HSA-MIR-508-3P

Em todas as análises de expressão diferencial realizadas entre grupos com estenose grave e grupos com estenose leve, o hsa-miR-508-3p apresentou um p-valor ajustado menor do que 0.05. Além disso, este miRNA estava hipoexpresso em grupos com estenose grave. Portanto, o hsa-miR-508-3p pode ser considerado um biomarcador candidato à presença da placa aterosclerótica grave na artéria carótida interna.

Diversos trabalhos da literatura investigaram os possíveis alvos de regulação do hsa- miR-508-3p, assim como, sua ação fisiológica em múltiplas patologias. De modo geral, a maioria destes trabalhos são da área da oncologia e visam compreender a função do hsa-miR- 508-3p em células cancerígenas. Interessantemente, muitos dos alvos comprovados para o hsa- miR-508-3p estão relacionados à doença aterosclerótica. A tabela 17 lista os principais trabalhos que identificaram alvos do hsa-miR-508-3p.

Tabela 17: Principais artigos que avaliaram potenciais alvos do hsa-miR-508-3p. Na tabela abaixo estão listadas, para cada artigo, as patologias estudadas e as moléculas relacionadas ao hsa-miR-508-3p.

Autor, ano Patologia Moléculas

Zhao, 2019 (74) Câncer de ovário LOX e ZEB 1

Zang, 2019 (75) Carcinoma de células escamosas do esôfago (ESCC)

PCAT-1 e ANXA10

Hu, 2019 (76) Câncer cervical Linc00483 e RGS17

Wang, 2019 (77) Câncer Colorretal SLCO4A1-AS1 e PARD3 Guo, 2018 (78) Câncer de mama triplo negativo ZEB1

Huang, 2016 (79) Carcinogênese Gástrica NFKB1

Li, 2015 (80) Diabetes Mellitus Gestacional PIKfyve

5.2.1. LOX

Um dos trabalhos mais recentes sobre os mecanismos regulatórios do hsa-miR-508-3p é o de Zhao et. al. (2019), que tem como foco o câncer de ovário (74). Neste artigo, um ensaio com a enzima luciferase comprovou que a proteína LOX é um alvo direto do hsa-miR-508-3p (74). A lysyl oxidase (LOX) é uma glicoproteína transmembrana que atua como principal receptora para a lipoproteína de baixa densidade oxidada (ox-LDL) (81). Ela é codificada pelo gene OLR1 e é expressa em células endoteliais, macrófagos e células do músculo liso, dentre outros tipos celulares (82). De modo geral, a LOX auxilia a captação de ox-LDL promovendo assim a formação e progressão da placa aterosclerótica ao induzir a disfunção endotelial, a formação de macrófagos espumosos e a migração de células do músculo liso (82).

Estudos recentes sugerem que a ox-LDL possui uma maior contribuição no processo aterosclerótico do que a LDL nativa (83). Isso se deve à formação de ox-LDL durante o estresse oxidativo que ocorre na placa aterosclerótica em pacientes com fatores de risco para doenças cardiovasculares como a hipertensão arterial, diabetes, dislipidemia e tabagismo (84). Portanto, a glicoproteína LOX, por facilitar a captação de ox-LDL, possui um grande papel na doença aterosclerótica.

Trabalhos prévios demonstraram que a sLOX-1, a forma solúvel da lysyl oxidase encontrada em biofluidos, está associada a diversas doenças cardiovasculares (82). Na doença arterial coronariana, por exemplo, a sLOX-1 foi identificada como um possível biomarcador para a gravidade da síndrome coronariana aguda (82). Já no acidente vascular cerebral, o valor preditivo da sLOX-1 depende da etiologia do evento, sendo que apenas em AVCs aterotrombóticos os níveis circulantes desta proteína estavam significantemente elevados (82). Estes resultados demonstram a relação próxima entre a LOX e doenças cardiovasculares causadas pela aterosclerose.

