Análise da atividade enzimática

A atividade enzimática após a amostra atingir a fase isotérmica (a temperatura de estudo desejada) foi considerada a atividade enzimática inicial (tempo zero). Isto foi necessário pois os modelos cinéticos são aplicados somente em condições isotérmicas.

As análises das atividades enzimáticas da POD e da PPO foram baseadas nos métodos colorimétricos de Chisari, Barbagallo e Spagna (2007) e de Walker (2001), respectivamente. Para o preparo do extrato enzimático utilizado na análise da atividade enzimática das duas enzimas, foram misturados em vortex (agitador de soluções Phoenix, modelo AP-56) uma parte de caldo de cana para quatro partes de solução tampão fosfato 0,05 M com pH 7,0. A temperatura da mistura foi mantida abaixo de 4°C. O extrato enzimático, previamente agitado em vortex, foi centrifugado por 10 min a 4°C a 6.000 rpm (4.757 g) em centrífuga refrigerada (CIENTEC, modelo CT-5000R, Brasil) e filtrado em papel filtro qualitativo.

4.4.1 Peroxidase (POD)

Para a análise da atividade de POD, foi feita a leitura em espectrofotômetro (PG Instruments, modelo T80 UV/VIS) a 460 nm com cubetas contendo 1,5 mL de solução tampão fosfato 0,1 M pH 5,0, 1 mL de extrato enzimático, 0,2 mL de solução 1% de peróxido de hidrogênio e 0,5 mL de solução de guaiacol 1,5% (ou 0,5 mL de água destilada para o branco). As cubetas foram ambientadas a 25 °C antes da realização das leituras. É importante destacar que o substrato (guaiacol) foi adicionado à cubeta já dentro do espectrofotômetro e teve agitação provocada pela sucção/liberação de volume da mistura através da ponteira da pipeta imediatamente antes do início da leitura.

A mudança da coloração foi monitorada a cada 20 segundos durante 3 minutos na primeira etapa do trabalho. A partir da segunda etapa, devido às maiores atividades enzimáticas da amostra in

natura quando comparadas ao caldo da primeira etapa, a leitura foi realizada a cada segundo

durante 50 segundos. As análises foram realizadas em duplicata para cada ponto, sendo que quando o erro obtido foi maior do que 5%, a análise foi repetida pela terceira vez.

Uma vez que muitas enzimas não se encontram na sua forma pura, não é possível quantificá- las, então os resultados são expressos em termos de unidades de atividade enzimática (UAE), definidas arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de aumentar 0,001 unidade de absorbância por minuto nas condições mencionadas (Lupetti, Ramos e Fatibello-Filho, 2003). Neste sentido, a atividade enzimática, denominada A, foi determinada a partir da variação na absorbância por minuto (Δabs/min) e dividida por 0,001; para tanto, foi utilizada somente a parte linear da curva, usando regressão linear (Saxena et al., 2016).

A atividade enzimática residual (A/A0 - para o tempo t e 0, respectivamente) em função do tempo de processamento a diferentes temperaturas de processamento foram ajustadas para vários modelos (Tabela 3.6), utilizando regressão não-linear (Statistica versão 12.0, StatSoft, Inc. Tulsa, OK).

Para caracterização do caldo de cana e para melhor discutir os resultados, foram realizadas análises de temperatura ótima e pH ótimo da POD do caldo de cana do terceiro lote (resultados apresentados no terceiro artigo).

a) Temperatura ótima: a atividade da POD do caldo in natura foi determinada nas temperaturas de 11, 20, 30, 40, 50 e 60 ° C em tampão fosfato 0,1 M pH 5,0. Foi utilizado o mesmo protocolo de antes, com uma pequena diferença: o tampão e os substratos (guaiacol 1,5% e peróxido de hidrogênio 1%) foram pré-incubados durante 5 minutos na temperatura de análise e, em seguida, adicionou-se o extrato enzimático. As análises foram realizadas em um espectrofotômetro com controle de temperatura (Espectrofotômetro Shimadzu UV-1800 com controlador CPS, modelo 240A, Kyoto,

Japão), em triplicata, no Laboratório de Equipamentos Especiais do Instituto de Ciências e Tecnologia de Alimentos (ICTA) da UFRGS.

b) pH ótimo: a atividade da POD foi determinada em tampões fosfato-citrato 0,4 M na faixa de pH de 3,0 a 7,5, com intervalos de 0,5 unidade. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro (PG Instruments, modelo T80 UV/VIS) a 25 °C sob condições padrão como descrito acima, mas utilizando todas as soluções tamponadas no respectivo pH. As análises foram realizadas em triplicata, na Central Analítica do Departamento de Engenharia Química.

