FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FABIANA DOS SANTOS OLIVEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES CIRCULANTES EM PACIENTES COM ESTENOSE DA ARTÉRIA CARÓTIDA INTERNA
CAMPINAS 2020
IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES CIRCULANTES EM PACIENTES COM ESTENOSE DA ARTÉRIA CARÓTIDA INTERNA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADORA: PROFA DRA ISCIA LOPES-CENDES CO-ORIENTADORA: DRA DANYELLA BARBOSA DOGINI
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA FABIANA DOS SANTOS OLIVEIRA E ORIENTADA PELA PROFA DRA ÍSCIA TERESINHA LOPES CENDES.
CAMPINAS 2020
ORIENTADOR: PROFA. DRA. ÍSCIA TERESINHA LOPES CENDES COORIENTADORA: DRA. DANYELLA BARBOSA DOGINI
MEMBROS TITULARES:
1. PROFA. DRA. ÍSCIA TERESINHA LOPES CENDES
2. PROF. DR. JAMARY OLIVEIRA FILHO
3. PROF. DR. ANDREI CARVALHO SPOSITO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
A minha orientadora Dra. Iscia Lopes-Cendes pelo apoio e incentivo durante o mestrado e a iniciação científica. Seu profissionalismo e entusiasmo pela ciência são valores que irei levar comigo durante o resto da minha carreira.
A minha amiga Amanda Donatti por todo o suporte científico e emocional durante todas as etapas do mestrado. Sem a sua ajuda e encorajamento este trabalho não seria o que é hoje.
A minha co-orientadora Dra. Danyella Barbosa Dogini pela assistência durante esta jornada.
A toda a equipe do laboratório de Genética Médica pela inéstimável ajuda durante a realização deste projeto. Agradeço especialmete a Marilza Lima Santos, por todas as coletas de pacientes, a Dra. Danielle Bruno, pelo apoio na elaboração e execução da pesquisa e ao Welliton de Souza, pelas análises de bioinformática.
A equipe de Neurovascular do Hospital das Clínicas da Unicamp por terem me acolhido em seu ambulatório e me auxiliado nas etapas clínicas do meu projeto. Um agradecimeto especial ao Dr Wagner Mauad Avelar pelo enorme apoio e incentivo, como também pela sua paciênca e disponibilidade.
Ao Alessandro Augusto Viana Oliveira e Sousa por toda a ajuda na seleção dos pacientes integrantes da pesquisa.
Ao Dr. Danilo dos Santos Silva pelas suas análises de ressonância magnética e pela sua paciência para explicar conceitos de Neurologia.
A toda equipe de Cardiologia do Hospital das Clínicas da Unicamp e a todos os integrantes do laboratório de Biologia Cardiovascular pela colaboração que realizamos nestes últimos dois anos. Um agradecimento especial ao Dr. Wilson Nadruz Junior por me receber de portas abertas em seu ambulatório. Sua ajuda foi essencial para a execução desta pesquisa.
Ao Luis Felipe Rodrigues dos Santos Carvalho Romano pela realização e análise de ultrassonografias Doppler nos pacientes integrantes desta pesquisa.
Ao Dr. Roberto Schreiber e a Dra Layde Paim pelo suporte durante o recrutamento e coleta de pacientes para a pesquisa.
A toda equipe de Cirurgia Vascular do Hospital das Clínicas da Unicamp por todo o auxílio durante a nossa colaboração. Agradeço especialmente a Dra Teresinha Guillaumon pela disposição e entusiamo em relação a esta pesquisa. Seu apoio e incentivo foram fundamentais para a realização deste trabalho.
A procura por biomarcadores relacionados a presença da placa aterosclerótica pode auxiliar na identificação de pacientes com um maior risco de sofrer um acidente vascular cerebral. MicroRNAs circulantes são moléculas de RNA não codificante relacionadas à regulação da expressão gênica e que vêm sendo propostos como biomarcadores de diversas doenças. Isso posto, o objetivo principal deste trabalho foi identificar biomarcadores potenciais para a presença da placa aterosclerótica na artéria carótida interna através da análise da expressão diferencial de microRNAs circulantes. Este estudo é composto por uma coorte de 39 pacientes: 5 com estenose grave assintomática, 13 com estenose grave sintomática, 13 com estenose leve assintomática e 8 pacientes que sofreram AVCi e que apresentam estenose leve assintomática. Amostras de microRNA foram extraídas do plasma utilizando o kit mirVanaTM PARISTM e indexadas com o kit QIAseq® miRNA Library. As amostras multiplexadas foram sequenciadas utilizando a plataforma HiSeq 2500 (Illumina, Inc) e os dados obtidos foram analisados com o aplicativo DESeq2. Após diversas comparações entre os grupos de pacientes estudados, encontramos que o miR-508-3p estava hipoexpresso e os 3p e miR-4677-5p estavam hiperexpressos em pacientes com estenose grave. Apesar de não existirem trabalhos que explorem a funcionalidade do miR-4677-5p, ambos os miR-508-3p e miR-4677-3p já foram associados à transição epitélio mesenquimal (EMT) ao terem como alvo potencial a proteína ZEB1. Além disso, o miR-508-3p também foi relacionado à proteína LOX, a principal receptora de LDL oxidada. Considerando a relevância do processo EMT e da oxLDL para a progressão e desestabilização da placa aterosclerótica, nossos resultados indicam que além de serem potenciais biomarcadores para a aterosclerose, os mir-508-3p, 3p, e mir-4677-5p podem ser potenciais alvos de intervenções terapêuticas no futuro.
Palavras-chave: Estenose Carotídea, Aterosclerose, MicroRNAs Circulantes, Biomarcadores e Processo EMT.
The search for biomarkers related to the atherosclerotic plaque could help the identification of patients at a higher risk for stroke. Circulating microRNAs are non-coding RNA molecules involved in gene regulation that have been proposed as disease biomarkers. Therefore, the primary goal of this study was to investigate whether there are differences in the expression of circulating microRNA in patients with symptomatic or asymptomatic carotid stenosis as compared to controls. This study accessed a cohort of 39 patients: 5 patients with severe asymptomatic stenosis, 13 patients with severe symptomatic stenosis, 13 controls with mild stenosis, 8 patients who had a stroke and have mild stenosis. MicroRNA samples were extracted from plasma with the mirVanaTM PARISTM kit and indexed with the QIAseq® miRNA Library Kit. The pooled samples were sequenced using a HiSeq 2500 (Illumina, Inc), and the data were analysed with the software DESeq2. After comparing multiple scenarios, we found that the mir-508-3p was downregulated; whereas, mir-4677-3p and mir-4677-5p were upregulated in patients with severe atherosclerosis as compared to controls. Although there are no studies regarding the biological function of of 5p, both mir-508-3p and mir-4677-3p have been previously associated with the Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) process, and they both potentially target the ZEB1 protein. The miR-508-3p is also linked to the LOX protein, the main receptor for oxidized LDL. Considering the relevance of the EMT process and ox-LDL in the progression and instability of the atherosclerotic plaque, our results indicate that in addition to being potential biomarkers for atherosclerosis, 508-3p, mir-4677-3p, and mir-4677-5p, could also be potential targets for therapeutic intervention in the future.
Keywords: Carotid Stenosis, Atherosclerosis, Circulating MicroRNAs, Biomarkers and EMT Process.
Figura 1 - Processo de seleção da coorte.
Figura 2 - Gráfico de distribuição das idades nos quatro grupos integrantes do estudo: Estenose Grave Assintomática, Estenose Grave Sintomática, Estenose Leve Assintomática e AVC isquêmico com Estenose Leve Assintomática.
Tabela 1: Lista de características clínico-demográficas obtidas dos pacientes participantes da pesquisa.
Tabela 2: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Grave Assintomática da artéria carótida interna
Tabela 3: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Grave Sintomática da artéria carótida interna
Tabela 4: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Leve Assintomática da artéria carótida interna
Tabela 5: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Leve Assintomática da artéria carótida interna que sofreram um AVCi prévio
Tabela 6: Lista de comparações feitas para a análise de expressão diferencial.
Tabela 7: Dados sociodemográficos e clínicos dos pacientes componentes dos quatro grupos estudados. Os p valores foram obtidos através de um teste de qui-quadrado.
Tabela 8: Valores do teste anova feito com as idades dos pacientes integrantes dos quatro grupos estudados.
Tabela 9: Valores do teste anova feito com os scores CHA2DS2-VASc dos pacientes integrantes dos quatro grupos estudados.
Tabela 10: Utilização de diferentes classes de anti-hipertensivos por pacientes dos quatro grupos estudados.
