Inicialmente, foi desenhado um par de primers para uma região cujo CN fosse, invariavelmente, igual a dois, para ser usado como referência. O critério de seleção para escolha do gene foi baseado em alto grau de conservação entre as espécies,
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expressão constitutiva no genoma, ausência de descrição de deleções e duplicações em banco de dados de variantes genômicas, como o DGV e DECIPHER.
Para o desenho de primers, as sequências de interesse foram obtidas em formato FASTA a partir do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), versão do genoma GRCh37/hg19. O software online Primer3Plus (Untergasser et al., 2007) foi utilizado para o desenho das sequências de primers forward e reverse, seguindo os critérios: (1) sequência do fragmento (amplicon) entre 70–150 pb de tamanho, (2) conteúdo de bases GC entre 40–60%, (3) tamanho da sequência do primer entre 18–23 pb; (4) temperatura de pareamento entre 58–65°C.
Após obtidas as sequências para cada par de primers, o software Gene Runner (Hastings Software, NY, USA; http://www.generunner.net/) foi utilizado para verificar a formação de algum artefato molecular (hairpin ou dímero) que pudesse prejudicar a especificidade do mesmo. Na simulação, os primers em que houve formação de artefatos em temperatura de melting (Tm) próxima em 10°C à Tm do primer, as sequências foram rejeitadas e então, refeitas.
Para verificar a especificidade do primer, ou seja, se o primer pareia apenas com a região de interesse, ou se pode parear com outras regiões do genoma, foi utilizada a ferramenta PCR in silico do UCSC Genome Browser (Tyner et al., 2016).
Dispondo da sequência para cada um dos pares de primers obtida, os oligonucleotídeos foram sintetizados (Sigma-Aldrich, MO, EUA).
5.7.2 qPCR
Os experimentos de qPCR foram realizados no equipamento StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, EUA) para genotipagem de CNVs no total de 135 pacientes com LES e 200 indivíduos saudáveis.
O mix para qPCR foi preparado para o total de 15 μL por reação, contendo as seguintes quantidades: 3,5 μL de água livre de nucleases; 7,5 μL de SybrGreen; 1,0 μL de primer forward; 1,0 μL de primer reverse; 2,0 μL de DNA genômico na concentração de 25 ng/μL.
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A ciclagem padrão de qPCR foi: etapa de desnaturação da dupla fita: 95°C por 10 minutos; ciclagem (40X): 95°C por 15 segundos; 60°C por 1 minuto; curva de dissociação: 95°C por 15 segundos; 60°C por 1 minuto; 95°C por 15 segundos. Na etapa de padronização dos primers, foram testadas quatro concentrações para cada par de primers: 2,5 μM; 1,25 μM; 0,625 μM; 0,31 μM. A escolha das concentrações ideais foi baseada nos seguintes critérios: (1) ausência de amplificação dos controles negativos na concentração em questão, (2) cycle threshold (CT) entre 20–25, (3) ausência de hibridação inespecífica, verificada pela curva de dissociação após a etapa de ciclagem da qPCR.
Em seguida, com intuito de elaborar a curva padrão foi feito um gradiente de concentração de DNA (100 ng/μL; 50 ng/μL; 25 ng/μL; 12,5 ng/μL e 6,25 ng/μL), usando um pool de DNA de quatro amostras, dois pacientes e dois controles. A eficiência dos primers foi determinada a partir da curva padrão de concentração. Valores de eficiência entre 90 e 110% foram considerados adequados.
As reações de qPCR para determinar os genótipos da CNVs para os alvos de interesse foram realizadas em triplicata de acordo com a concentração ideal de cada primer, seguindo a ciclagem e o mix especificados anteriormente. Para fins de cálculo do número de cópias, o gene de referência foi genotipado para todas as amostras analisadas. A amostra de referência, que assim como o gene de referência apresenta cópia diploide conhecida (CN = 2) para o alvo de interesse, foi repetida em cada placa de 96 poços utilizada nos experimentos de genotipagem. Com o intuito de diminuir o viés de variabilidade técnica entre diferentes reações de PCR, os experimentos foram delineados de modo que a genotipagem dos genes de referência e de interesse para cada amostra foi realizada na mesma placa, além de todas as placas conterem amostras alternadas de pacientes e controles.
