Análise do perfil metabólico e lipoproteico por RMN de ¹H basal

9.1.2.1. Preparação das amostras para a análise por RMN de ¹H

Ao plasma (400,0 L) foi adicionado uma solução padrão em D2O (200,0

L) contendo tampão fosfato (0,5 mmol.L-1; pH=7,4), TMSP (1,0 mmol.L-1) e formato de sódio (5,0 mmol.L-1). O sinal de deutério (D2O) foi utilizado para travar o campo

magnético (“lock” do equipamento), enquanto os sinais de TMSP e formato de sódio tiveram dupla função: referência interna (TMSP = 0,00 ppm e formato de sódio = 8,480 ppm) e providenciar singletos finos para ajuste da homogeneidade do campo magnético (“shimming”). Formato de sódio foi adicionado às amostras como segundo padrão interno, pois o TMSP interage com as proteínas presentes no plasma levando ao alargamento do sinal.

A mistura foi homogeneizada e centrifugada (5.000 rpm por 15 minutos a 4ºC) para remoção de eventuais partículas em suspensão. Por fim, parte do

amostras foram preparadas e analisadas em duplicata.

9.1.2.2. Obtenção dos espectros de RMN de ¹H editados por T2 e espectros de RMN

de ¹H editados por difusão

Na obtenção dos espectros de RMN de ¹H editados por T2 foi utilizada a

sequência de pulsos cpmgpr. A supressão do sinal da água (H2O/HDO) foi realizada

por pré-saturação, enquanto os sinais alargados provenientes das proteínas e lipoproteínas foram suprimidos aplicando-se a sequência de pulsos Carr–Purcell– Meiboom–Gill. Na obtenção dos espectros de RMN de ¹H editados por difusão foi utilizada a sequência stebpgp1s191d. A supressão do sinal da água foi realizada pela sequência de WATERGATE 3-9-19, enquanto a supressão dos sinais finos, referentes aos metabólitos de baixa massa molar, foi realizada pela sequência de eco de spin estimulado (“Stimulated Echo experiment using bipolar gradients”).

Todos os espectros foram obtidos utilizando um espectrômetro Bruker Avance III de 9,4 T (400,1819 MHz, frequência do 1H), equipado com uma sonda TBI (5 mm o.d.) e trocador de amostra. Todos os experimentos foram conduzidos sem giro. Os seguintes parâmetros foram empregados na aquisição dos espectros: largura espectral igual a 6010 Hz, 32k pontos digitalizados, tempo de aquisição igual a 2,73 s, tempo de repetição igual a 5 s, largura do pulso de 90° de ¹H igual a 11,25

s, temperatura de 298 K e ganho ajustado automaticamente para cada amostra. Adicionalmente, alguns parâmetros específicos das respectivas sequências também foram ajustados. Para a sequência cpmgpr os tempos de evolução e de spin-eco total foram iguais 100 µs e 200 ms, respectivamente. A supressão do sinal do solvente foi realizada por um pulso seletivo em ressonância de 1,0x10-3 W aplicado durante o intervalo entre os pulsos. Sendo realizadas 64 promediações. Para sequência de stebpgp1s191d foi utilizado um gradiente de campo de pulsos formatados com 90% da intensidade máxima (32 G.cm-1), tempo de duração () igual 2,0 ms seguido por um atraso (Δ) de 100 ms. Na supressão do sinal da água por WARTERGATE, o delay binomial e o gradiente de campo foram iguais a 17,0 µs e 1,0 ms, respectivamente. Finalmente, foram realizadas 32 promediações.

espectros de RMN de ¹H editados por difusão

O processamento dos espectros foi realizado no software TopSpin (v3.1, Bruker Biospin). Foram realizados os procedimentos de zero-filling para 128k e apodização utilizando uma função exponencial com alargamento de linha igual a 1,0 Hz (espectros editados por T2) e 3,0 Hz (espectros editados por difusão). Após a

transformada de Fourier, a fase e a linha de base dos espectros foram corrigidas automaticamente, seguidas de ajustes manuais quando necessário. Os espectros foram referenciados com base no sinal do formato de sódio para os espectros editados por T2 ( = 8,480 ppm; -CH3, singleto) e pelo sinal da metila de

lipoproteínas ( = 0,800 ppm; -CH3) para os espectros editados por difusão.

Finalmente, os espectros foram exportados no formato ACSII.