Tabela 11: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGA e EGS. Tabela 12: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGS e ELA. Tabela 13: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGA vs ELA. Tabela 14: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGS e AVCi-ELA
Tabela 15: MicroRNAs diferencialmente expressos nos grupos EGA + EGS e ELA + AVCi-ELA.
Tabela 16: MiRNAs diferencialmente expressos nas cinco comparações realizadas.
Tabela 17: Principais artigos que avaliaram potenciais alvos do hsa-miR-508-3p. Na tabela abaixo estão listadas, para cada artigo, as patologias estudadas e as moléculas relacionadas ao hsa-miR-508-3p.
Tabela 18: Principais artigos que avaliaram potenciais alvos do hsa-miR-4677-3p. Na tabela abaixo estão listadas, para cada artigo, as patologias estudadas e as moléculas relacionadas ao hsa-miR-4677-3p.
AIT Acidente Isquêmico Transitório AVC Acidente Vascular Cerebral
AVCi Acidente Vascular Cerebral Isquêmico
AVCi-ELA Acidente Vascular Cerebral Isquêmico e Estenose Leve Assintomática
cDNA DNA complementar
EGA Estenose Grave Assintomática EGS Estenose Grave Sintomática ELA Estenose Leve Assintomática EMT Transição Epitélio-Mesenquimal
HC Hospital das Clínicas
HSA Hemorragia Subaracnóidea Aneurismática LDL Lipoproteína de Baixa Densidade
lncRNA RNA longo não-codificante
mRNA RNA mensageiro
miRNA MicroRNA
ox-LDL LDL oxidada
lncRNA RNA longo não codificante
LOX Lysyl Oxidase
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
qPCR PCR quantitativa
RISC RNA-induced silencing complex RNA-seq Sequenciamento de pequenos RNAs
RM Ressonância Magnética
ROS Espécie Reativa de Oxigênio
RT-PCR PCR em Tempo Real
SMC Célula do Músculo Liso SNC Sistema Nervoso Central
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
1.1 ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL 14 1.2. ATEROSCLEROSE 18 1.3. MICRORNAS CIRCULANTES 20 2. OBJETIVOS 23 2.1. OBJETIVO GERAL 23 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 23 3. MÉTODO 24 3.1. COORTE 24
3.1.1. ESTENOSE GRAVE ASSINTOMÁTICA (EGA) 25
3.1.2. ESTENOSE GRAVE SINTOMÁTICA (EGS) 26
3.1.3. ESTENOSE LEVE ASSINTOMÁTICA (ELA) 27
3.1.4. AVC ISQUÊMICO E ESTENOSE LEVE ASSINTOMÁTICA (AVCi-ELA) 28
3.2. COLETA E PROCESSAMENTO 29
3.3. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL 29
3.4. BIBLIOTECAS DE cDNA 30
3.5. CONTROLE DE QUALIDADE E QUANTIFICAÇÃO 31
3.6. MULTIPLEXAÇÃO E SEQUENCIAMENTO 31
3.7. ANÁLISE DE BIOINFORMÁTICA 32
4. RESULTADOS 34
4.1. COORTE 34
4.2. MICRORNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS 38
4.2.1. EGA VS. EGS 39
4.2.2. EGS VS. ELA 40
4.2.3. EGA VS. ELA 41
4.2.4. EGS vs. AVCi-ELA 42
4.2.5. EGA + EGS VS. ELA + AVCi-ELA 43
5. DISCUSSÃO 44
5.1. ANÁLISE DE EXPRESSÃO DIFERENCIAL 44
5.1.1. EGA VS. EGS 45
5.1.2. EGS VS. ELA 46
5.1.3. EGA VS. ELA 46
5.1.4. EGS VS. AVCi-ELA 47
5.1.5. EGA + EGS VS. ELA + AVCi-ELA 48
5.2.3. PCAT-1 e ANXA10 52 5.2.4. LINC00483 e RGS17 53 5.2.5. SLCO4A1-AS1 e PARD3 53 5.2.6. NFKB1 54 5.2.7. PIKfyve 55 5.3. HSA-MIR-4677-3P 56 5.4. HSA-MIR-4677-5P 57 6. CONCLUSÃO 59 7. REFERÊNCIAS 60 8. ANEXOS 72
8.1. PARECER COMITÊ DE ÉTICA 72
8.2. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO VERSÃO 1 73 8.3. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO VERSÃO 2 79 8.4. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO VERSÃO 3 82
1. INTRODUÇÃO
1.1 ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL
O acidente vascular cerebral (AVC) é a segunda maior causa de morte no mundo, correspondendo a quase 6 milhões de óbitos anuais (1). No Brasil, esta doença foi responsável por 156 mil internações e 23 mil mortes em 2018 (2), o maior índice entre países da américa latina (3). Em São Paulo, as taxas de doenças cerebrovasculares correspondem a 49,35 casos por 100.000 habitantes (4), o que torna este estado o líder do ranking nacional (2). Além disso, o AVC é a maior causa de incapacitação em indivíduos com mais de 50 anos no Brasil e está diretamente associado a 40% das aposentadorias precoces no país (5). Portanto, o acidente vascular cerebral é uma doença com um enorme fardo humano, social e econômico, sendo de grande interesse a aplicação de medidas preventivas para diminuir o seu impacto no Brasil.
Sacco et. al. define o AVC como uma lesão focal de causa vascular ao sistema nervoso central (SNC) que resulta em um déficit neurológico (6). O acidente vascular cerebral pode ser classificado como isquêmico, quando o fluxo sanguíneo cerebral é suspenso devido ao bloqueio de vaso sanguíneo por um corpo embólico (7), ou hemorrágico, quando há um acúmulo de sangue no parênquima cerebral ou sistema ventricular na ausência de trauma (6). Segundo o estudo de referência realizado por Cabral em 1997, de todos os primeiros episódios de acidentes vasculares cerebrais reportados na cidade de Joinville-SC, 73,4% são isquêmicos (AVCi) e 25,9% são hemorrágicos (8). A alta prevalência de AVCis também foi identificada por Carvalho et. al. em Fortaleza-CE, onde 72,9% dos casos de acidente vascular cerebral reportados no estudo foram isquêmicos (9).
O acidente vascular cerebral isquêmico provoca uma lesão focal e progressiva ao sistema nervoso central que pode ser categorizada em três fases distintas de recuperação: aguda, subaguda e crônica (10). Na fase aguda do AVCi, observa-se a disrupção da barreira hematoencefálica e alterações do tônus cerebrovascular (10). Em seguida, durante a fase subaguda, fatores pró-inflamatórios são ativados em resposta a hipoxia e ao estresse oxidativo no tecido cerebral (10). Devido aos mecanismos de reparação neural das fases aguda e subaguda, nos três primeiros meses após o AVC a recuperação das funções físicas e senso motoras é notavelmente mais rápida (11). No entanto, após estes três meses, durante a fase crônica, a recuperação dos pacientes é mais lenta (11). Nesta fase observa-se a redução dos fatores pró-inflamatórios (12), o estímulo da angiogênese e a regulação da apoptose (10).
O diagnóstico do acidente vascular cerebral se dá pela investigação clínica, onde são analisados sintomas correspondentes a lesões do SNC, e pela realização de exames de imagem (Ressonância Magnética ou Tomografia) que serão avaliados para a presença de lesões
cerebrais (7). Os exames de imagem são especialmente importantes na diferenciação entre casos reais de AVC e acidentes isquêmicos transitórios (AITs) (7). AITs são caracterizados como episódios temporários de disfunção neurológica que duram até 24 horas mas que não estão associados à lesões cerebrais (13). A diferenciação destes eventos é extremamente importante para realizar o seu tratamento e prevenção (13).
A prevenção contra eventos isquêmicos é amplamente baseada nos fatores de risco não modificáveis e modificáveis. A American Heart Association lista como fatores de risco não modificáveis a idade, sexo, etnia e genética dos pacientes (14). Apesar de não serem tratáveis, essas características auxiliam na identificação de indivíduos no grupo de risco para doenças cardiovasculares (14). Por outro lado, os fatores de risco modificáveis mais conhecidos são a hipertensão, tabagismo, diabetes, dislipidemia e obesidade (14).
No Brasil, uma pesquisa feita pelo Ministério da Saúde divulgada em 2018 indicou que dos indivíduos entrevistados 7,7% possuem diabetes, 19,8% obesidade, 24,7% hipertensão e 9,3% eram fumantes (15). Além disso, dois trabalhos descreveram a prevalência de dislipidemia nas populações das cidades de São Paulo (16) e Goiânia (17) como sendo 59,7 e 23,4% respectivamente. Estes dados indicam que os fatores de risco modificáveis para o AVC são comuns na população brasileira, especialmente a hipertensão e a dislipidemia (15, 16 e 17).
