ANÁLISE DE EXPRESSÃO DIFERENCIAL

A coorte deste estudo foi dividida em quatro grupos, EGA, EGS, ELA e AVCi-ELA, que foram comparados em cinco análises de expressão diferencial, como descrito na tabela 16. Os dados sociodemográficos e clínicos indicam que, em grande parte, os grupos são estatisticamente similares. No entanto, algumas divergências estatísticas foram identificadas entre os grupos em relação ao diagnóstico de hipertensão arterial, histórico de tabagismo, uso de fármacos anti-hipertensivos e score de risco cardiovascular CHA2DS2-VASc (tabela 7).

Tabela 16: MiRNAs diferencialmente expressos nas cinco comparações realizadas.

Comparação miRNAs

EGA x EGS -

EGA x ELA hsa-miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p EGS x ELA hsa-miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p EGS x AVCi-ELA hsa-miR-508-3p e hsa-miR-4677-3p

EGA + EGS x ELA + AVCi- ELA

hsa-miR-508-3p

Estas diferenças são um reflexo dos diferentes diagnósticos dos pacientes do estudo, no entanto, muito provavelmente não afetam a expressão diferencial dos miRNAs. Um exemplo disso é a diferença estatisticamente comprovada entre os scores CHA2DS2-VASc dos grupos

EGS e ELA (6x10-7) e a semelhança dos grupos EGA e ELA (0.123) (tabela 9). Apesar do risco cardiovascular dos pacientes EGS (5.46) ser consideravelmente maior do que os pacientes ELA (2.76), os miRNAs diferencialmente expressos entres estes grupos são os mesmos que os da comparação EGA x ELA: hsa-miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p. Isto indica que estes potenciais biomarcadores estão provavelmente relacionados aos diferentes diagnósticos de estenose carotídea e não ao risco cardiovascular dos pacientes.

5.1.1. EGA VS. EGS

A primeira análise de expressão diferencial, entre os grupos EGA e EGS, resultou apenas em miRNAs com p-valores ajustados maiores do que 0.05. Considerando os critérios de inclusão estabelecidos, não foram identificados miRNAs diferencialmente expressos entre os dois grupos.

O objetivo ao comparar pacientes sintomáticos e assintomáticos para a mesma condição, a estenose grave na artéria carótida interna, foi o de identificar biomarcadores candidatos para o rompimento prévio da placa aterosclerótica. Além disso, como todos os pacientes do grupo EGS sofreram AVC prévio, esperava-se que a análise apontasse miRNAs diferencialmente expressos no grupo EGA, sem eventos isquêmicos.

A ausência de miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGS e EGA indica uma similaridade fisiológica entre placas ateroscleróticas graves assintomáticas e sintomáticas. Após seu rompimento, placas ateroscleróticas passam por uma fase subaguda caracterizada pela proliferação e migração de SMCs que promovem a recuperação do local da lesão através da secreção de uma nova matriz extracelular (69, 70). Quando completamente recuperadas, placas ateroscleróticas que sofreram rompimento prévio podem ser identificadas pela análise histológica da deposição de colágeno, no entanto, elas não aparentam ter uma composição celular distinta de placas sem rupturas (69). Interessantemente, mesmo após a recuperação completa da ruptura, as placas ateroscleróticas continuam se expandindo na parede arterial através da formação de uma nova capa fibrosa e um núcleo necrótico (69). Portanto, é provável que os estímulos fisiológicos relacionados à composição celular e progressão da doença aterosclerótica sejam similares em placas assintomáticas e sintomáticas, justificando assim a expressão semelhante de miRNAs circulantes nos grupos EGA e EGS.

Além disso, a ausência de miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGA e EGS é um resultado divergente do que já foi descrito na literatura. Diversos trabalhos detalharam a expressão diferencial de miRNAs circulantes em pacientes que sofreram AVCi

em relação à controles, sendo que algumas destas moléculas podem ser consideradas biomarcadores candidatos para o diagnóstico do evento isquêmico (71). Estes estudos foram todos realizados com pacientes nas fases aguda e subaguda do AVCi (71, 72), caracterizadas pela disrupção da barreira hematoencefálica e pelo processo inflamatório (10). No entanto, na comparação EGA vs EGS, os pacientes foram recrutados para a pesquisa após no mínimo 3 meses do evento isquêmico, ou seja, durante a fase crônica do AVCi. Nesta fase observa-se uma recuperação lenta do tecido vascular através da regulação local da angiogênese e apoptose (10). Desta forma, as diferenças fisiológicas entre as fases aguda e crônica do AVCi podem justificar o resultado inesperado da comparação entre os grupos EGA e EGS em relação ao que foi descrito na literatura.

Em suma, a ausência de miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGA e EGS aparentemente reflete a semelhança fisiológica das placas ateroscleróticas graves nas artérias carótidas internas dos pacientes. Além disso, o histórico de AVC isquêmico prévio parece não influenciar a expressão de miRNAs circulantes do grupo EGS.

