Tipificação baseada em sequências (SBT) e algoritmos de análise

Atualmente o SBT é internacionalmente reconhecido como o método padrão para caracterizar genotipicamente os isolados de L. pneumophila, pelo que a maioria dos estudos epidemiológicos dos últimos anos utiliza este método (108, 232, 257, 264).

O método apresenta a grande vantagem de a análise dos resultados não ser subjetiva, permitindo que a tipificação dos isolados provenientes de um cluster ou surto possa realizar-se em laboratórios diferentes sem comprometer as conclusões. O SBT baseia-se na sequenciação de fragmentos internos dos genes flaA, pilE, asd, mip, mompS, proA e neuA, variando a zona de análise entre 182 e 473 bp. O método foi padronizado pelo EWGLI e o perfil alélico (ST) do isolado é obtido após submissão das sete sequências a uma base de dados de acesso restrito criada por este grupo europeu (disponível em:

http://bioinformatics.phe.org.uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php).

O SBT baseia-se no MLST mas, ao invés deste, os genes selecionados estão sujeitos a pressão seletiva. Num estudo inicial, Gaia e colaboradores verificaram que dos sete genes escolhidos, o acn, groES, groEL e recA apresentavam menor variação que os outros três (flaA, proA e mompS). Verificaram ainda que o poder discriminante dos três últimos em conjunto (IDS=0,924) era maior que o de cada um individualmente (IDS=0,767 a IDS=0,857) (105). No

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entanto, o valor de IDS ainda era abaixo de 0,95, que como já foi referido, é considerado o valor ideal para um sistema de tipificação. Mas estes autores verificaram que a tipificação usando estes genes em conjugação com os MAbs do painel de Dresden elevava o valor para IDS=0,971 (105). Com o objetivo de melhorar o poder discriminante do método, os quatro genes que apresentavam menor variação foram substituídos pelos genes asd, mip e pilE. Com os seis genes, obtinha-se um IDS=0,943, passando para IDS=0,981 quando o estudo era complementado com os MAbs de Dresden (106). Numa fase posterior, em 2007, o SBT foi alargado a um sétimo gene (neuA). No estudo realizado por Ratzow e colaboradores, este novo gene permitiu dividir em cinco subgrupos os isolados pertencentes ao ST1, o mais prevalente a nível mundial. Esta alteração melhorou o poder discriminante do método, que neste estudo aumentou de D= 0,932 (SBT - seis genes) para IDS=0,963 (SBT - sete genes) (239).

Como já foi referido, o painel é constituído por sete genes e permite estudar isolados de todos os serogrupos da L. pneumophila, embora algumas estirpes pertencentes a outros serogrupos que não o sg1, não sejam amplificadas pelos primers do neuA. Farhat e colaboradores, após sequenciarem numa estirpe do sg5 o locus referente a este gene, verificam que nessa região estava uma variante do gene, que tinha a mesma função mas que apenas apresentava 68% de homologia com o gene neuA. Para ultrapassar o problema e conseguir a amplificação deste gene homólogo (neuAh), os investigadores desenharam outros primers que são utilizados sempre que os iniciais não dão amplificação (86, 203). Persistem, no entanto, algumas estirpes do sg11 que não são amplificadas por nenhum dos pares de primers (neuA ou neuAh) (203).

Como complemento à padronização do SBT, a HPA estabeleceu um programa internacional de avaliação externa de qualidade. Este programa foi distribuído até 2014 pelos centros colaboradores da Europa (incluindo o nosso, na NMS) e por outros laboratórios fora da Europa (Austrália, Canadá, Japão e EUA). Os resultados das sucessivas distribuições mostram uma melhoria crescente na performance dos laboratórios participantes. A reprodutibilidade obtida com este método foi sempre maior do que a verificada em avaliações similares com outras metodologias. O programa de avaliação permitiu não só melhorar o desempenho dos laboratórios, como alargar a utilização do método (71, 188).

Em situações de surto, a rapidez na caraterização dos isolados é essencial para a identificação do reservatório responsável pela infeção e para a implementação de medidas que controlem a disseminação da bactéria. Todos os métodos de tipificação referidos anteriormente utilizam culturas puras, das quais é possível obter grandes quantidades de ADN. Mas dadas as características da Legionella, crescimento lento e necessidade de um meio de cultura específico nem sempre disponível em todos os laboratórios, atualmente o diagnóstico é frequentemente efetuado por antigenúria e por PCR, o que implica a não obtenção de culturas em muitas situações. Por estes dois motivos, necessidade de diminuir o tempo de resposta e não existência de cultura, é importante desenvolver uma metodologia que permita a tipificação diretamente nas

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amostras biológicas. A utilização do SBT diretamente das amostras já foi testada em alguns estudos com resultados aceitáveis (103, 186). No entanto, no estudo realizado por Ginevra e colaboradores, os investigadores verificaram que só em 3,2% (2/63) das amostras testadas foram obtidas as sequências de todos os genes, sendo o flaA o gene menos vezes amplificado. Para aumentar a eficiência do método, os investigadores desenvolveram uma técnica de nested-PCR (NPSBT), que utiliza os primers do SBT na segunda amplificação. Neste estudo e com a NPSBT conseguiram sequências dos sete genes em 54% (34/63) das amostras testadas, isto é, a eficiência aumentou 16,4% em relação ao SBT (114). Embora o problema não esteja completamente resolvido, pois o método não consegue amplificar todos os genes em todas as amostras, ele tem vindo a ser utilizado com sucesso em algumas investigações de surtos (75, 204, 257, 264).

Os dados obtidos com os métodos que se baseiam na análise de sequências de genes, isto é, similares ao MLST, têm vindo a ser utilizados, não só para inferir a relação entre os isolados analisados, mas também para estabelecer padrões de evolução entre genótipos similares. Anteriormente, as relações entre os isolados eram evidenciadas através de dendrogramas que utilizavam na formação dos grupos um método designado de UPGMA, mas este tipo de análise não reflete os eventos evolutivos recentes. A utilização de programas como o eBURST ou o goeBURST permite elaborar modelos evolutivos hipotéticos que teorizam sobre o aparecimento e divergência dos complexos clonais (CC). O algoritmo divide os dados em grupos de isolados relacionados agrupados em CC, com base nas diferenças entre perfis alélicos. Dentro de cada CC o algoritmo identifica, através de réplicas sucessivas, o fundador a partir do qual derivam um ou vários descendentes. Os isolados que pertençam ao mesmo CC têm uma maior probabilidade de descenderem de um ancestral comum (87, 92, 289). Nos últimos anos, estes algoritmos têm sido utilizados no estudo de populações de Legionella de diferentes regiões ou países (5, 17, 71, 172, 282).

No documento Doença dos legionários : estudo da diversidade de isolados de legionella obtidos em Portugal, 1987-2016 (páginas 60-62)