5.7.3 Padronização dos experimentos de qPCR
O gene PAX6 foi utilizado como referência para a genotipagem do ADAM3A. Os primers usados para a genotipagem do gene FCGR3B foram descritos por Fanciulli Manuela et al. (2007) (Tabela 2). A concentração ideal utilizada nos ensaios de qPCR foi de 2,5 μM para os primers PAX6/FOXP2/FCGR3B e de 3,5 μM para o ADAM3A.
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Tabela 2. Sequência de primers utilizados na qPCR.
Alvo Sequência forward 5’−3’ Sequência reverse 5’−3’
PAX6 TTGCTTTCTGTGCGGTTGTG AAGCTGCCAATGACTGAAGG
ADAM3A AACACTTCAGGACAGCTTAGCC GTTCCAGAGCTTTGTGAATGG
FOXP2 TGACATGCCAGCTTATCTGTTT GAGAAAAGCAATTTTCACAGTCC
FCGR3B CACCTTGAATCTCATCCCCAGGGTCTTG CCATCTCTGTCACCTGCCAG
A curva padrão de concentração do DNA para os quatro pares de primers foi obtida conforme esperado, e não houve amplificação dos controles negativos ou desvio padrão significativo entre as replicatas. A eficiência dos primers mostrou-se dentro da faixa do esperado, entre 90–110%, e foi considerada suficiente para a realização de ensaios de qPCR (Tabela 3).
A amplificação dos produtos de qPCR e curva de dissociação dos primers mostraram eficiência da reação de qPCR, sem amplificação inespecífica de DNA ou formação de dímeros de primers.
Tabela 3. Eficiência dos primers utilizados na qPCR.
Alvo Slope Y-Inter R2 Eficiência
PAX6 -3,49 26,38 0,67 93,3%
ADAM3A -3,32 27,48 0,99 99,9%
FOXP2 -3,43 27,76 0,97 95,5%
FCGR3B -3,51 27,30 0,99 92,4%
5.7.4 Análise de resultados
O número de cópias para cada indivíduo foi calculado a partir do método de quantificação relativa ΔΔCт (Livak e Schmittgen, 2001).A razão do número de cópias (R) é representada por R = 2-ΔΔCт, de forma que se R > 1, o número de cópias do alvo
é maior no paciente do que no controle, enquanto que R < 1, o número de cópias do alvo é menor no paciente do que no controle.
Após determinação dos genótipos de cada indivíduo do grupo de pacientes e controles, foi feita análise multivariada no R v. 3.1.1 (http://www.r-project.org/)
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usando modelo de regressão logística ajustado para duas variáveis independentes: sexo e ancestralidade. O sexo foi inserido no modelo como variável qualitativa binária. A ancestralidade, por sua vez, como variável quantitativa contínua, a partir de dados resultantes da aplicação do painel de AIMs desenvolvido no presente trabalho. Para os pacientes com LES usados na etapa de validação que não foram genotipados por Cytoscan HD array, os dados de ancestralidade individual foram obtidos por meio da aplicação do painel de 12 AIMs descrito no tópico 5.5.3.
Para as análises, os indivíduos que apresentaram CN < 2 foram agrupados na classe deleção, enquanto aqueles que apresentaram CN > 2 foram agrupados na classe duplicação. Para cada classe foram ajustados três modelos independentes, europeu, africano e ameríndio. Genótipos que apresentaram diferenças entre caso e controles com p ajustado < 0,05 e odds ratio (OR) > 1,0 em um de intervalo de confiança a 95% foram considerados significativos.