4.4.2 Polifenoloxidase (PPO)

De maneira muito semelhante à realizada para a POD, a análise da atividade da PPO, deu-se com cubetas contendo 2,2 mL de solução tampão fosfato 0,05 M pH 7,0, 0,5 mL de extrato enzimático e 0,3 mL de solução de catecol 0,6 M (ou 0,3 mL de água destilada para o branco). A absorbância da reação foi lida a 420 nm em espectrofotômetro. As cubetas foram ambientadas a 25 °C antes da realização das leituras.

O catecol foi adicionado à cubeta já dentro do espectrofotômetro e teve o mesmo tipo de agitação do que a POD. A mudança da coloração foi monitorada a cada 20 segundos durante 3 minutos. O cálculo da atividade da polifenoloxidase foi realizado de forma semelhante ao descrito no item 4.4.1

4.4.3 Pectinametilesterase (PME)

As análises da atividade enzimática de PME, assim como da pectinase total, foram realizadas no Laboratório de Biocatálise e Tecnologia Enzimática, no ICTA / UFRGS. A atividade de PME foi determinada pela titulação dos grupos carboxílicos liberados pela desesterificação da pectina, conforme descrito por Rouse e Atkins (1952). Primeiramente, adicionaram-se 9,95 mL substrato que contém pectina, na concentração de 5 g/L, diluída em tampão de NaCl pH 4,5 (0,15 mol/L), em copo de béquer. Após, colocou-se 0,05 mL de caldo de cana e se incubou sob agitação por 10 minutos a 30 °C. Passado o tempo de reação, titulou-se o extrato enzimático com NaOH (0,02M) até atingir um pH final de 4,5. Com o volume gasto de NaOH, calculou-se a quantidade de PME (mg/mL) necessária para liberar 1 miliequivalente de grupos carboxil por minuto, e expressa em unidades/mL, de acordo com a equação 4.1:

𝑈 (𝑚𝑔_𝑚𝐿) = 𝑉𝑇 × 𝑀𝑁𝑎𝑂𝐻 × 𝑉𝑅 × 𝐹𝐷

onde VT é o volume da titulação em mL, MNaOH é a concentração molar de NaOH, VR é o volume da reação em mL, FD é o fator de diluição, t é o tempo da reação em minutos e VE é o volume da

amostra.

4.4.4 Pectinase total

A atividade enzimática das pectinases foi medida pela hidrólise da pectina, através do método descrito por Miller (1959), que mede a liberação de grupos redutores devido à degradação da pectina. Os açúcares redutores foram quantificados pelo método DNS. Adicionou-se 0,9 mL de substrato contendo pectina 0,25% (2,5 g/L) diluída em tampão de citrato de sódio (50 mM, pH 4,8) em tubo de ensaio. Em seguida, incubou-se em banho com agitação a 37 °C e então se adicionou 0,1 mL de caldo de cana in natura, deixando-se agir por, exatamente, 1 minuto. Então, retirou-se o tubo do banho e colocou-se em gelo para interromper a atividade enzimática, juntamente com a ação de 1,0 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). A amostra foi fervida por exatamente 5 minutos, interrompendo-se a reação com banho de gelo. Por fim, agitou-se o tubo em vortex e leu-se a absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 540 nm.

O ponto zero (utilizado para zerar o equipamento) consiste em 1,0 mL de tampão de citrato de sódio, enquanto que o branco se resume a 0,9 mL de substrato e 0,1 mL de tampão de citrato de sódio (ambos também recebem o DNS). Os tubos do ponto zero e do branco foram fervidos juntamente com os tubos da amostra (realizada em triplicata).

Os valores de absorbância podem ser convertidos em concentração (C) através de uma curva de calibração de glicose. Assim, uma unidade de pectinase é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de grupos redutores, expresso em glicose, por minuto, nas condições da reação e expressa em unidades/mL. Essa atividade total da pectinase pode ser calculada por:

𝑈 (𝑚𝑔_𝑚𝐿) = 𝐶 × 𝑣𝑓×𝐹𝐷

𝑡 × 𝑣𝑒 (4.2)

onde C é a concentração de grupos redutores liberados em mg/mL, vf é o volume final da reação em mL, FD é o fator de diluição da amostra, t é o tempo de reação em minutos e ve é o volume de amostra em mL. O valor de C é determinado pela equação da reta da curva de calibração da glicose (equação 4.3). Para o cálculo da atividade em µmol/mL, utiliza-se a equação 4.4.

𝑈(𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑚𝐿⁄ ) =𝑈(𝑚𝑔 𝑚𝐿⁄ )×1000

180 (4.4)