Estes fatores de risco são especialmente preocupantes no acidente vascular cerebral isquêmico (14). Este tipo de AVC pode ser classificado em cinco subtipos de acordo com suas etiologias: doença de grandes artérias, cardioembolismo, doença de pequenos vasos, AVC por outras causas determinadas e AVC com etiologia indeterminada (18). Esta subdivisão é extremamente importante, pois a etiologia do AVCi irá influenciar a escolha dos fármacos administrados, dos procedimentos cirúrgicos necessários e nas mudanças de estilo de vida que serão essenciais para a prevenção de novos acidentes vasculares cerebrais (18).
As incidências dos cinco subtipos de AVC isquêmico são variáveis em diferentes populações, no entanto a doença de grandes artérias se apresenta como uma das etiologias mais frequentes (19 e 20). Neste subtipo de AVCi, o evento isquêmico é causado por um corpo embólico que se originou em uma placa aterosclerótica instável (21). A placa aterosclerótica, ou ateroma, é uma manifestação avançada da aterosclerose, que por sua vez é uma inflamação crônica na parede de artérias (22).
Inicialmente, a lesão aterosclerótica se caracteriza pela formação de estrias gordurosas (fatty streaks) na túnica íntima da parede arterial (23). Com o avanço da doença, ocorre o desenvolvimento de uma capa fibrosa que promove o espessamento da túnica íntima e a evolução da lesão em uma placa aterosclerótica (23). Em um primeiro momento, o
espessamento da túnica íntima não afeta o diâmetro da luz arterial, pois o vaso sofre remodelamento (24). No entanto, nos estágios avançados da placa aterosclerótica, observa-se o estreitamento da luz do vaso, ou seja, estenose (24).
A aterosclerose e subsequente estenose podem ser observadas em artérias extra e intracranianas como, por exemplo, as artérias carótidas comum, interna e externa, a artéria vertebral e artéria basilar (25). A estenose da artéria carótida, também conhecida como estenose carotídea, está associada a cerca de 20% dos casos de AVCi (21). Esta alta frequência ocorre devido à morfologia do bulbo da artéria carótida interna localizado na bifurcação com a artéria carótida externa (26).No bulbo carotídeo observa-se um maior estresse físico na parede arterial e um fluxo sanguíneo turbulento, o que pode levar ao desenvolvimento de uma lesão aterosclerótica e a futuras complicações vasculares (26).
O ensaio NASCET (North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial) estabeleceu que a estenose carotídea pode ser classificada como leve, moderada ou grave de acordo com o grau de estreitamento observado na luz arterial (27). Na estenose leve, o estreitamento é de 0 a 29% e não provoca alterações no fluxo sanguíneo (28 e 24). O aumento da velocidade do fluxo sanguíneo é observado em artérias com estenose moderada ou grave, cujo estreitamento da luz do vaso corresponde a 30-69% e 70-99% respectivamente (28 e 24). Em casos graves, onde não houve o tratamento adequado, é possível que a artéria esteja ocluída, ou seja, o vaso não apresenta fluxo sanguíneo (21). Além disso, a estenose carotídea também pode ser classificada como sintomática ou assintomática de acordo com a respectiva manifestação ou ausência de sintomas relacionados à ruptura da placa aterosclerótica e consequente AVC ou AIT (26).
A classificação do grau de estenose na artéria carótida é extremamente importante para determinar sua possível vulnerabilidade, isso por que a estenose grave é considerada um fator de risco para diversas doenças cardiovasculares, incluindo o AVC (14). Portanto, a detecção da estenose carotídea é essencial para compreender a evolução da placa aterosclerótica e prevenir o acidente vascular cerebral isquêmico (26). De modo geral, três exames de imagem não-invasivos podem ser utilizados para avaliar a presença da placa aterosclerótica e calcular o grau de estenose na artéria carótida interna: Ultrassonografia Doppler, Angiografia e Ressonância Magnética (26).
A ultrassonografia doppler (US Doppler) é o método mais comum para a detecção da estenose carotídea (29). Neste exame de imagem, a presença da placa aterosclerótica na artéria carótida é avaliada pela mensuração da espessura da túnica íntima do vaso (26). Além disso, a US Doppler é capaz de avaliar o grau de estenose de acordo com a velocidade do fluxo
sanguíneo na artéria (30). No entanto, a qualidade da US Doppler é altamente depende do profissional responsável pela sua realização (23). Erros no posicionamento e angulação do aparelho podem resultar na mensuração incorreta das velocidades Doppler e, portanto, em diagnósticos equivocados (29).
A angiografia, por sua vez, é um método radiográfico que faz a utilização de um agente contrastante para avaliar a morfologia da artéria carótida interna (23). No entanto, a angiografia pode apresentar artefatos de técnicas em placas ateroscleróticas altamentente calcificadas (23). Além disso, este é um procedimento arriscado devido à utilização de um contraste intravenoso (31). Outro exame de imagem bastante utilizado para avaliar características da placa aterosclerótica é a Ressonância Magnética (26). Este método é capaz de identificar componentes específicos da placa aterosclerótica, como o tecido fibroso, cálcio e lipídeos (23). No entanto, a resolução da RM não é capaz de detectar o grau de estreitamento da luz arterial, sendo necessária então a realização conjunta de outro exame de imagem (23).
A presença da estenose carotídea grave é um importante fator de risco para o acidente vascular cerebral isquêmico (21). Sem o tratamento adequado, pacientes com placas assintomáticas apresentam um risco de AVCi de 6%, enquanto que aqueles com estenose carotídea sintomática têm 26% de chance de sofrer uma evento isquêmico nos próximos 2 anos (21). Esta diferença afeta diretamente a escolha dos melhores tratamentos, clínico ou cirúrgico, para cada condição.
O objetivo do tratamento clínico ou terapêutico é controlar os principais fatores de risco relacionados à aterosclerose, como a hipertensão arterial e a dislipidemia, com o uso de fármacos e mudança no estilo de vida (26). Todos os pacientes com estenose carotídea devem fazer o tratamento clínico para prevenir não só a ruptura da placa mas também o desenvolvimento da aterosclerose em outras artérias do sistema cardiovascular (21). No entanto, em casos específicos, a administração de fármacos não é suficiente e a intervenção cirúrgica é necessária (21).
Os principais procedimentos cirúrgicos indicados para o tratamento da estenose carotídea grave são a endarterectomia carotídea e o stenting da artéria carótida (26). Diversos trials realizados na década de 1990 estabeleceram que os pacientes que mais se beneficiam destas intervenções cirúrgicas são aqueles com estenose carotídea grave e, em alguns casos, pacientes sintomáticos com estenose moderada (26). Portanto, a escolha do melhor tratamento para a prevenção do AVCi irá depender da presença e gravidade da estenose carotídea.
Todas as etapas de prevenção do acidente vascular cerebral isquêmico e da doença de grandes artérias, desde o diagnóstico da estenose carotídea até a escolha do melhor tratamento,
são baseadas nas descobertas moleculares e celulares relacionadas a esta doença (21, 23, 26). Portanto, a compreensão dos mecanismos celulares relacionados à aterosclerose é essencial.
1.2. ATEROSCLEROSE
A aterosclerose é uma doença inflamatória progressiva caracterizada pelo acúmulo de lipídeos na parede de grandes e médias artérias (32, 33, 34). O estágio avançado desta doença está diretamente relacionado ao AVC e à doença arterial coronariana, as duas principais causas de morte no mundo (1, 33). Portanto, a compreensão dos mecanismos relacionados ao início, progressão e desestabilização da doença aterosclerótica pode auxiliar a prevenção e o tratamento desta condição.
Em indivíduos saudáveis, as artérias possuem três túnicas morfologicamente distintas: íntima, média e adventícia (32). A túnica íntima é a camada mais fina em artérias saudáveis e está mais próxima da luz do vaso (32). Ela é composta por uma matriz de fibras elásticas e por uma camada única de células endoteliais, que estão em contato direto com o sangue (32, 35). A túnica média é composta por diversas camadas de células do músculo liso (SMC), enquanto a túnica adventícia apresenta, entre outros componentes, tecido conjuntivo e fibroblastos (32, 35). Além disso, a túnica adventícia possui também pequenos vasos chamados de vasa vasorum (36). As diferenças morfológicas observadas em cada túnica garantem a manutenção da homeostase arterial (37).