Além de ser responsável pela captação de ox-LDL, a proteína LOX-1 também foi associada ao aumento da expressão da proteína MCP-1 cuja funções incluem o recrutamento de monócitos nos momentos iniciais da lesão aterosclerótica (83). Interessantemente, a lysyl oxidase também está envolvida na transcrição do NF-KB, um fator de transcrição cuja variante NF-KB1 é um alvo comprovado do hsa-miR-508-3p (83, 79). Portanto, dois componentes de uma mesma via, LOX-1 e NF-KB1, aparentam ser regulados pelo hsa-miR-508-3p.

Devido a atuação da LOX-1 na formação e progressão da placa aterosclerótica, ela é um potencial alvo de terapêuticos para o tratamento desta doença. Alguns trabalhos na literatura investigaram a utilização de anticorpos e a administração de compostos sintéticos para inibir a interação entre a LOX-1 e a ox-LDL, apresentando alguns resultados promissores (85). Considerando que a lysyl oxidase é um alvo direto do hsa-miR-508-3p, a utilização deste miRNA como terapêutico potencialmente poderia afetar o processo aterosclerótico.

5.2.2. ZEB 1

O artigo de Zhao et. al. (2019), no câncer de ovário, associou a proteína ZEB1 e o processo EMT ao hsa-miR-508-3p através de diversas técnicas (74). Em um primeiro momento, observou-se que em células OV56 transfectadas com um inibidor para hsa-miR-508- 3p a proteína E-cadherin estava hipoexpressa. Por outro lado, ao transfectar células COV504 com um mímico para hsa-miR-508-3p, observou-se a hiperexpressão do marcador epitelial E- cadherin (74). Estes resultados sugerem que o hsa-miR-508-3p regula a expressão da proteína E-cadherin, que está associada a transição epitélio-mesenquimal (EMT), um dos principais processos de desestabilização da placa aterosclerótica (86).

Este mesmo trabalho relata ainda que a transfecção de um inibidor para hsa-miR-508- 3p em células OVTOKO e OVISE resulta na hiperexpressão de diversos mRNAs, incluindo o ZEB1 (74). Este mRNA é traduzido em uma das principais proteínas reguladoras do processo

EMT (87) e é sugerido como um dos possíveis alvos do hsa-miR-508-3p pelas análises do TargetScan (88) e mirDB (89).

Paralelamente, Guo et. al. (2018) obteve resultados similares ao investigar a função do hsa-miR-508-3p no câncer de mama triplo negativo (78). Ao transfectar mímicos de hsa-miR- 508-3p em células MDA-MB-231 e BT-549, observou-se a hiperexpressão de E-cadherin, assim como no trabalho de Zhao et. al. (74, 78). Além disso, Guo et. al. comprovou que a proteína ZEB1 é um alvo direto do hsa-miR-508-3p em células TNBC através de um ensaio com a enzima luciferase (78).

A proteína ZEB1 (Zinc Finger E-box binding homeobox 1) é um fator de transcrição associado à plasticidade celular e a transição epitélio-mesenquimal (87, 90). Ela pertence à família de repressores ZEB que, juntamente à proteína SMAD, regulam a expressão de diversos genes epiteliais incluindo o CDH1 (91). O gene CDH1, que codifica a proteína E-Cadherin, é reprimido pela ZEB1, induzido o processo EMT (92). Em 2018, Guo et. al. demonstrou uma correlação positiva entre a expressão de hsa-miR-508-3p e E-Cadherin no câncer de mama triplo negativo (78). Este resultado reflete a provável repressão da ZEB1 realizada pelo hsa- miR-508-3p e é um indicativo de que este miRNA pode atuar na transição epitélio- mesenquimal.

O processo EMT se caracteriza como a perda de junções celulares e reorganização do citoesqueleto em células epiteliais e endoteliais, fazendo com que estas se tornem células mesenquimais migratórias (86). Esta transição é mediada por três fatores de transcrição principais, ZEB1, Snail e Twist, que reprimem a expressão de marcadores epiteliais, como a E- Cadherin e CD31, e estimulam genes mesenquimais, como o ⍺-SMA e FSP-1 (86, 93).

