método e não foi detectada nas amostras coletadas.

O

O

OH HO

Durante as análises de LCMS, o padrão interno obteve um comportamento semelhante aos estrogênios para o efeito supressivo (será discutido posteriormente), o que tornou possível o seu uso durante o monitoramento dos estrogênios em água. Para o NP não foi detectado efeito supressivo, portanto não foi necessário o uso de um padrão interno.

As soluções padrão foram preparadas a partir de uma solução mais concentrada (1000 mg.L-1) obtida pela pesagem do padrão (solução estoque) e as soluções de trabalho foram preparadas por diluição direta da solução estoque. Todas as soluções foram preparadas em metanol (grau HPLC, J.T. Baker). A fenolftaleína foi adicionada após todo o processo de preparação das amostras a uma concentração de 50 µg.L-1 em todos os vials. Um branco também foi feito injetando-se 5 µL de metanol.

Por fim, foram também determinados os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) do método. O limite de detecção representa a menor quantidade do composto de interesse que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada como um valor exato. Já o limite de quantificação corresponde à menor quantidade do composto de interesse que pode ser quantificada com exatidão, utilizando-se um determinado procedimento experimental (Lanças, 2004b). Ambos os limites podem ser determinados de 3 maneiras diferentes: empregando-se o método visual, o método da relação sinal- ruído e o método baseado nos parâmetros da curva analítica. Dentre os métodos apresentados, o que apresentou resultados mais satisfatórios foi o baseado nos parâmetros da relação sinal/ruído.

Para determinar o LD e LQ através da relação sinal-ruído, é feita a comparação entre a medição dos sinais de amostras em baixas concentrações conhecidas do composto de interesse na matriz e um branco destas amostras. Assim, é estabelecida uma concentração mínima na qual a substância pode ser facilmente detectada. A relação sinal-ruído geralmente aceitas para LD e LQ são de 3:1 e 10:1 repectivamente como são expressos pelas equações 1 e 2:(Ribani et al. 2004)

LQ: N/R > 10 (1) LD: N/R > 3 (2)

onde: N é a intensidade do sinal obtido pelo composto com uma concentração conhecida. R é o ruído gerado pelo mesmo composto quando não está presente (branco).

Segundo Ribani et al (2004), o método mais utilizado para a determinação dos LD e LQ é o da relação sinal-ruído para técnicas analíticas em geral. Assim sendo, o

melhor caminho para resolver o problema de cálculo destes limites foi utilizar o método descritos nas equações 1 e 2. Neste trabalho ambos os limites de detecção e quantificação foram determinados e calculados usando os softwares LCMS Solutions, Microsoft Excel e Microcal Origin.

4.2.4. Linearidade e Sensibilidade

  A faixa linear de trabalho de um método de ensaio é o intervalo entre os níveis inferior e superior de concentração do analito no qual foi demonstrado ser possível a determinação com a precisão, exatidão e linearidade exigidas, sob as condições especificadas para o ensaio. A faixa linear é definida como a faixa de concentrações na qual a sensibilidade pode ser considerada constante. A faixa linear é normalmente expressa nas mesmas unidades do resultado obtido pelo método analítico (Lanças 2004b).

Nesse trabalho, a linearidade foi obtida por padronização externa, e de acordo com a resolução do INMETRO um valor de coeficiente de correlação (r) maior que 0,90 é aceitável. A sensibilidade foi expressa pelo coeficiente de inclinação da curva de calibração e avaliando simultaneamente o intervalo onde ocorre uma variação linear entre a concentração do analito e a área obtida.