Nas artérias, a camada endotelial ou endotélio é uma barreira seletiva e permeável que possui fortes junções intercelulares (32). Uma de suas principais funções é a manutenção do tônus vascular pela liberação de substâncias vasodilatadoras e vasoconstritoras (38). Algumas condições específicas, como a dislipidemia, a hipertensão e o shear stress, provocam uma alteração fisiológica no endotélio, aumentando assim sua permeabilidade e afetando o balanço entre a vasoconstrição e a vasodilatação (38, 39). Este fenômeno, que também é conhecido como disfunção endotelial, é o mecanismo chave para o início da aterosclerose na parede arterial (40).
O aumento da permeabilidade do endotélio permite o acúmulo de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) na matriz subendotelial do vaso (32). Em regiões de fluxo sanguíneo turbulento e com alto shear stress, como bifurcações ou curvaturas, a disfunção endotelial é mais frequente, resultando assim em um maior acúmulo de LDL (32). Além disso, alguns fatores de risco cardiovasculares afetam diretamente os eventos iniciais da aterosclerose (32). A dislipidemia, por exemplo, resulta em um maior acúmulo e retenção de LDL na matriz
subendotelial (32). Por outro lado, a diabetes, a hipertensão e o tabagismo estão relacionados ao aumento da disfunção endotelial através do estresse oxidativo (41).
Na artéria saudável, o endotélio regula a vasodilatação através da produção e liberação de óxido nítrico (38). Além de regular o tônus vascular, esta molécula também impede a oxidação da LDL em ox-LDL (38). Durante o estresse oxidativo, provocado pela diabetes, hipertensão e tabagismo, observa-se uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) (38). Estas moléculas fazem a degradação do óxido nítrico, levando a desregulação da vasodilatação e consequente disfunção endotelial (38). Além disso, as ROS aumentam os níveis de oxidação de LDLs na matriz subendotelial da artéria (32).
Após o acúmulo de LDL e ox-LDL na túnica íntima do vaso, monócitos são recrutados para a parede arterial através da liberação de quimiocinas e pela expressão das moléculas de adesão VCAM-1 e E-selectin na superfície de células endoteliais (36, 42). Na túnica íntima, monócitos se diferenciam em macrófagos e passam a fagocitar ox-LDLs com o auxílio dos receptores SRA e CD36 (36, 42). A internalização de ox-LDL por parte dos macrófagos leva ao acúmulo de gotículas lipídicas no citoplasma destas células que passam a ser classificadas como células esponjosas (foam cells) devido à sua morfologia (43). A presença de células esponjosas na túnica íntima representa o estágio inicial da doença aterosclerótica, que é clinicamente conhecido como estrias gordurosas (43).
Com a progressão da doença aterosclerótica, as células endoteliais e as células esponjosas passam a secretar moléculas que estimulam a migração e a proliferação das células do músculo liso (32, 35). As SMCs migram da túnica média para a túnica íntima onde passam a sintetizar uma matriz extracelular composta majoritariamente por colágeno (35, 36). Esta matriz extracelular juntamente com as células do músculo liso dá origem a uma capa fibrosa que garante estabilidade às estrias gordurosas, agora chamadas de placas ateroscleróticas (33).
As placas ateroscleróticas são manifestações avançadas da aterosclerose que apresentam, além da capa fibrosa, um núcleo necrótico originado da morte de células esponjosas, células do músculo liso e células endoteliais (32, 33). A presença do núcleo necrótico desestabiliza a lesão aterosclerótica devido ao seu alto conteúdo lipídico (33). Em uma eventual ruptura da placa aterosclerótica, o sangue entra em contato com os fatores tissulares do núcleo necrótico e a cascata de coagulação é ativada (43).
Diversas características da placa aterosclerótica contribuem para a sua vulnerabilidade, em especial a espessura e composição da capa fibrosa, a calcificação e a neovascularização(32, 43). De modo geral, placas com capas fibrosas de menor espessura e/ou com menos colágeno apresentam maior risco de ruptura quando expostas a um estresse hemodinâmico (32, 43). Além
disso, o processo de calcificação focal, mediado por pericitos, está associado a estabilização da placa (32, 33). Por outro lado, a neovascularização, que ocorre na íntima média e adventícia, aumenta a fragilidade da placa aterosclerótica ao provocar o recrutamento de células inflamatórias para o local da lesão (32, 33)
Após a ruptura da placa aterosclerótica, células inflamatórias e plaquetas presentes no sangue entram em contato com os fatores tissulares do núcleo necrótico (45). Esta interação resulta na formação de um trombo que poderá causar uma oclusão arterial (32, 45). Além disso, esta ruptura pode provocar também uma hemorragia focal que leva a progressão rápida e abrupta da lesão aterosclerótica (33). Apesar de não ser um evento raro, o rompimento da placa aterosclerótica muitas vezes resulta em complicações clinicamente assintomáticas que aumentam o risco cardiovascular (33). Portanto, o tratamento desta doença é essencial para evitar a progressão e o rompimento da placa aterosclerótica.
As terapias mais comuns para a aterosclerose buscam diminuir a retenção de LDLs na túnica íntima através da mudança do estilo de vida e pelo uso de fármacos, em especial de estatinas (45, 46). Além disso, anti hipertensivos e anti plaquetários são comumente utilizados como terapêuticos de prevenção secundária para esta doença (46). No entanto, a detecção e o monitoramento das placas ateroscleróticas são procedimentos essenciais para se definir a terapia mais eficiente para cada paciente (45). Adicionalmente a técnicas de imagem, a utilização de biomarcadores, em especial os microRNAs circulantes, vêm sendo proposta como um método não invasivo de diagnóstico e monitoramento para doenças cardiovasculares (47).
1.3. MICRORNAS CIRCULANTES
MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA não codificantes de aproximadamente 21 nucleotídeos que atuam na regulação gênica pós-transcricional (48, 49). Esta família de pequenos RNAs foi descoberta em Caenorhabditis elegans e desde então vem sendo identificada em uma grande variedade de seres vivos, como mamíferos, plantas e nematódeos (48). Estima-se que os miRNAs regulam a tradução de cerca de 60% dos genes codificantes de proteínas e, portanto, estão relacionados a importantes processos biológicos, dentre eles a diferenciação e proliferação celular (50).
A biogênese dos miRNAs maduros se caracteriza pelo processamento de dois precursores, pri-miRNA e pre-miRNA, no núcleo e citoplasma com o auxílio das enzimas Drosha e Dicer respectivamente (48, 51). O pri-miRNA é um transcrito de cerca de 33 bp que possui uma estrutura de stem-loop, ou seja, suas extremidades 3’ e 5’ são parcialmente complementares e estão pareadas (52). Na primeira etapa de processamento, a enzima Drosha
catalisa a clivagem das extremidades não-pareadas do pri-miRNA originando uma molécula de 22 bp com estrutura stem-loop denominada pre-miRNA (52). O pre-miRNA é então processado pela enzima Dicer que irá excisar o loop terminal, resultando em duas moléculas independentes de miRNA maduro de aproximadamente 22 nt cada (52). Como dois miRNAs maduros diferentes são excisados do mesmo precursor, é necessária a utilização de uma nomenclatura que indique a extremidade de origem dessas moléculas (53). Portanto, sequências nomeadas como 3p e 5p se originaram, respectivamente, das extremidades 3’ e 5’ do pre-miRNA (53).
Após o processamento, os miRNAs maduros se associam à proteína argonauta formando o complexo RISC (do inglês RNA-induced silencing complex) (54, 55). Este complexo irá identificar e se parear a RNAs mensageiros (mRNAs) com sequências complementares ao miRNA maduro (56). Após o pareamento, a tradução dos mRNAs-alvo é reprimida devido a dois processos mediados pelo complexo RISC: a degradação do mRNA e a inibição da etapa inicial da tradução (54). A regulação gênica pós-transcricional promovida pelos miRNAs é um importante mecanismo celular que se mostra evolutivamente conservado em muitos seres vivos (57).
Atualmente, 38589 miRNAs precursores e 48860 miRNAs maduros são conhecidos em 271 organismos, como listado no principal banco de dados para sequências de miRNAs, o miRBase (58). A maioria dos miRNAs conhecidos podem ser encontrados no meio intracelular, no entanto estudos da última década identificaram a presença destas moléculas em diversos biofluidos como plasma, soro, urina e saliva (57, 59). Surpreendentemente, estes miRNAs circulantes se mantêm estáveis em meios extracelulares contendo ribonucleases (57). Isso ocorre devido à sua associação com três estruturas distintas: proteínas argonautas, lipoproteínas de alta densidade e vesículas extracelulares (60, 61).
