UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Química
THIAGO INÁCIO BARROS LOPES
APLICAÇÕES DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR NO ESTUDO: DA CIRURGIA BARIÁTRICA, DA PRODUÇÃO DE ETANOL E DA DISTRIBUIÇÃO REGIOESPECÍFICA DE TRIACILGLICERÍDEOS.
CAMPINAS 2015
Tese de doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutor em QUÍMICA, na Área de QUÍMICA ORGÂNICA.
Orientadora: PROFA. DRA. ANITA JOCELYNE MARSAIOLI
CAMPINAS 2015
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente a Deus e a todos os meus familiares, em especial à minha esposa Mayara e minha filha Cecília, aos meus pais Cirça e Inácio, à minha irmã Aryane, ao meu cunhado Uilian e à minha sogra Marisa. Quero agradecer também a Profa. Dra. Anita J. Marsaioli, orientadora e amiga, pela confiança e orientação durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos colaboradores: Prof. Dr. Bruno Geloneze; Prof. Dr. José C. Pareja; Antônio R. Calixto; Profa. Dra. Márcia M. C. Ferreira; Marilene M. M. Ribeiro; Ming Chiu; Profa. Dra. Lireny A. G. Gonçalves; Prof. Dr. Antônio M. Júnior; Maria I. Berto; Glauciane R. D. Silva; Daniel I. P. Atala.
Aos meus colegas de laboratório: Adriana, André, Bárbara, Bruna, Célio, Daniele, Dávila, Diana, Eraldo, Francine, Haleem, Lair, Lucas, Marcelo, Michel, Ricardo e tantos outros colegas de curso pela amizade e companheirismo.
Agradeço ao pessoal do RMN: Sônia, Anderson, Gustavo e Paula pela amizade e apoio dispensados.
Agradeço a todos os professores do Instituto de Química da Unicamp, especialmente a Prof. Dra. Márcia Ferreira, por toda ajuda e ensinamentos de quimiometria e ao Prof. Dr. Cláudio Tormena pelo apoio e ensinamentos em RMN.
Agradeço a todos os membros e suplentes da banca Prof. Dr. Luciano Lião; Prof. Dr. Luiz Colnago; Prof. Dr. Cláudio Tormena; Prof. Dr. Ljubica Tasic; Prof. Dr. Jose Figueroa-Villar; Prof. Dr. Roberto Rittner e Prof. Dr. Márcia Ferreira pela disponibilidade e atenção.
Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP, processo n° 2012/09318-0) pela bolsa de doutorado e auxílio financeiro
concedido ao projeto.
Finalmente, agradeço a todos aqueles que contribuíram cada qual a sua maneira para realização deste sonho.
RESUMO
Esta tese apresenta aplicações de ressonância magnética nuclear no estudo da: cirurgia bariátrica, produção de etanol e distribuição regioespecífica de triacilglicerídeos. O primeiro capítulo reporta as principais alterações plasmáticas observadas para dez pacientes obesos 12 meses após Bypass Gástrico com reconstrução em Y de Roux. Observaram-se várias alterações no perfil metabólico como: diminuição nos níveis de glicose, lactato e aminoácidos de cadeia ramificada; aumento nas concentrações de corpos cetônicos, carnitinas e p-cresol. Quanto ao perfil lipoproteico houve: diminuição nos níveis de VLDL, LDL e lipídios insaturados; aumento nos níveis de HDL e fosfatidilcolina. Finalmente, observou-se diminuição na proporção de ácidos graxos insaturados, com consequentemente aumento na proporção de ácidos graxos saturados. No segundo capítulo, RMN de ¹H foi aplicado com sucesso no estudo do efeito de ultrassom na produção de etanol. A sequência de pulsos PRESAT forneceu os melhores resultados para quantificação de nove compostos de interesse com menor tempo de análise, quando comparado ao método de referência. O protocolo desenvolvido foi validado em termos de: linearidade, LOD, LOQ, precisão, exatidão, repetibilidade e seletividade. Porém, a aplicação do ultrassom diminuiu o rendimento do processo. Na ultima parte do trabalho, RMN de ¹³C foi empregada com sucesso no estudo da distribuição regioespecífica de triacilglicerídeos obtidos pela reação de interesterificação de misturas de óleo de girassol e óleo de girassol totalmente hidrogenado. De modo geral, a interesterificação catalisada quimicamente provoca uma redistribuição aleatória dos ácidos graxos, caracterizada pela inserção randômica de ácidos graxos saturados na posição sn-2 do glicerol. Por outro lado, a interesterificação catalisada enzimaticamente permitiu uma redistribuição parcialmente seletiva dos ácidos graxos, mantendo a prevalência dos ácidos graxos insaturados na posição sn-2. Porém, esta seletividade foi progressivamente diminuída com o aumento do tempo experimental.