A transição epitélio-mesenquimal está associada à progressão e instabilidade da placa aterosclerótica (86). Em 2015, Chen et. al. observou que camundongos com indução do processo EMT desenvolveram lesões ateroscleróticas mais cedo e apresentaram placas mais extensas em relação aos controles (94). Além disso, um experimento de rastreamento de linhagens celulares comprovou que, com o passar do desenvolvimento da lesão aterosclerótica, 45% dos fibroblastos componentes da placa eram derivados de células endoteliais, o que demonstra o quão comum é o processo EMT na aterosclerose (86). Por fim, a transição epitélio- mesenquimal aparenta estar relacionada à instabilidade da placa aterosclerótica, como demonstrado por Evrard et. al. (2016). Neste trabalho, ao comparar diferentes tipos de lesões ateroscleróticas, notou-se que placas instáveis possuíam um maior número de células com co- expressão de marcadores endoteliais e mesenquimais (95).

Estes resultados indicam que a transição epitélio-mesenquimal possui um importante papel na lesão aterosclerótica. Como demonstrado por Zhao et. al. e Guo et. al, o hsa-miR-508- 3p aparenta regular a expressão de duas proteínas essenciais para o processo EMT: ZEB1 e E- Cadherin (74, 78, 86). Portanto, hipotetiza-se que este miRNA pode atuar na progressão e desestabilização da placa aterosclerótica através da transição epitélio-mesenquimal. Se tal hipótese for verdadeira, o hsa-miR-508-3p poderia ser um possível alvo terapêutico para o tratamento da aterosclerose.

5.2.3. PCAT-1 e ANXA10

A regulação por hsa-miR-508-3p também foi objeto de estudo no carcinoma de células escamosas do esôfago (75). O objetivo do trabalho de Zang et. al. (2019) foi investigar a expressão e funcionalidade do lncRNA PCAT-1, uma molécula associada a proliferação de diferentes células cancerígenas (75). Observou-se que a expressão do hsa-miR-508-3p era negativamente correlacionada à expressão de PCAT-1. Além disso, o ensaio com a enzima luciferase indicou que o mRNA ANXA10 é um alvo deste miRNA (75). De acordo com os resultados obtidos neste estudo, hipotetiza-se que o lncRNA PCAT-1 regula indiretamente a proteína ANXA10 ao interagir com o hsa-miR-508-3p.

O PCAT-1 (Prostate cancer associated transcript-1) é um lncRNA associado ao mal prognóstico de diversos tipos de tumores (96). Estudos prévios o relacionaram a regulação da proliferação, apoptose, migração e invasão de células cancerígenas através do processo EMT e da via de sinalização Wnt/β-catenin (96). Zhang et. al. (2018) investigou os efeitos do PCAT-1 em células de osteosarcoma, onde identificou-se que os marcadores para o processo EMT, incluindo a E-Cadherin, tiveram sua expressão alterada por este lncRNA (97). No entanto, o estudo não determinou um possível mecanismo pelo qual o PCAT-1 afetaria a transição epitélio-mesenquimal (97). Considerando a relação entre o PCAT-1 e o hsa-miR-508-3p (75), hipotetiza-se que este lncRNA possivelmente regula a interação entre o hsa-miR-508-3p e a ZEB1, afetando assim o processo EMT.

Além disso, como indicado por Zang et. al., a Anexina A10 (ANXA10) é um dos possíveis alvos do hsa-miR-508-3p (75). Esta molécula pertence à família de proteínas ligantes de fosfolipídios dependentes de cálcio (98). Em 2019, Sun et. al. investigou a expressão e função da ANXA10 em células de colangiocarcinoma. Após o nocaute da ANXA10 em células QBC939, notou-se um aumento da expressão de E-cadherin e diminuição de Snail e Vimentin (98). Este resultado indica uma possível relação entre a Anexina A10 e o processo EMT. Devido

a provável interação entre o hsa-miR-508-3p e a ANXA10 (75), é possível que este miRNA atue na transição epitélio-mesenquimal através da sua regulação da Anexina A10.