As vesículas extracelulares são uma classe de vesículas lipídicas relacionadas a comunicação intercelular e que podem ser identificadas como exossomas (vesículas com 30 a 100 nm de diâmetro) e microvesículas (100 a 1000 nm) (60, 62). Apesar de exossomas e microvesículas possuírem mecanismos de formação distintos, miRNAs circulantes podem ser encontrados em ambos (57). Além disso, a associação entre vesículas extracelulares e miRNAs circulantes não aparenta ser exclusiva a um determinado tipo celular, pois grande parte das células eucarióticas são capazes de liberar vesículas extracelulares (59). No entanto, condições fisiológicas estressantes, como câncer ou inflamação crônica, resultam na liberação exacerbada de vesículas extracelulares (59, 62).
Desde a sua descoberta em biofluidos, os miRNAs circulantes vêm sendo propostos como possíveis biomarcadores para diversas patologias (57, 59). Isso porque, muitas
características de um biomarcador ideal podem ser identificadas nos miRNAs circulantes, como sua sensibilidade, capacidade de predição e fácil detecção com métodos não-invasivos (57). Além disso, a expressão de alguns miRNAs circulantes são específicos à tecidos e órgãos, possibilitando assim a diferenciação entre determinadas patologias (57). Na aterosclerose, por exemplo, estudos demonstram que diversas células relacionadas à doença, como células endoteliais e macrófagos, liberam vesículas contendo miRNAs no meio extracelular (62, 64). Ademais, vesículas de origem cardiovascular foram relacionadas a transferência de miRNAs entre células vasculares in vitro e ex vivo (60). Estes resultados sugerem que a expressão de miRNAs circulantes reflete as condições fisiológicas das células vasculares.
Na última década, múltiplos estudos associaram a expressão diferencial de miRNAs circulantes a doenças cardiovasculares, em especial a aterosclerose. Por se tratar de uma doença vascular complexa que afeta diferentes artérias, cada trabalho investigou uma faceta diferente da aterosclerose, como por exemplo a doença arterial coronariana, as placas ateroscleróticas em membros inferiores e a estenose carotídea (65, 66). Alguns miRNAs circulantes se destacaram como possíveis biomarcadores para a aterosclerose, como os 21, 30, 126 e miR-122-3p, enquanto que outros aparentam ser específicos para artérias com doença aterosclerótica, como por exemplo os miR-92, miR-218, miR-221 e miR-320b na estenose carotídea (65, 66). No entanto, os trabalhos que fizeram essa associação possuem algumas limitações.
De modo geral, os trabalhos que buscam identificar miRNAs circulantes diferentemente expressos na aterosclerose utilizam duas técnicas principais: a PCR quantitativa (qPCR ou RT-PCR) e o microarray (65, 66, 67). Ambas as técnicas são relativamente de baixo custo e com protocolos bem estabelecidos, no entanto, elas possuem baixo rendimento e estão limitadas a análise de miRNAs conhecidos (63). Portanto, seria interessante utilizar uma técnica mais abrangente para identificar possíveis biomarcadores para a aterosclerose, como o sequenciamento de pequenos RNAs (RNA-seq) (63). Esta técnica possui um alto rendimento e é capaz de diferenciar sequências muito similares, além disso, o RNA-seq pode identificar novos miRNAs (63).
Apesar de alguns trabalhos terem identificado potenciais biomarcadores para a estenose carotídea, a limitação das técnicas utilizadas sugere que possivelmente outros miRNAs circulantes podem estar associados a doença.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Identificar miRNAs candidatos a biomarcadores para a presença de placa aterosclerótica em pacientes com estenose sintomática e assintomática da artéria carótida interna.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Determinar o perfil de expressão de miRNAs circulantes do plasma de pacientes com estenose sintomática e assintomática da artéria carótida interna utilizando o RNA-seq em diferentes grupos de pacientes, a saber: pacientes com estenose grave assintomática, pacientes com estenose grave sintomática, pacientes com estenose leve assintomática e pacientes que sofreram AVC isquêmico e que apresentam estenose leve assintomática.
- Comparar os perfis de expressão de microRNAs nos diferentes grupos de pacientes e identificar microRNAs diferencialmente expressos em pacientes com estenose sintomática e assintomática da artéria carótida interna.
- Identificar as vias biológicas ligadas aos microRNAs diferencialmente expressos encontrados.
3. MÉTODO 3.1. COORTE
O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) com o parecer de número 3.141.975 e com o certificado de apresentação de apreciação ética de número 12112913.3.0000.5404 (Anexo 8.1). Participantes da pesquisa foram recrutados no Hospital das Clínicas (HC) da Unicamp e todos assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 8.2). O recrutamento de voluntários se deu de janeiro de 2017 a Abril de 2019, sendo que durante este período o TCLE foi atualizado em Dezembro de 2017 (Anexo 8.3) e em Agosto de 2018 (Anexo 8.4).
Este trabalho possui uma coorte composta por pacientes voluntários dos ambulatórios de Neurovascular, Cirurgia Vascular e Hipertensão do HC da Unicamp. Todos os participantes foram submetidos a uma avaliação clínica, feita por médicos residentes, e uma discussão de caso, feita pelos professores doutores responsáveis pelo ambulatório. Após o recrutamento, informações acerca das características clínico-demográficas dos pacientes foram obtidas por meio de entrevistas ou por consulta aos prontuários médicos do hospital, com a devida autorização. A tabela 1 lista as categorias de informações coletadas dos pacientes.
Tabela 1: Lista de características clínico-demográficas obtidas dos pacientes participantes da pesquisa.
Informação Observações
Doença vascular Presença de placa aterosclerótica nas artérias carótidas, coronárias, vertebrais e intracranianas.
Estenose vascular Grau de estenose na artéria carótida interna calculado com dados dos exames de imagem Ultrassonografia Doppler,
Angiografia e Ressonância Magnética Acidente Vascular
Cerebral
Diagnóstico médico baseado em exames de imagem, como Ressonância Magnética e Tomografia, e avaliação clínica
Idade Na data da coleta
(conclusão)
Informação Observações
Sexo Biológico Feminino ou Masculino
Hipertensão arterial Diagnóstico médico
Diabetes Mellitus Diagnóstico médico
Dislipidemia Diagnóstico médico
Tabagismo Ativo ou ex-tabagismo
Índice de Massa Corporal Altura (m) e peso (kg) mensurados no dia da coleta ou obtidos de dados recentes do prontuário
Insuficiência Cardíaca Diagnóstico médico
Doenças Neurológicas Diagnóstico médico
Câncer Diagnóstico médico
Fármacos Anti-hipertensivos, Anti-plaquetários, Estatinas e Metforminas Histórico Clínico Informações adicionais relacionadas ao histórico clínico do
paciente
A coorte foi dividida em quatro grupos de acordo com o diagnóstico médico relacionado ao Acidente Vascular Cerebral e ao grau de estenose nas artérias carótidas internas, sendo que os grupos são denominados Estenose Grave Assintomática, Estenose Grave Sintomática, Estenose Leve Assintomática e AVC Isquêmico com Estenose Leve Assintomática. O critério de exclusão comum aos quatro grupos é o diagnóstico confirmado de doenças neurológicas ou autoimunes.
3.1.1. ESTENOSE GRAVE ASSINTOMÁTICA (EGA)
Este grupo é composto por pacientes dos ambulatórios de Cirurgia Vascular e Neurovascular diagnosticados com estenose grave assintomática da artéria carótida interna. A presença da placa aterosclerótica foi avaliada por Cirurgiões Vasculares e/ou Neurologistas
utilizando como referência os exames de US Doppler, Angiografia ou RM. Eventos prévios de AVC ou AIT foram analisados por anamnese e avaliação da RM dos pacientes. Os exames de imagem utilizados nas avaliações clínicas não foram realizados em sua totalidade no HC da Unicamp devido às diferentes proveniências dos pacientes. A tabela 2 lista os critérios de inclusão e exclusão para este grupo.
Tabela 2: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Grave Assintomática da artéria carótida interna
Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão
● Maiores de 18 anos
● Presença de estenose grave (70-99%) na artéria carótida interna calculada utilizando como referência exames de imagem
● Doenças neurológicas ● Doenças autoimunes ● AVC ou AIT prévio
3.1.2. ESTENOSE GRAVE SINTOMÁTICA (EGS)
Este grupo é composto por pacientes do ambulatório de Neurovascular e Cirurgia Vascular diagnosticados com estenose grave sintomática da artéria carótida interna. Estes são pacientes que sofreram um acidente vascular cerebral devido ao rompimento de uma placa aterosclerótica grave na artéria carótida interna. O diagnóstico de AVC isquêmico foi feito por neurologistas dos respectivos pronto-atendimentos procurados pelos pacientes. A trombolização durante a fase aguda do AVC não foi considerada um critério de inclusão ou exclusão durante o recrutamento da coorte.