ABSTRACT
This thesis shows applications of nuclear magnetic resonance in the study of: bariatric surgery, ethanol and regiospecific distribution triacylglycerides. The first chapter reports main alterations observed in the plasma for ten obese patients 12 months after Roux-en-Y gastric bypass. Several alterations in the metabolic profile as decrease of the glucose, lactate and branched chain amino acids levels; increasing concentrations of ketone bodies, carnitines and p-cresol. Regarding the lipoprotein profile it was observed: decreasing levels of VLDL, LDL and unsaturated lipids; increasing levels of HDL and phosphatidylcholine. Finally, the ratio of unsaturated: saturated fatty acids decreased. In the second chapter, ¹H NMR was applied to the study of ultrasound effect on ethanol production. The PRESAT pulses sequence provided the best quantification results for nine compounds related to fermentation process providing shorter analytic times, when compared to reference methods. The suggested protocol was fully validated in terms of: linearity, LOD, LOQ, precision, accuracy, repeatability and selectivity. However, the application of ultrasound decreased the yield of the fermentation process. In the last part of the work, ¹³C NMR was successfully employed in the study of regiospecific distribution from triacylglycerides obtained by chemical and enzymatic interesterification from sunflower oil and fully hydrogenated sunflower oil blend. In general, chemical interesterification produced a random redistribution of fatty acids, characterized by a random insertion of saturated fatty acids at the sn-2 position of the glycerol moiety. On the other hand, the enzymatic interesterification allowed a partially selective redistribution of fatty acids, maintaining the prevalence of unsaturated fatty acids at the sn-2 position. However, this selectivity decreased at increasing reaction times.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AG Ácidos graxosAGI Ácidos graxos insaturados AGS Ácidos graxos saturados
AQ Tempo de aquisição (do inglês “aquisition time”)
BCAA Aminoácidos de cadeia ramificada (do inglês “branched chain amino acid”)
BGYR Bypass Gástrico com reconstrução em Y de Roux CG Cromatografia gasosa
CG-EM/MSI
Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas no modo monitoramento seletivo de íons
CLAE Cromatografia liquida de alta eficiência
PC Componentes principais (do inglês “Principal Components”) CPMG Sequência de pulsos de Carr–Purcell–Meiboom–Gill
DAG Diacilglicerídeos
DMT2 Diabetes mellitus tipo 2
DP Desvio padrão
DPR Desvio padrão relativo
NOE Efeito Nuclear Overhauser (do inglês “Nuclear Overhauser Effect”) EM Espectrometria de massas
ES Sequência de pulsos “Excitation Sculpting” GIP Do inglês “gastric inhibitory polypeptide” GLP-1 Do inglês “glucagon-like peptide-1”
HDL Lipoproteínas de alta densidade (do inglês “high-density lipoprotein”)
HiPLS-DA Análise discriminante hierárquica por mínimos quadrados parciais HOMA-IR Do inglês “homeostatic model assessment insuline resistance” IMC Índice de massa corpóreo
IUPAC Do inglês “International Union of Pure and Applied Chemistry” LDL Lipoproteínas de baixa densidade (do inglês “low-density
lipoprotein”)
LOD Limite de detecção LOQ Limite de quantificação
LV Variável latente (do inglês “latent variable”)