5.2.4. LINC00483 e RGS17

Um estudo realizado em células de câncer cervical comprou a interação entre as moléculas lncRNA Linc00483, hsa-miR-508-3p e a proteína RGS17 (76). Neste trabalho, o ensaio com a luciferase indicou uma interação direta entre Linc00483 e hsa-miR-508-3p, sendo que a hiperexpressão de um deles resultou na hipoexpressão do outro (76). Além disso, atestou- se que o RGS17 é um alvo direto do hsa-miR-508-3p em células HEK-293T, CaSki e SiHa. Por fim, notou-se que em tecidos de câncer cervical há uma correlação positiva entre o Linc00483 e RGS17, ou seja, a hiperexpressão do lncRNA corresponde a hiperexpressão desta proteína (76).

O LINC00483 é um RNA longo não-codificante cujo nocaute em células HeLa e CaSki foi associado a alterações nos níveis de marcadores epiteliais e mesenquimais (76). Outros trabalhos também reportaram a expressão diferencial de marcadores para o processo EMT após o nocaute de LINC00483 (99, 100). Estes resultados demonstram a provável relação entre o LINC00483 e a transição epitélio-mesenquimal. No entanto, o mecanismo de regulação coordenado pelo LINC00483 ainda não foi completamente elucidado. Os miRNAs hsa-miR- 508-3p (76), miR-144 (99) e miR-204-3p (100), por exemplo, foram separadamente relacionados à transição epitélio-mesenquimal e ao LINC00483. No entanto, estudos adicionais precisam ser realizados para se ter uma melhor compreensão do papel de cada uma dessas moléculas no processo EMT.

Além do LINC00483, Hu et. al. comprovou também que a proteína RGS17 é um dos alvos do hsa-miR-508-3p (76). Esta molécula pertence à família de proteínas reguladoras da sinalização da proteína G (RGS) (101). Na aterosclerose, a proteína RGS17 foi associada a dois fenótipos específicos de células do músculo liso, podendo ser utilizada para distinguir os estados inflamatório e proliferativo destas células (102). No entanto, ainda não existem estudos suficientes para determinar a ação da RGS17 nas células do músculo liso e na placa aterosclerótica.

5.2.5. SLCO4A1-AS1 e PARD3

O hsa-miR-508-3p também foi estudado no câncer colorretal juntamente com o lncRNA SLCO4A1-AS1 (77). Observou-se que a expressão da proteína endógena PARD3 em células SW620 estava correlacionada negativamente com o hsa-miR-508-3p e positivamente com o

SLCO4A1-AS1 (77). Além disso, um ensaio RIP comprovou a interação específica entre SLCO4A1-AS1 e hsa-miR-508-3p nestas mesmas células. No entanto, a expressão do miRNA não foi alterada com a hiperexpressão ou inibição do SLCO4A1-AS1 (77). Considerando todos os resultados obtidos no estudo, levanta-se a hipótese de que o lncRNA SLCO4A1-AS1 regula a expressão de PARD3 através da sua interação com o hsa-miR-508-3p.

Em 2018, Yu et. al. identificou alterações na expressão de marcadores epiteliais e endoteliais em células de câncer colorretal após o nocaute do lncRNA SLCO4A1-AS1 (103). Este resultado sugere que o lncRNA SLCO4A1-AS1 pode atuar na transcição epitélio- mesenquimal (103). Considerando que o hsa-miR-508-3p está associado à proteína ZEB1, hipotetiza-se que a relação entre o SLCO4A1-AS1 e o processo EMT se dá através deste miRNA.

