Por meio de busca por periódicos em ferramentas de pesquisa: Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) e Google Acadêmico (http://scholar. google.com), foi feito levantamento de SNPs autossômicos previamente classificados como AIMs, capazes de diferenciar populações europeias (EUR), africanas (AFR) e/ou ameríndias (AME). Após a seleção de painéis e exclusão dos SNP-AIMs repetidos entre eles, foi verificado quais dos AIMs autossômicos estavam presentes dentre os 750 mil SNPs do Cytoscan HD array. Os SNP-AIMs incluídos no array foram selecionados para compor o painel de marcadores de ancestralidade desenvolvido nesse trabalho.
5.5.2 Aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, diferenciação populacional e composição ancestral
Genótipos de SNP-AIMs correspondentes a cada indivíduo foram exportados do ChAS. Frequências alélicas e desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foram calculados usando Plink v. 1.9 (Purcell et al., 2007). Diferenciação populacional (estatística F de Wright, Fst) foi calculada a partir do software GDA 1.1 (Weir e
Cockerham, 1996).
Para realizar as estimativas de ancestralidade, dois tipos de análises foram realizadas: (1) ancestralidade por grupo: a composição ancestral dos grupos de pacientes com LES e controles foi estimada pelo software Admix 95 (Chakraborthy, 1985), baseada nas frequências alélicas de todos os SNP-AIMs incluídos no painel, usando as frequências de europeus, africanos e ameríndios como populações parentais de referência, e (2) ancestralidade por indivíduo: a composição ancestral individual baseada no mesmo conjunto de SNP-AIMs utilizado para inferência de ancestralidade grupal foi mensurada pelo software Admixture v. 1.23 (Alexander et al., 2009), um modelo baseado em algoritmo bayesiano usado para agrupamento de dados genéticos. Para serem usadas como referência para as análises de inferência de ancestralidade individual, as frequências genotípicas das populações parentais europeia e africana foram obtidas do Projeto HapMap (CEU – residentes de Utah com ancestralidade do norte e oeste europeu e YRI – Yoruba em Ibadan, Nigéria). Os ameríndios brasileiros foram baseados nas populações Karitiana e Surui do HGDP- CEPH Human Genome Diversity Cell Line Panel.
M a t e r i a l e M é t o d o s 4 2
Com o intuito de avaliar se há diferenças entre as proporções ancestrais dos componentes europeu, africano e ameríndio entre casos e controles, o Wilcoxon Rank sum test with continuity correction foi aplicado, utilizando as informações obtidas pelo software Admixture.
Dados de ancestralidade individual foram também utilizados para comparar ancestralidade determinada por marcadores genéticos no grupo de pacientes com LES com a ancestralidade autodeclarada. Os pacientes se autodeclararam como pertencentes a um dos três grupos: branco, pardo ou preto – termos empregados de acordo com a classificação do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística).
5.5.3 Validação do painel de AIMs
Para validar o painel de SNP-AIMs desenvolvido nesse trabalho, resultados de composição ancestral foram comparados com outro painel de AIMs previamente avaliado no grupo de pacientes com LES (Cagnin, 2015). Tal painel é composto por 12 AIMs anteriormente descritos por Shriver et al. (1997) capazes de diferenciar europeus, africanos e/ou ameríndios. Desses marcadores, cinco foram genotipados por PCR-RFLP como SNPs (CKM rs4884:C>T, DRD-2 rs1079598:C>T, FY-Null rs2814778:A>G, LPL rs285:C>T, RB2300 rs2252544:C>T), sete foram genotipados por PCR convencional, incluindo inserções Alu (Sb19.3 rs3138524, APO rs3138522, PV92 rs3138523) e InDel (AT3-I/D rs3138521, MID-52 rs16344, MID-93 rs16383, MID-575 rs140864).
A composição ancestral de pacientes com LES foi estimada por meio do software Admix 95 e depois comparada com os resultados obtidos para o painel de SNP-AIMs usando medida de correlação. As frequências alélicas das populações parentais europeia e africana pra o painel de 12 AIMs baseou-se nos dados reportados por Shriver et al., 1997. As frequências parentais de ameríndios foram calculadas a partir da genotipagem de 80 ameríndios brasileiros pertencentes aos seguintes grupos: Baníwa (n = 40), Tikuna (n = 16), Kanamari (n = 12) e Kashinawa (n = 12), usando o mesmo conjunto de 12 AIMs (Cagnin, 2015).
Um segundo passo para validação do painel de SNP-AIMs foi realizado utilizando os 749.157 SNPs disponíveis no Cytoscan HD array. O software Plink v2 (Chang et al., 2015) foi utilizado como controle de qualidade e para compilar os dados. O número total de SNPs que se mantiveram após o primeiro controle de qualidade usando ChAS
M a t e r i a l e M é t o d o s 4 3
foi de 749157 marcadores autossômicos para 133 indivíduos (amostras de LES e controles brasileiros). Após compilar os dados com as amostras de referência do HapMap/HGDP e filtrar pela taxa de genotipagem (call rate < 99%), minor allele frequency (MAF < 0,01), desvios do EHW (p <10−8), desequilíbrio de ligação (R2 > 0,8)
o número final de SNPs autossômicos foi de 69399 (~70K).
As estimativas de ancestralidade individual dos componentes europeu, africano e ameríndio determinadas pelo Admixture nos pacientes com LES e controles usando os ~70K SNPs disponíveis no array foram comparadas com aquelas obtidas com a utilização do subconjunto de SNP-AIMs selecionados para a composição do painel de ancestralidade.
5.5.4 Correção estatística pela estratificação populacional
Para ilustrar como a associação de LES com determinados loci pode ser afetada por níveis de mistura populacional, análise estatística com ajuste para ancestralidade obtida pelo uso do painel de SNP-AIMs foi realizada entre casos e controles. Essa metodologia consistiu na seleção de SNP-AIMs (δ >30%) adicionais, não incluídos entre aqueles selecionados para constituir o painel de ancestralidade, e de 371 SNPs dentre os 749.157 Cytoscan HD array, localizados em dez genes previamente associados com LES: ETS1, FAM167A, IRF5, JAZF1, MECP2, PTPN22, PXK, SCUBE1, STAT4, XKR6 (Dang et al., 2014; Gateva et al., 2009; Harley ITW et al., 2009; Harley JB et al., 2008).
Os genótipos individuais foram exportados do ChAS. As frequências alélicas nos grupos de pacientes e controles foram calculadas e, em seguida, comparadas por Teste Exato de Fisher usando o Plink. Aplicando um valor de corte de p < 0,05, dez SNPs foram selecionados aleatoriamente para análise de regressão logística com correção para ancestralidade. Os dados de proporções individuais de ancestralidade obtidos pelo Admixture foram adicionados como uma variável independente nos modelos de regressão executados no R (http://www.R-project.org/). Três modelos independentes com correção para ancestralidade europeia, africana e ameríndia foram ajustados. Com o intuito de identificar associação falso-positivas, os valores de p ajustados para cada componente ancestral obtido pelos modelos de regressão foram usados para comparação com os resultados obtidos a partir dos modelos não ajustados pela ancestralidade.
M a t e r i a l e M é t o d o s 4 4