4.2.5. Precisão

A repetitividade é geralmente dependente da concentração do analito e, deste modo, deve ser determinada para um diferente número de concentrações. O coeficiente de variação (CV%) pode ser mais útil neste caso, pois foi normalizado com base na concentração e deste modo ele é praticamente constante ao longo da faixa de interesse, contanto que esta não seja muito grande (INMETRO 2007). O Coeficiente de Variação é calculado de acordo com a equação 3:

CV = DP/CMD x 100 (3)

Onde:

DP = desvio padrão;

A precisão foi avaliada em termos de repetibilidade através do cálculo da estimativa do DP e do CV para um número de sete repetições para duas concentrações diferentes, onde são aceitos CV de até 20 % (INMETRO 2003).

4.2.6 Ensaio de Supressão

Uma variável acrescentada para avaliar a resposta de espectrômetros de massas é o teste de supressão. O teste de supressão é utilizado para determinar se a presença de interferentes na amostra alteram a área cromatográfica dos compostos de interesse. Isso pode resultar em uma diminuição da intensidade dos íons dos compostos de interesse na amostra real fazendo com que seja necessária a correção dos dados para uma melhor exatidão dos resultados (Villagrasa et al. 2007).

O ensaio de supressão, feito em triplicata, consistiu na adição de uma concentração de 20µg.L-¹ de, E2 e EE2, e de 50 µg.L-¹ de ambos, NP e fenolftaleína na amostra real após ela ter sido submetida a todo o processo de preparação (entre o item 10 e 11 da Figura 3.1). Se não houver efeito supressivo, a diferença de área observada entre a amostra fortificada com o padrão e a amostra original (sem a adição do padrão) deve ser igual a área obtida pelo padrão de mesma concentração. Sendo assim, a porcentagem de supressão é calculada pela equação 4.

Fator de Supressão (%) = (1 – [(Af – Am) / At]) x 100 (4)

Onde:

Af = Área do composto de interesse na amostra fortificada após todo o processo de

extração e eluição (no vial);

Am = Área da amostra sem a fortificação (branco)

At = Área teórica em relação à quantidade de padrão adicionado a amostra. Calculado

pela curva de calibração.

4.2.7. Ensaio de recuperação

Os ensaios de recuperação foram utilizados para averiguação da precisão e exatidão do método. O ensaio de recuperação constitui-se no método mais utilizado para validação de processos analíticos (Lanças 2004b).

A recuperação está relacionada com a exatidão, pois reflete a quantidade de determinado analito, recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na amostra. A exatidão é expressa como erro sistemático percentual, inerente ao processo. O erro sistemático ocorre pela perda da substância devido à baixa recuperação da extração, medidas volumétricas imprecisas ou substâncias interferentes na amostra.

Segundo o INMETRO, o índice de recuperação é calculado da seguinte forma (equação 5):

Recuperação (%) = [(C1- C2) / C3] x 100 (5)

onde:

C1 = concentração determinada na amostra fortificada;

C2 = concentração determinada na amostra não fortificada;

C3 = concentração adicionada.

Neste trabalho, os ensaios de recuperação foram avaliados usando 9 determinações, cada qual usando 3 níveis de concentrações, com triplicatas em cada nível. As concentrações preparadas foram de 20, 100 e 200 ng.L-1 para E2 e EE2 e 300 ng.L-1 para NP.

A faixa escolhida para os estrogênios coincide com a faixa de trabalho utilizada (próximo ao LD, concentração média e máxima da curva de calibração). Isso foi possível devido a ausência de tais compostos nas amostras. Diferentemente para o NP, onde não foi possível a determinação a baixas concentrações (20 e 150 ng.L-1), pois o alquilfenol esteve presente sempre em valores acima de 200 ng.L-1 durante os testes de recuperação, impossibilitando a determinação do índice de recuperação com valores abaixo de 300 ng.L-1.

As amostras utilizadas para o ensaio foram coletadas na entrada da ETA Morro Redondo totalizando 12 amostras, já que é necessário observar as concentrações dos PE na, amostra, anteriores à adição. Os intervalos aceitáveis de recuperação para análise de compostos em concentrações-traço estão entre 70 e 120 %, segundo Wang et al, (2005).