9.1.2. 4. Obtenção dos espectros de TOCSY 1D-seletivo

Espectros de correlação total homonuclear 1D seletivos (TOCSY 1D- seletivo) foram empregados para confirmação do assinalamento dos sinais de interesse presentes nos espectros de RMN de ¹H editados por T2. A sequência de

pulsos selmlgp foi utilizada na aquisição dos espectros. Esta sequência utiliza gradiente de campo pulsado (PFG) para excitação seletiva do sinal de interesse e o esquema MLEV-17 para a trava de spin. Os seguintes parâmetros foram empregados na aquisição dos espectros de TOCSY 1D-seletivo: largura espectral igual a 8.223Hz, 32k pontos digitalizados e acúmulo de 128 transientes. O tempo de aquisição igual a 3,98 s. Outros parâmetros relevantes como frequência de irradiação, duração do pulso seletivo e tempo de trava de spin foram ajustados para cada ressonância e podem ser encontrados junto aos respectivos espectros (ANEXO A).

Os lipídios presentes no plasma foram extraídos segundo a metodologia de Folch-modificada.159,160 Em um eppendorf contendo plasma (100 L) foi adicionado uma solução padrão (10,0 L) contendo galato de etila e ácido nonadecanoico (5,0 e 20 mg.mL-1, respectivamente). Galato de etila foi utilizado como antioxidante e ácido nonadecanoico como padrão interno. Em seguida, adicionou-se uma mistura de clorofórmio/metanol (1:2 v/v; 600 L), após agitação em vortex a mistura extratora foi mantida em repouso a 4°C por 15 minutos. A seguir adicionou-se mais clorofórmio (200 L) e a solução foi novamente agitada em vortex. Por fim, o procedimento de extração foi finalizado pela adição de uma solução aquosa de KCl (0,5 mmol.L-1, 200 L) seguida de nova agitação em vortex.

A mistura extratora foi então centrifugada (10.000 rpm por 10 minutos) e a fase inferior (clorofórmio), contendo o extrato lipídico, foi recolhida. A fase superior foi novamente extraída com clorofórmio (200 L). As fases orgânicas foram então reunidas e o extrato lipídico foi seco sobre sulfato de sódio anidro e concentrado a um volume final de 50 L a pressão reduzida. Para preparação dos ésteres metílicos de ácidos graxos, adicionou-se às amostras uma solução de ácido sulfúrico/metanol (5% de H2SO4 em metanol, 1,0 mL) seguido de aquecimento a 70°C por uma hora.

Os ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos por transesterificação, foram extraídos com de n-hexano (200 L) após adição de uma solução aquosa de KCl (0,5 mmol.L-1, 200 L) à mistura reacional e agitação em vortex. A fase superior foi recolhida e o procedimento de extração repetido. As fases orgânicas foram reunidas e tratadas com sulfato de sódio anidro, as amostras foram concentradas em fluxo de nitrogênio e redissolvidas em 50 µL de n-hexano bidestilado.

9.1.2.6. Separação dos ésteres metílicos de ácidos graxos por cromatografia a gás

A separação dos ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos por transesterificação dos AG presentes no plasma foi obtida num cromatógrafo a gás

159

Folch, J.; Lees, M.; Stanley, G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J. Biol. Chem. 1957, 226: 497-509.

160

Iverson, S.J.; Lang, S.L.C.; Cooper, M.H. Comparison of the Bligh and Dyer and Folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 2001, 36: 1283-1287.

Agilent), acoplado a um espectrômetro de massas (Hewlett Packard, 5973 Mass Seletive Detector). A amostra (1,0 L) foi injetada sem divisão de fluxo (“splitless”) a 250 °C, usando hélio como gás de arraste, na vazão de 1,2 mL.min-1. A programação de temperatura do forno do CG iniciou em 50 °C (mantida por 1 min), aquecida a 170ºC numa razão de 50 ºC/min, aquecida 260 °C numa razão de 3 °C/min e aquecida a 290°C a 50 ºC/min, temperatura na qual permaneceu por 5 minutos, o tempo total de corrida foi igual à 39 minutos.

Para identificação dos ésteres metílicos de ácidos graxos, espectros de massas no modo varredura de íons totais (m/z 40-440) foram obtidos com energia de ionização de 70 eV, patamar (“threshold”) igual a 100 e tempo de espera (“delay”) do solvente igual à 3,0 minutos. A temperatura da fonte de íons foi de 230°C e do quadrupolo 150 °C. Para as quantificações dos ésteres metílicos de ácidos graxos, os espectros de massas foram obtidos no modo monitoramento seletivo de íons, monitorando-se os íons de m/z 74, 79, 81 e 87, conforme descrito na literatura.65

9.1.2.7. Identificação dos AG presentes em plasma

Os ésteres metílicos de ácidos graxos preparados a partir dos AG presentes no plasma foram identificados pela comparação dos espectros de massas obtidos por varredura de íons totais ("full scan") com os espectros padrões da biblioteca NIST e por co-injeção de ésteres metílicos de ácidos graxos padrões.