Genoma e inferências filogenéticas
M: Marcador XVI, 250bp (Roche) 1: 015 Dresden (Controlo-EUL 137)
3.1.7 Avaliação do transcritoma de Legionella pneumophila Paris após co-cultura com
3.1.7.2 Análise da expressão génica por PCR em tempo real
Como já foi referido, para a avaliação da expressão génica por PCR-TR foi necessário desenhar os primers para os genes alvo, implementar a técnica de PCR-TR, efetuar a extração do ARN, tratar com DNase e fazer a síntese do ADNc das amostras calibradora e teste.
Analisou a expressão das estirpes LpP (ST1) e E18 (ST100) na fase estacionária, após 1º e 2º ciclos de co-cultura Lp-Ac. As amostras calibradoras foram suspensão na fase exponencial de uma cultura líquida, suspensão na fase estacionária e L.pneumophila após 1º ciclo de co-cultura Lp-Ac, respetivamente.
3.1.7.2.1 Seleção dos genes alvo. Desenho e seleção dos primers
De entre os genes que apresentaram maiores alterações na expressão do ARNm por microarrays, selecionaram-se 17, aqui designados de genes alvo. Dentro destes, nove apresentaram expressão aumentada (lpp94, lpp845, lpp1315, lpp1316, lpp1330, lpp1612b, lpp2092, lpp2607) sete, expressão diminuída, (lpp0972, lpp1170, lpp1177, lpp1293, lpp1340, lpp1900, lpp2694) e dois, não apresentaram variação de expressão (gyrA e lpp3004) e por isso foram usados como genes de referência.
No desenho dos primers para os genes alvo recorreu-se ao programa Primer Express versão 3.0, presente no software do 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
Para a seleção dos primers, de entre os vários que foram obtidos procedeu-se, numa primeira fase, ao estudo da especificidade teórica, utilizando o genoma da estirpe LpP (Subject ID- gi|54295983|ref|NC_006368.1)e o programa basic local alignment search tool disponível em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
Os critérios utilizados nesta análise foram: o primer apresentar 100% de homologia apenas com o gene alvo e na extremidade 3’ não haver homologias com outras regiões do genoma da LpP em mais de 50% do tamanho do primer.
Numa segunda fase, os pares de primers que passaram a primeira fase foram analisados, utilizando o programa Gene Runner versão 3.01, quanto à possibilidade de formação de estruturas secundárias (Dímers; Hairpins; Internal loops; Bulge loops) intra e inter cadeias Forward e Reverse. Foram ainda avaliados os valores de energia livre das ligações formadas (valores positivos indicam baixa estabilidade da ligação).
Numa fase posterior, os primers que ultrapassaram as análises anteriores foram submetidos ao BLASTN, para avaliar possíveis homologias teóricas com o genoma completo da A. castellanii (Subject ID - gi|11467047|ref|NC_001637.1|).
Maria de Jesus Chasqueira
94
3.1.7.2.2 Extração do ARN, tratamento com DNase e síntese do ADNc
Na extração do ARN das amostras, calibradora e teste (Figura 29), optou-se por utilizar uma técnica mista que combinou a extração manual com trizol e a purificação por coluna com o PureLink TM RNA Mini kit (Invitrogen), com o objetivo de aumentar o rendimento. O procedimento usado foi o recomendado pelo fabricante.
No tratamento com DNase utilizou-se a TUBO DNA free TM kit (Ambion). O procedimento usado foi o do fabricante com dois pontos de otimização: o volume de DNase foi triplicado, realizando-se dois ciclos de incubação de 30 minutos e em cada um adicionou-se 1,5µL de DNase. O tempo de incubação após a adição do reagente de inativação foi aumentado para o dobro, passando para 10 minutos. A eficácia deste tratamento foi avaliada pela realização de uma sessão de PCR para o gene mip, utilizando o protocolo do SBT (descrito no capitulo 2), e os extratos de ARN tratado e não tratado. Usou-se como controlo positivo ADN de LpP extraído pelo kit InstaGene TM Matrix (Bio-Rad).
Na síntese do ADNc utilizou-se o SuperScript III kit (Invitrogen), segundo o protocolo do fabricante, ao qual se adicionou o p(dN)6 (Roche) para melhorar o rendimento do processo (tal
como no procedimento utilizado na UBBI).
3.1.7.2.3 Otimização do protocolo da PCR em tempo real
A PCR-TR foi realizada no 7500 Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems) utilizando placas de 96 poços (Applied Biosystems), SYBER Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e o programa de amplificação standard ao qual se adicionou uma curva de dissociação (Figura 31).