5.1.2. EGS VS. ELA

A segunda análise realizada foi entre os grupos EGS e ELA. O intuito desta comparação foi identificar miRNAs candidatos a biomarcadores para a presença de placa aterosclerótica grave na artéria carótida interna de pacientes EGS. Devido ao histórico prévio de AVC destes pacientes, os possíveis biomarcadores encontrados também poderiam estar relacionados à eventos isquêmicos.

A análise de expressão diferencial entre os grupos EGS e ELA identificou três miRNAs como possíveis candidatos a biomarcadores: hsa-miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e hsa-miR- 4677-5p. Interessantemente, estes mesmos miRNAs também foram identificados como diferencialmente expressos em comparações entre outros grupos. A possível utilização destes miRNAs como biomarcadores será discutida posteriormente.

5.1.3. EGA VS. ELA

A análise de expressão diferencial entre os grupos EGA e ELA identificou os mesmos três miRNAs como possíveis biomarcadores: hsa-miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e hsa-miR- 4677-5p. O intuito desta comparação foi avaliar se a presença da placa aterosclerótica grave assintomática na artéria carótida interna resultaria em uma expressão diferencial de miRNAs em relação ao grupo ELA, o que foi comprovado nesta análise.

Nas análises anteriores, observa-se a ausência de miRNAs diferencialmente expressos na primeira comparação, o que indica uma semelhança na expressão de miRNAs circulantes entre os grupos EGA e EGS. Desta forma, espera-se que as comparações individuais destes grupos com o grupo controle ELA (EGA vs ELA e EGS vs ELA) apresentem resultados semelhantes.

As duas análises realizadas entre os grupos com estenose grave e leve, EGA vs ELA e EGS vs ELA, indicaram os mesmos três miRNAs diferencialmente expressos. Em ambos os casos, o miRNA hsa-miR-508-3p estava hipoexpresso em pacientes com estenose grave, enquanto que os hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p mostraram-se superexpressos. Apesar do miRNA hsa-miR-4677-5p apresentar um p-valor ajustado maior do que 0.05 (0.08281) na comparação EGA vs ELA, ele foi considerado na análise devido à sua expressão diferencial entre os grupos EGS e ELA.

Portanto, os resultados destas três análises iniciais demonstram que os miRNAs hsa- miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p são possíveis biomarcadores candidatos para presença de estenose grave na artéria carótida interna. Esses resultados são reforçados pela semelhança na expressão de miRNAs circulantes entre os grupos EGA e EGS, o que demonstra que possivelmente a expressão destas moléculas está sendo influenciada pela placa aterosclerótica e não por um tecido danificado devido a um AVC prévio.

5.1.4. EGS VS. AVCi-ELA

O objetivo da comparação entre os grupos Estenose Grave Sintomática e AVCi com Estenose Leve Assintomática foi o de identificar possíveis biomarcadores candidatos a presença da placa aterosclerótica grave na artéria carótida interna. Como ambos os grupos possuem históricos semelhantes de eventos isquêmicos, a possível identificação de miRNAs diferencialmente expressos poderia estar relacionada ao único diagnóstico clínico divergente entre eles: a estenose grave.

Após a análise de expressão diferencial entre os grupos EGA e AVCi-ELA foram identificados dois miRNAs como possíveis biomarcadores candidatos: hsa-miR-508-3p (hipoexpresso) e hsa-miR-4677-3p (hiperexpresso). Ambos miRNAs também apresentaram expressão diferencial em outra comparações (EGS vs ELA e EGA vs ELA), o que os torna grandes candidatos a biomarcadores para a presença de placa aterosclerótica grave na artéria carótida interna.

O miRNA hsa-miR-1273h-3p apresentou um p-valor ajustado maior do que 0.05 (0.06973), no entanto, ele não será considerado como possível candidato a biomarcador por não

estar diferencialmente expresso em outras comparações. Além disso, a primeira descrição do miRNA hsa-miR-1273h-3p foi em plaquetas humanas (73), sugerindo assim uma possível atuação desta molécula na coagulação. Por se tratar de uma comparação entre dois grupos com histórico de eventos isquêmicos, a expressão diferencial de hsa-miR-1273h-3p poderia então estar relacionada ao tratamento pós-AVC e não à presença de placa aterosclerótica.

5.1.5. EGA + EGS VS. ELA + AVCi-ELA

Por fim, a última comparação foi entre os dois grupos com estenose grave e os dois grupos com estenose leve. O objetivo desta análise foi identificar possíveis biomarcadores candidatos para a presença da placa aterosclerótica grave na carótida interna, independentemente do histórico de AVC dos pacientes. A análise de expressão diferencial apontou apenas um miRNA hipoexpresso: hsa-miR-508-3p. Esta molécula foi identificada como diferencialmente expressa em todas as comparações entre grupos com estenose grave e grupos de estenose leve, indicando assim sua potencial aplicabilidade como biomarcador para a presença da placa aterosclerótica na artéria carótida interna.