A coleta dos pacientes foi realizada após, no mínimo, três meses do acidente vascular cerebral. A etiologia do AVC foi identificada como doença de grandes artérias por Neurologistas do ambulatório de Neurovascular segundo as orientações da Sociedade Brasileira de Neurologia. Foram utilizadas como referência para este diagnóstico exames de imagem do crânio, RM ou tomografia, e da artéria carótida interna, US Doppler, Angiografia ou RM. Os exames de imagem utilizados nas avaliações clínicas não foram realizados em sua totalidade no HC da Unicamp. A tabela 3 lista os critérios de inclusão e exclusão para este grupo.
Tabela 3: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Grave Sintomática da artéria carótida interna
Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão
● Maiores de 18 anos
● AVC isquêmico causado por doença de grandes artérias diagnosticado por neurologistas do HC da Unicamp ● Presença de estenose grave (70-99%)
na artéria carótida interna calculada utilizando como referência exames de imagem
● Doenças neurológicas ● Doenças autoimunes ● AVC na fase aguda
● AVC com etiologia não definida
3.1.3. ESTENOSE LEVE ASSINTOMÁTICA (ELA)
Este grupo é composto por pacientes do ambulatório de Hipertensão, uma divisão do departamento de Cardiologia do HC da Unicamp, que foram recrutados para participar da pesquisa como controles. Sendo assim, estes são pacientes que possuem placa aterosclerótica leve na artéria carótida interna e que nunca sofreram um AVC ou AIT.
Os pacientes foram recrutados antes da consulta médica para uma entrevista seguida pela coleta de sangue e, por fim, um exame de US Doppler onde se foi avaliado o grau de estenose na artéria carótida interna. Após comprovação da ausência de placa ou presença de estenose leve (<30%), uma RM sem contraste foi agendada utilizando o protocolo para AVC estabelecido pelo laboratório de Neuroimagem do HC da Unicamp no equipamento de 3 Teslas Philips Achieva.
A presença da placa aterosclerótica foi avaliada por um único cardiologista utilizando como referência a US Doppler feita no aparelho GE Vivid Q. Eventos prévios de AVC foram avaliados por um único neurologista utilizando como referência a RM realizada no HC da Unicamp. A tabela 4 lista os critérios de inclusão e exclusão para este grupo.
Tabela 4: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Leve Assintomática da artéria carótida interna
Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão
● Maiores de 18 anos
● Ausência de placa aterosclerótica na artéria carótida interna ou presença de estenose leve (<30%) na artéria carótida interna calculada utilizando como referência exames de imagem ● Ausência de eventos prévios de AVC
ou AIT
● Doenças neurológicas ● Doenças autoimunes
● Evento Cardiovascular prévio
3.1.4. AVC ISQUÊMICO E ESTENOSE LEVE ASSINTOMÁTICA (AVCi-ELA) Este grupo é composto por pacientes do ambulatório de Neurovascular que foram recrutados para participar da pesquisa como controles. Sendo assim, estes são pacientes que sofreram AVC isquêmico, assim como o grupo EGS, mas que possuem uma etiologia que não é a doença de grandes artérias. O diagnóstico de AVC isquêmico foi feito por neurologistas dos respectivos pronto-atendimentos procurados pelos pacientes. A trombolização durante a fase aguda do AVC não foi considerada um critério de inclusão ou exclusão durante o recrutamento da coorte.
A coleta dos pacientes foi realizada após, no mínimo, três meses do acidente vascular cerebral. A etiologia do AVC foi identificada como não sendo doença de grandes artérias por Neurologistas do ambulatório de Neurovascular segundo as orientações da sociedade brasileira de neurologia. Foram utilizadas como referências para este diagnóstico exames de imagem do crânio, RM ou tomografia, e da artéria carótida interna, US Doppler, Angiografia ou RM. Os exames de imagem utilizados nas avaliações clínicas não foram realizados em sua totalidade no HC da Unicamp. A tabela 5 lista os critérios de inclusão e exclusão para este grupo.
Tabela 5: Critérios de inclusão e exclusão para o grupo de pacientes com Estenose Leve Assintomática da artéria carótida interna que sofreram um AVCi prévio
Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão
● Maiores de 18 anos
● Ausência de placa aterosclerótica na artéria carótida interna ou presença de estenose leve (<30%) na artéria carótida interna calculada utilizando como referência exames de imagem ● AVC isquêmico não causado por
doença de grandes artérias diagnosticado por neurologistas.
● Doenças neurológicas ● Doenças autoimunes
● AVC isquêmico na fase aguda
3.2. COLETA E PROCESSAMENTO
Amostras de sangue periférico foram coletadas de pacientes voluntários no dia da consulta ambulatorial. Foram utilizadas agulhas de medidas 21G e 23G para coleta em tubos à vácuo contendo o anticoagulante EDTA. Em pacientes com veias de difícil acesso, o sangue foi coletado com o auxílio de uma seringa seguida da transferência imediata para um tubo com EDTA. Todas as amostras foram devidamente homogeneizadas e armazenadas em gelo por até duas horas para evitar coagulação e degradação das moléculas de miRNA.
No laboratório, os tubos com sangue periférico e EDTA foram centrifugados a 2500 RPM por 10 minutos a 4º C. Após esta etapa, as amostras apresentaram três fases: plasma, células branca e células vermelhas. Utilizando uma ponteira com filtro, o plasma foi cuidadosamente transferido para tubos eppendorf de 1,5 mL. Os tubos foram armazenados a -80 ºC até posterior extração de RNA total.
3.3. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL
Para a extração de RNA Total a partir do plasma foi utilizado o kit mirVanaTM ParisTM (Thermo Fisher Scientific) com algumas modificações à recomendação do fabricante. Este produto foi desenvolvido especialmente para o isolamento e purificação de moléculas que podem ser utilizadas no estudo de expressão, processamento e função de pequenos RNAs. O kit mirVanaTM ParisTM pode ser utilizado para a extração de RNA total a partir de amostras
líquidas como sangue fresco, tecido homogeneizado e plasma, sendo que nestes casos o protocolo é adaptado para garantir maior eficiência.
As amostras de plasma dos pacientes armazenadas a -80 ºC foram descongeladas no gelo de 30 a 60 minutos antes do início do protocolo. Devido à baixa concentração de miRNAs circulantes nas amostras, foi-se utilizado o dobro de plasma (1250 ul) do que o sugerido no protocolo (625 ul), sendo que os volumes dos reagentes utilizados também foram ajustados. Para melhorar a eficiência da extração, foram adicionados dois passos ao protocolo: adição de acrilamida linear e eluição em H2O RNAse Free. A acrilamida linear é um co-precipitante comumente utilizado para aumentar a concentração de moléculas de RNA obtidas em extrações (68, 69). Para melhorar a eficiência do kit mirVanaTM ParisTM, foi-se utilizado 4 ul de acrilamida linear 5 mg/mL (Thermo Fisher Scientific) durante a extração.
As próximas etapas da extração ocorreram de acordo com o protocolo estabelecido pelo fabricante. As amostras de RNA purificado foram diluídas em 80 ul de H2O RNAse Free e quantificadas no Epoch. Por fim, as amostras de RNA total foram armazenadas a -80 ºC para posterior utilização na preparação de bibliotecas e validação por RT-PCR.
3.4. BIBLIOTECAS DE cDNA
Para a síntese de bibliotecas de cDNA foi utilizado o kit QIAseq® miRNA Library (QIAGEN). O kit QIAseq® miRNA Library permite a preparação de bibliotecas de cDNA a partir de miRNAs maduros. Isto é possível pois o kit possui como uma de suas etapas iniciais a ligação de adaptadores 3’ e 5’ específicos a essas moléculas. Portanto, a utilização de amostras de RNA total para a preparação das bibliotecas de cDNA não afetam o resultado final do experimento.
As amostras de RNA total dos pacientes foram retiradas do armazenamento a -80 ºC e mantidas no gelo até o descongelamento. A preparação das bibliotecas de cDNA foi feita segundo o protocolo original do kit QIAseq® miRNA Library, exceto na primeira etapa do processo. Nesta etapa, foram adicionados 10 uL de RNA total à reação, um volume duas vezes maior do que o sugerido pelo kit para amostras provindas de plasma ou soro (5 uL). O volume dos outros reagentes utilizados no protocolo se manteve o mesmo do que os sugeridos originalmente.
Foram utilizados no total 48 reverse primers com sequências pré-estabelecidas pela QIAGEN para indexação das amostras. Após o fim do protocolo, as bibliotecas de cDNA foram armazenadas a -20 ºC até o controle de qualidade e multiplexação.