Por outro lado, a PARD3, também conhecida como PAR3, está associada à polaridade apical/basal e a migração de células (104). Seu principal mecanismo de ação é através de um complexo, formado com aPKC, PAR-6 e Cdc42, que ativa a reorganização do citoesqueleto (105). Em 2018, Hikita et. al. demonstrou que o nocaute de PARD3 está associado ao aumento da formação de placas ateroscleróticas em camundongos (105). Este fenômeno pode estar relacionado à ativação do processo EMT. Como demonstrado por Jung et. al. (2019), após o nocaute de PARD3, 80% dos organóides epiteliais estudados sofreram transição epitélio- mesenquimal (106). O aumento do processo EMT também foi observado em células de carcinoma pulmonar após o nocaute do complexo PKCζ/Pard3/Pard6b (107). Estes resultados indicam uma possível participação da proteína PARD3 na inibição da transição epitélio- mesenquimal. Considerando que o hsa-miR-508-3p está negativamente correlacionado ao PARD3 (77), hipotetiza-se a possibilidade de ambas moléculas participarem do processo EMT na placa aterosclerótica.

5.2.6. NFKB1

Outro alvo comprovado do hsa-miR-508-3p é a proteína NFKB1, componente da via NF-κB (79). Huang et. al. (2016) observou que na carcinogênese gástrica (células MGC-803) o NFKB1 é um alvo direto do hsa-miR-508-3p (79). Além disso, a expressão desta proteína está negativamente correlacionada ao hsa-miR-508-3p em tecidos tumorais e nas células MKN28, MGC-803 e SGC-7901 (79).

O fator nuclear kappa-beta (NFKB) é um fator de transcrição que possui como uma de suas variantes o NFKB1 (108). De modo geral, o NFKB1 regula os genes STAT3 e JUN (109) e já foi associado a diversas patologias como o câncer, doenças autoimunes e as doenças

cardiovasculares (108). A proteína STAT3 é um fator de transcrição associado à apoptose, proliferação e diferenciação celular (110). No acidente vascular cerebral, a NFKB1e a STAT3, juntamente com a proteína RELA, já foram sugeridas como biomarcadores para o AVCi devido à sua atuação na via autofágica em isquemias cerebrais (111).

Na aterosclerose, o NFKB1 foi associado ao maior risco de doença arterial coronariana em três populações independentes (112). Além disso, esta variante também foi relacionada ao maior risco cardiovascular em pacientes com artrite reumatoide (113). Um outro trabalho realizado com uma população chinesa, identificou o NFKB1 como possivelmente associado à uma maior susceptibilidade para a doença arterial coronariana através da sua interação com o IL-6 (114).

Considerando que a variante NFKB1 está relacionada à aterosclerose e ao acidente vascular cerebral isquêmico, é possível que esta molécula seja um potencial alvo para tratamentos terapêuticos. Em 2019, Zhang et. al. observou que a Aspirina suprimiu a progressão da placa aterosclerótica ao regular a expressão de NFKB1 (115). Este resultado indica que o hsa-miR-508-3p, devido a sua regulação comprovada do NFKB1, poderia ser um potencial terapêutico para o tratamento da aterosclerose.

5.2.7. PIKfyve

O hsa-miR-508-3p também foi descrito como associado à Diabetes Mellitus gestacional (GDM) (80). Inicialmente, Li et. al. observou que o hsa-miR-508-3p, juntamente com outros 8 miRNAs, estava diferencialmente expresso nos tecidos placentários de pacientes com GDM (80). Após isso, foi-se realizado um ensaio com luciferase, onde comprovou-se que o PIKfyve é um alvo direto do hsa-miR-508-3p, sendo que estas duas moléculas estão negativamente correlacionadas (80).

A enzima PIKfyve é uma quinase que sintetiza os lipídios PtdIns(3,5)P2 e PtdIns5P a partir do lipídio de membrana fosfatidilinositol 3-fosfato (PtdIns3P) (116). Sua atuação se dá através da formação de complexo com o ArPIKfyve, regulador associado à PIKfyve (116). Morioka et. al. (2017) observou que o nocaute do ArPIKfyve resultou em uma menor formação de macrófagos espumosos (117). Este resultado sugere que a enzima PIKfyve pode estar possivelmente relacionada a doença aterosclerótica através da formação de macrófagos espumosos. Portanto, futuros estudos são necessários para avaliar a relação entre o hsa-miR- 508-3p e a PIKfyve na aterosclerose.