Figura 31 – Programa da PCR-TR utilizado no estudo da expressão génica de LpP
Cada amostra foi analisada em duplicado, num volume final de 20μL. Para excluir a ocorrência de contaminações nas reações de amplificação foi efetuado um controlo negativo por série de PCR-TR. O protocolo da PCR-TR foi alvo de otimização quanto ao volume de amostra do
Maria de Jesus Chasqueira
95
ADNc e concentração dos primers. O protocolo otimizado foi avaliado quanto à sua reprodutibilidade inter e intra-ensaio, linearidade e eficiência.O estudo da especificidade e sensibilidade dos primers foi efetuado após a otimização do protocolo de PCR-TR.
Na otimização do protocolo:
- Testaram-se os primers gyrA e lpp1316 nas concentrações de 0,2 e 0,4μM, utilizando o ADN de LpP nas concentrações de 5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0005, 0,00005 e 0,000005 ng/μL;
- Testaram-se os volumes de amostra, 2 e 4μL, utilizando os primers gyrA, lpp1330 e lpp1900. Os critérios para a otimização foram o menor valor de Ct e de coeficiente de variação.
3.1.7.2.4 Estudo da especificidade analítica dos primers
Na avaliação da especificidade dos primers utilizaram-se os ADNs de LpP e de A. castellanii, na concentração de 5ng/μL, extraídos pelo kit InstaGene TM
Matrix (Bio-Rad) e o kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), respetivamente.
O critério para a avaliação da especificidade foi a análise das curvas de dissociação e a visualização do tamanho dos amplicões em gel de agarose (1,5%).
3.1.7.2.5 Estudo da sensibilidade analítica dos primers
Na avaliação da sensibilidade dos primers utilizaram-se diluições sucessivas de 10 partindo da concentração de 5ng/μL do ADN de LpP (5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0005, 0,00005, 0,000005 ng/μL). A última concentração equivale ~1 unidade de genoma (UG).
3.1.7.2.6 Estudo da reprodutibilidade da PCR em tempo real
Na avaliação da reprodutibilidade inter-ensaio utilizaram-se os primers gyrA, lpp1316, lpp1900 e testaram-se em triplicado diferentes diluições do ADN de LpP (puro, 1/50; 1/100, 1/1000).
3.1.7.2.7 Estudo da linearidade e da eficiência da PCR em tempo real
Na avaliação da linearidade e da eficiência utilizaram-se os primers gyrA, lpp3004, lpp1612b, lpp1316, lpp1330 e lpp1900 e diluições sucessivas de 10, partindo da concentração de 5ng/μL do ADN de LpP (5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0005, 0,00005, 0,000005 ng/μL).
Para o estudo da linearidade aplicou-se uma regressão linear à relação entre as variáveis Ct versus Log da concentração do ADN.
Para o cálculo da eficiência utilizou-se a equação (68, 233): E = ([10 (–1/declive)] – 1) X 100
Maria de Jesus Chasqueira
96
3.1.7.2.8 Cálculo da expressão génica por PCR em tempo real
Para o cálculo da expressão génica recorreu-se ao método de Livak e Schmittgen ou 2–ΔΔCt que permite a quantificação relativa do gene alvo na amostra teste versus a amostra calibradora (182, 295).
Efetuaram-se três repetições biológicas e cada transcrito foi quantificado em duplicado. Na normalização do Ct de cada transcrito utilizou-se a média geométrica dos dois genes de referência selecionados (gyrA e lpp3004), (291).
Para o cálculo dos valores de expressão génica utilizou-se a seguinte fórmula: ΔΔCt = (Ct (GA 24h) – Ct (GR 24h)) - (Ct (GA 0h) - Ct (GR 0h)) GA 24h = gene alvo na amostra teste (após 24 horas de co-cultura Lp-Ac) GA 0h = gene alvo amostra calibradora (LpP na fase estacionária)
GR 0h = genes referência na amostra calibradora (LpP na fase estacionária)
GR 24h = genes referência na amostra teste (LpP após 24 horas de co-cultura Lp-Ac)
Um resultado positivo é indicativo de um aumento na expressão do gene alvo na amostra teste versus a amostra calibradora, isto é, aumento da expressão do gene após co-cultura Lp-Ac. Um resultado negativo indicia uma diminuição da expressão.
Só foram considerados significativos os aumentos e diminuições de expressão iguais ou superiores a 2 e iguais e inferiores a -2, respetivamente (167, 255).