Os dados gerados na determinação de CNVs pelo ChAS foram visualizados na forma de gráficos e tabelas. Nos gráficos, são observados log2 ratio e o CN. A cópia diploide esperada é representada pelo CN = 2, enquanto que CN < 2 corresponde à deleção e CN > 2 corresponde à duplicação de segmentos genômicos.
Para cada indivíduo, foi exportada do ChAS uma tabela na forma de arquivo com extensão .txt, contendo informações relacionadas a cada CNV detectada, tais como: localização genômica exata (cromossomo, citobanda, posição inicial e final), CN, número de marcadores utilizados para determinar cada CNV, o tamanho do fragmento deletado/duplicado, os genes, total ou parcialmente, sobrepostos às CNVs. Dois tipos de filtros foram aplicados ao dados de CNVs: (1) tamanho: CNVs ≥ 1Kb, (2) marcadores: mínimo de 25 e 50 marcadores consecutivos para detectar deleções e duplicações, respectivamente.
5.6.2 Distribuição de CNVs
O Plink foi utilizado para sumarizar os dados de CNVs por indivíduo e por grupo. Para avaliar o perfil de variação estrutural no genoma, as CNVs foram divididas em três classes de tamanho: (1) entre 1–10 Kb, (2) entre 10–100 Kb, (3) > 100 Kb.
Tanto o número de segmentos, de deleções e de duplicações, quanto o tamanho de CNVs por classe, foi estimado e comparado entre controles e pacientes por meio de regressão logística ajustada para as variáveis sexo e ancestralidade.
Além disso, a distribuição de CNVs por cromossomo foi avaliada e as comparações entre a quantidade e extensão de variantes por cromossomo foram feitas por teste T de Student.
5.6.3 Regiões de CNV (CNVRs)
A localização genômica das CNVs recorrentes entre os indivíduos não apresentam, necessariamente, exatos pontos de quebra. Segundo o conceito determinado por
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Redon et al (2006), as CNVs presentes em dois ou mais indivíduos sobrepostas entre si são agrupadas em regiões de CNV (CNVRs).
As CNVRs foram definidas por meio de ferramentas de agrupamento de regiões disponíveis no Plink. Deleções e duplicações foram analisadas separadamente. Posteriormente, a frequência de cada CNVR identificada foi comparada entre pacientes com LES e controles utilizando Teste Exato de Fisher. A frequência na população saudável de CNVRs provenientes de comparações entre caso-controle que resultaram em p < 0,05 foi avaliada usando dados do DGV e do projeto HapMap.
5.6.4 CNVs em genes com relevância funcional
Para avaliar CNVs presentes em genes já descritos em associação com LES ou fenótipos autoimunes, foi feito um levantamento de genes previamente associados com LES e com autoimunidade, por meio de pesquisa em periódicos na literatura. Os genes foram categorizados em três listas: (1) genes que sobrepõem CNVs do tipo deleção ou duplicação descritas em associação com o LES, (2) genes previamente associados ao LES em estudos de ligação gênica e/ou GWAS, (3) genes relacionados com autoimunidade de forma geral.
Com a utilização da ferramenta cytoregion do ChAS, que permite a busca de regiões ou genes de interesse que sobrepõem deleções ou duplicações, para cada lista de genes foi criada uma cytoregion correspondente. Para essa análise, o número de marcadores consecutivos para detecção de deleções e duplicações foi reduzido de 25/50 para 15/15.
Após a obtenção das CNVs que sobrepõem genes candidatos à associação com LES, a frequência da ocorrência de variação englobando o gene em questão foi estimada em indivíduos saudáveis: (1) no grupo controle, (2) em dois grupos externos do projeto HapMap (YRI e CEU), (3) no DGV.
5.6.5 CNVs raras
O protocolo para identificação de CNVs raras no grupo de pacientes com LES seguiu quatro etapas. Inicialmente, foi feita a detecção de CNVs com frequência menor do que 1% presentes em pacientes em relação aos controles brasileiros usando o Plink.
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As CNVs resultantes dessa análise foram comparadas com aquelas identificadas nos indivíduos das populações africana (YRI) e europeia (CEU) do HapMap, e então, as CNVs presentes nos indivíduos do HapMap foram excluídas. Em seguida, a frequência de tais CNVs foi verificada no DGV, principal banco de dados de variantes estruturais em indivíduos controles; Apenas CNVs catalogadas no DGV com frequência < 1% foram mantidas na análise.
Por fim, com o intuito de aumentar a confiabilidade das CNVs raras detectadas, foi feita uma etapa de validação das CNVs utilizando o software Nexus Copy Number 8.0 (BioDiscovery, CA, USA). Os arquivos .cel de pacientes com LES foram submetidos à análise por esse software alternativo, que utiliza sequência de algoritmos para detecção de CNVs diferente do ChAS. Além disso, inclui etapa de correção sistemática dos dados de acordo com o tipo de array utilizado. Dessa forma, a lista de CNVs raras resultante após os filtros de frequência populacional foi contrastada com a lista de CNVs detectadas com a utilização do Nexus Copy Number. Apenas as CNVs identificadas por ambos software permaneceram na análise de CNVs raras.
5.6.6 Seleção de CNVs para validação
Após obtenção das listas de CNVRs, CNVs em genes com relevância funcional e CNVs raras, sete CNVs foram selecionadas para validação por metodologia alvo-específica. Os critérios de seleção aplicados incluíram análise dos genes sobrepostos pelas regiões deletadas e duplicadas, e sua descrição na literatura para avaliar potencial envolvimento na etiologia do LES.
As CNVRs selecionadas foram validadas em maior grupo amostral de pacientes e controles por PCR quantitativa (qPCR), enquanto as CNVs em genes com relevância funcional e CNVs raras foram avaliadas por PCR digital (ddPCR).