3.5. CONTROLE DE QUALIDADE E QUANTIFICAÇÃO
O controle de qualidade das bibliotecas de cDNA foi feito utilizando o kit Bioanalyzer High Sensitivity DNA (Agilent Technologies) e o equipamento 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Para esta análise, o tamanho de um fragmento completo (miRNA + Adaptador + Index) da biblioteca de cDNA feito com o kit QIAseq® miRNA Library é de 180 bp. Já os fragmentos sem o miRNA maduro, ou seja, dímeros de adaptadores, apresentam um comprimento de 157 bp. A análise por Bioanalyzer High Sensitivity DNA é capaz de diferenciar eficientemente ambos os fragmentos de interesse. Desse modo, foi-se avaliada a presença de fragmentos de 180 bp. Bibliotecas de cDNA que apresentaram picos de 180 e 157 bp não foram purificadas devido a sua baixa concentração. Amostras sem picos de 180 bp foram separadas para uma segunda síntese de bibliotecas de cDNA.
Após o controle de qualidade, todas as amostras foram quantificadas utilizando o kit QubitTM dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific) no fluorômetro QubitTM 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Além disso, foi-se utilizada uma segunda técnica de quantificação baseada em PCR de tempo real utilizando o kit KAPA Library Quantification (Roche). Este produto foi desenvolvido especialmente para a quantificação de bibliotecas de cDNA que serão multiplexadas e sequenciadas.
3.6. MULTIPLEXAÇÃO E SEQUENCIAMENTO
As bibliotecas de cDNA foram multiplexadas de maneira equimolar de acordo com as quantificações feitas por Qubit ou por KAPA. A molaridade de cada amostra foi determinada utilizando uma equação específica para as bibliotecas sintetizadas com o kit QIAseq® miRNA Library: (X ng/μl)(106)/(112450) = Y nM. Após determinar a molaridade das amostras, as bibliotecas foram diluidas para 10 nM utilizando H2O nuclease free.
As amostras foram multiplexadas em pools de 36 bibliotecas cada. Os componentes de cada pool foram selecionados de acordo com a sua indexação, sendo que outras bibliotecas de cDNA do mesmo grupo de pesquisa também foram multiplexadas. Após a preparação dos pools, as amostras foram transferidas para tubos GenTegraTM que garantem a estabilidade do DNA em diversas temperaturas através da utilização de uma matriz quimicamente inerte. As amostras foram enviadas para o sequenciamento em tubos GenTegraTM após passarem por uma etapa de evaporação utilizando o equipamento VacufugeTM Concentrator 5301 (Eppendorf).
Após o recebimento das amostras pela empresa responsável pelo sequenciamento, os pools foram ressuspendidos em H2O nuclease free. Todas as bibliotecas passaram por um novo controle de qualidade utilizando o chip Bioanalyzer DNA High Sensitivity (Agilent
Technologies) e uma nova quantificação utilizando a técnica de LightCycle qPCR (Illumina). Ao fim do controle de qualidade, as amostras foram diluídas para 4 nM, conforme o sugerido pelo protocolo do kit QIAseq® miRNA Library.
O sequenciamento foi feito através da plataforma HiSeq 2500 (Ilumina) com o protocolo para pequenos RNAs estabelecido pela empresa responsável. Os parâmetros estabelecidos foram o sequenciamento single end de 50 bp sendo que cada lane gerou entre 110 a 115 milhões de reads. Considerando que foram multiplexadas 36 amostras, cada biblioteca possui entre 3 a 3,2 milhões de reads. Os dados do sequenciamento foram enviados pela empresa responsável em arquivos demultiplexados.
3.7. ANÁLISE DE BIOINFORMÁTICA
Inicialmente, foi-se utilizada a ferramenta Trim Galore 0.6 para o processamento dos dados do sequenciamento. Em um primeiro corte, todas as sequências do adaptador 3’ QIAseq® (AACTGTAGGCACCATCAAT) foram removidas. Devido aos parâmetros do sequenciamento, cada read possui até 50 bp, portanto, o adaptador 5’ não foi sequenciado. Após o corte, os dados resultantes foram filtrados para sequências entre 18 e 22 nucleotídeos, o que corresponde ao comprimento médio de um miRNA maduro. Em seguida, as sequências filtradas foram alinhadas com um genoma de referência humano (GRCh38) utilizando o software Burrows-Wheeler Aligner. O próximo passo da análise foi a contagem das sequências alinhadas utilizando o software featureCounts. Além disso, esta mesma ferramenta fez a anotação dos miRNAs maduros utilizando como referência o banco de dados miRBase v22. Desse modo, foram obtidas as contagens de todos os miRNAs maduros conhecidos presentes em cada amostra sequenciada.
A próxima etapa da análise consistiu na aplicação de dois filtros utilizando o pacote DESeq2 v1.26 para R. O primeiro filtro foi aplicado de modo a evitar resultados falso-negativos através da remoção de amostras cujas contagens totais de miRNAs maduros conhecidos eram menores do que 1.000.000. O segundo filtro removeu sequências com baixa contagem sendo que foram mantidos apenas os miRNAs cuja soma em todas as amostras era maior do que o total de amostras analisadas.
Por fim, as amostras foram reunidas nos quatro grupos pré-estabelecidos (EGA, EGS, ELA e AVCi-ELA) para análise da expressão diferencial. No total, foram realizadas cinco comparações entre os grupos utilizando a ferramenta DESeq2 v1.26 (tabela 6). Cada análise por DESeq2 v1.26 resulta em um ranking de miRNAs diferencialmente expressos com seus valores de log2 fold change, p-valores e p-valores ajustados. O p-valor ajustado é obtido após
a correção do p-valor para múltiplos testes através do método Benjamini-Hochberg. Neste trabalho, foram considerados como miRNAs diferencialmente expressos aqueles com p-valor ajustado <0,05 ou que apresentam relevância biológica.
Tabela 6: Lista de comparações feitas para a análise de expressão diferencial. Comparações Grupos de interesse Grupos controle
1 Estenose Grave Assintomática (EGA) Estenose Grave Sintomática (EGS) 2 Estenose Grave Sintomática (EGS) Estenose Leve Assintomática (ELA) 3 Estenose Grave Assintomática (EGA) Estenose Leve Assintomática (ELA) 4 Estenose Grave Sintomática (EGS)
AVC Isquêmico com Estenose Leve Assintomática (AVCi-ELA) 5 Estenose Grave Assintomática e Estenose Grave Sintomática (EGA+EGS) Estenose Leve Assintomática e AVC Isquêmico com Estenose
Leve Assintomática (ELA+AVCi-ELA)
4. RESULTADOS 4.1. COORTE
A coorte deste estudo é composta por 39 pacientes divididos em quatro grupos: cinco indivíduos com Estenose Grave Assintomática, treze com Estenose Grave Sintomática, treze com Estenose Leve Assintomática e oito pacientes que sofreram AVC isquêmico, mas que apresentam Estenose Leve Assintomática. A figura 1 demonstra o processo de seleção da coorte. E a tabela 7 lista os dados clínico-demográficos dos pacientes recrutados para o estudo.
Tabela 7: Dados sociodemográficos e clínicos dos pacientes componentes dos quatro grupos estudados. Os p valores foram obtidos através de um teste de qui-quadrado.
EGA EGS ELA AVCi-ELA p
Pacientes, n 5 13 13 8 - Idade média (anos), Desvio Padrão 71.4 (6.65) 69.0 (9.55) 58.0 (10.61) 59.0 (14.53) Tabela 8 Idade ≥75 anos, n (%) 2 (40%) 4 (30%) 0 (0%) 1 (12%) 0.22 Idade 65 a 74 anos, n (%) 2 (40%) 5 (38%) 3 (23%) 3 (37%) 0.76 Sexo (feminino), n (%) 2 (40%) 5 (38%) 9 (69%) 4 (50%) 0.15 Hipertensão arterial, n (%) 4 (80%) 10 (77%) 13 (100%) 3 (37%) 0.02 Diabetes Mellitus, n (%) 3 (60%) 3 (23%) 6 (46%) 1 (12%) 0.33 Insuficiência cardíaca, n (%) 0 (0%) 1 (7.7%) 0 (0%) 0 (0%) 1 CHA2DS2-VASc score, média 4.00 5.46 2.76 3.75 Tabela 9 Dislipidemia, n (%) 4 (80%) 7 (53%) 8 (61%) 1 (12%) 0.11 Obesidade, n (%) 3 (60%) 1 (7.7%) 5 (38%) 0 (0%) 0.09 (continua)
(conclusão)
EGA EGS ELA AVCi-ELA p
Tabagismo, n (%) 1 (20%) 11 (84%) 6 (46%) 1 (12%) 0.002 Fármacos Anti-hipertensivos, n (%) 4 (80%) 7 (54%) 13 (100%) 3 (37%) 0.02 Fármacos Estatinas, n (%) 5 (100%) 8 (61%) 7 (53%) 5 (62%) 0.78 Fármacos Antiplaquetários, n (%) 5 (100%) 11 (84%) 2 (15%) 7 (87%) 0.07 Fármacos Metformina, n (%) 3 (60%) 2 (15%) 5 (38%) 0 (0%) 0.17
Para os quatro grupos estudados, as idades dos pacientes apresentam uma distribuição normal (figura 2). Os valores para o teste anova feito com as idades dos quatro grupos estão listados na tabela 8.
Figura 2 - Gráfico de distribuição das idades nos quatro grupos integrantes do estudo: Estenose Grave Assintomática (EGA), Estenose Grave Sintomática (EGS), Estenose Leve
Tabela 8: Valores do teste anova feito com as idades dos pacientes integrantes dos quatro grupos estudados.
Comparação p
EGA x EGS 0.974
EGA x ELA 0.108
EGS x ELA 0.066
EGS x AVCi-ELA 0.187
Para cada um dos quatro grupos foi-se calculado o risco cardiovascular utilizando o score CHA2DS2-VASc (68). Os valores, listados na tabela 7, foram utilizados em um teste anova (tabela 9).
Tabela 9: Valores do teste anova feito com os scores CHA2DS2-VASc dos pacientes integrantes dos quatro grupos estudados.
Comparação p
EGA x EGS 0.049
EGA x ELA 0.123
EGS x ELA 6x10-7
EGS x AVCi-ELA 0.003
Em relação aos fármacos utilizados pelos pacientes integrantes da pesquisa, os anti-hipertensivos são um dos mais comumente mencionados, especialmente devido à inclusão de pacientes do ambulatório de hipertensão. Considerando os diferentes mecanismos de ação de anti-hipertensivos, a tabela 10 lista a frequência de suas diferentes classes na coorte do presente estudo.
Tabela 10: Utilização de diferentes classes de anti-hipertensivos por pacientes dos quatro grupos estudados.
EGA EGS ELA AVCi-ELA p
Diurético, n (%) 2 (40%) 2 (15%) 9 (69%) 2 (25%) 0.020 Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina 1, n (%) 1 (20%) 1 (7%) 3 (23%) 0 (0%) 0.408 Bloqueador Canal de Cálcio, n(%) 0 (0%) 0 (0%) 6 (46%) 2 (25%) 0.005 Beta-bloqueador, n (%) 0 (0%) 4 (30%) 8 (61%) 0 (0%) 0.002 Antagonista Receptores de Angiotensina, n (%) 3 (60%) 4 (30%) 8 (61%) 2 (25%) 0.208
4.2. MICRORNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS
A análise de expressão diferencial identificou miRNA com p valor ajustado menor que 0,05: hsa-miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p. Das cinco comparações realizadas, estes miRNAs estavam diferencialmente expressos em quatro delas. As sessões abaixo listam os resultados encontrados para cada comparação.
4.2.1. EGA VS. EGS
A primeira análise de expressão diferencial do estudo comparou 834 miRNAs entre os grupos EGA e EGS. No entanto, nenhum deles apresentou um p valor ajustado menor que 0,05. A tabela 11 lista os dez miRNAs com menor p valor ajustado na comparação EGA vs EGS.
Tabela 11: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGA e EGS.
Nome log2FoldChange p valor p valor ajustado
hsa-miR-10399-5p -7.45536 9.04398 e-4 0.65568 hsa-miR-6859-5p 1.66475 0.49655 1 hsa-miR-12136 0.93210 0.50618 1 hsa-miR-200b-5p 0 1 1 hsa-miR-200b-3p -2.15525 0.07924 1 hsa-miR-200a-3p 0.04852 0.96249 1 hsa-miR-429 2.05625 0.35164 1 hsa-miR-6726-5p -3.40844 0.49689 1 hsa-miR-34a-5p -1.15452 0.07496 1 hsa-miR-5697 2.26747 0.64648 1
4.2.2. EGS VS. ELA
A análise da expressão diferencial de 834 miRNAs entre os grupos EGS e ELA identificou três miRNAs com p valor ajustados < 0.05: hsa-miR-508-3p, hsa-miR-4677-3p e 5p. Considerando os valores de log2 Fold Change, os miRNAs hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p estavam hiper expressos no grupo EGS em relação ao ELA. Por outro lado, hsa-miR-508-3p estava hipo expresso no grupo de EGS. A tabela 12 lista os dez miRNAs com menor p valor ajustado na comparação EGS vs ELA.
Tabela 12: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGS e ELA.
Nome log2FoldChange p valor p valor ajustado
hsa-miR-508-3p -24.16779 4.94237 e-26 3.58322 e-23
hsa-miR-4677-5p 18.66403 2.46060 e-9 8.91969 e-7
hsa-miR-4677-3p 15.89998 7.24365 e-7 1.75054 e-4
hsa-miR-4646-5p 5.00604 0.00256 0.46425 hsa-miR-6859-5p -2.71985 0.13745 0.99961 hsa-miR-12136 -1.90823 0.06794 0.99961 hsa-miR-200b-5p -4.59987 0.21551 0.99961 hsa-miR-200b-3p -0.43749 0.62764 0.99961 hsa-miR-200a-3p 0.02728 0.97171 0.99961 hsa-miR-429 -1.65378 0.31623 0.99961
4.2.3. EGA VS. ELA
A análise da expressão diferencial de 834 miRNAs entre os grupos EGA e ELA identificou dois miRNAs com p valor ajustados < 0.05: hsa-miR-508-3p e hsa-miR-4677-3p. O hsa-miR-4677-5p foi considerado na análise devido a sua relevância biológica. Considerando os valores de log2 Fold Change, os miRNAs hsa-miR-4677-3p e hsa-miR-4677-5p estavam hiper expressos no grupo EGA em relação ao ELA, enquanto que o hsa-miR-508-3p estava hipo expresso no grupo de EGA. A tabela 13 lista os dez miRNAs com menor p valor ajustado na comparação EGA vs ELA.
Tabela 13: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGA vs ELA.
Nome log2FoldChange p valor p valor ajustado
hsa-miR-508-3p -21.80856 2.35804 e-12 1.70957 e-9
hsa-miR-4677-3p 18.63120 1.13992 e-5 0.00413 hsa-miR-4677-5p 15.15715 3.42690 e-4 0.08281 hsa-miR-30a-5p -1.21885 4.94720 e-4 0.08966 hsa-miR-22-3p -1.03278 0.00283 0.25715 hsa-miR-206 -2.78520 0.00191 0.25715 hsa-miR-10399-5p -6.72243 0.00278 0.25715 hsa-miR-223-5p 1.07972 0.00246 0.25715 hsa-miR-146b-5p 1.00727 0.00591 0.42464 hsa-miR-141-3p -2.19864 0.00645 0.42464
4.2.4. EGS vs. AVCi-ELA
A análise da expressão diferencial de 834 miRNAs entre os grupos EGS e AVCi-ELA identificou dois miRNAs com p valor ajustados < 0.05: hsa-miR-508-3p e hsa-miR-4677-3p. Considerando os valores de log2 Fold Change, o miRNA hsa-miR-4677-3p estava hiper expresso e o hsa-miR-508-3p estava hipo expresso no grupo EGS em relação ao AVCi-ELA. A tabela 14 lista os dez miRNAs com menor p valor ajustado na comparação EGS e AVCi-ELA.
Tabela 14: MicroRNAs diferencialmente expressos entre os grupos EGS e AVCi-ELA
Nome log2FoldChange p valor p valor ajustado
hsa-miR-508-3p -26.17114 7.89036 e-24 5.72051 e-21
hsa-miR-4677-3p 30.12847 2.75138 e-16 9.97375 e-14
hsa-miR-1273h-3p 4.49265 2.88563 e-4 0.06973 hsa-miR-126-5p 1.30333 4.43085 e-4 0.08030 hsa-miR-19a-3p 1.00934 0.00138 0.14273 hsa-miR-423-5p -0.92969 0.00122 0.14273 hsa-miR-25-5p -1.57552 0.00109 0.14273 hsa-miR-1277-5p 2.95664 0.00157 0.14273 hsa-miR-92b-5p -1.47496 0.00219 0.17696 hsa-miR-126-3p 0.65234 0.00253 0.18410