MCR Resolução multivariada de curvas (do inglês “Multivariate Curve Resolution”)
MM Massa molar
NPLS-DA Análise discriminante por mínimos quadrados parciais multilineares (do inglês “n-way partial least squares discriminant analysis”)
OG Óleo de girassol
OGTH Óleo de girassol totalmente hidrogenado OMS Organização mundial de saúde
PCA Análise de componentes principais (do inglês “Principal Components Analysis”)
PGSE spin-eco com gradientes pulsado (do inglês “Pulsed Gradient Spin-Echo”)
PLS-DA Análise discriminante por mínimos quadrados parciais (do inglês “partial least squares discriminant analysis”)
R Coeficiente de correlação de Pearson RE Resolução espectral
RMN de
¹H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio RMN de
¹³C Ressonância magnética nuclear de carbono-13
ROC Característica de operação do receptor (do inglês “Receiver operating characteristic”)
sn Numeração estereoespecífica (do inglês “stereospecific numbering”)
T2 Tempo de relaxação transversal
TAG Triacilglicerídeos
TMSP Ácido 2,2,3,3-d4-3-trimetilsilil-propiônico (do inglês “Trimethylsilyl propanoic acid”)
tR Tempo de retenção
TMS Tetrametilsilano
TTR Teste de tolerância à refeição WT Sequência de pulsos WATERGATE ZG Sequência de pulsos PRESAT
SW Janela espectral (do inglês “spectral windows”)
LiSTA DE FIGURAS
Figura 1. Crescimento do número de aplicações envolvendo proteômica, trancriptômica e
metabolômica. Adaptado de Sévin et. al. ... 24
Figura 2. Comparação entre genoma, transcriptoma, proteoma e metaboloma em humanos,
apresentando o número de entidades descritas atualmente. Adaptado de Kumar et al. ... 25
Figura 3. Estratégia para análise de dados metabolômicos obtidos por RMN ... 28 Figura 4. a) Espectro de RMN de ¹H 2D-editado por difusão de uma amostra de plasma, mostrando
os picos relativos aos grupos metila das lipoproteínas (1,28-1,36 ppm); b) pesos espectrais obtidos por PARAFAC, revelando quatro componentes significativas (I, VLDL; II, IDL; III, LDL e IV, HDL) e c) pesos relativos aos coeficientes de difusão fornecidos por PARAFAC para as quatro componentes obtidas. Adaptado de Dyrby et al.33 ... 30
Figura 5. Decomposição de dados trilineares numa análise discriminante por NPLS-DA aplicada a
dados de RMN de ¹H. Adaptado de Bro, R. ... 36
Figura 6. Procedimento de Bypass Gástrico em Y de Roux (BGYR), “uma pequena bolsa de
estômago é criada com um dispositivo grampeador e ligada diretamente ao intestino delgado
distal, contornando grande parte do estômago e do duodeno”. Adaptado de Zieve, M.D. et al. 38
Figura 7. Principais parâmetros de aquisição da sequência cpmgpr.. ... 41 Figura 8. Efeito da frequência do pulso de irradiação no espectro de RMN de ¹H editado por T2 obtido pela sequência de pulsos cpmgpr. ... 44
Figura 9. Efeito da potência do desacoplador no espectro de RMN de ¹H editado por T2 obtido pela sequência de pulsos cpmgpr. ... 45
Figura 10. Efeito do tempo de repetição no espectro de RMN de ¹H editado por T2 obtido pela sequência de pulsos cpmgpr. ... 46
Figura 11. Efeito do tempo de spin-eco no espectro de RMN de ¹H editado por T2 obtido pela sequência de pulsos cpmgpr. ... 47
Figura 12. Efeito do tempo de evolução no espectro de RMN de ¹H editados por T2 obtido pela sequência de pulsos cpmgpr (espectros mostrados numa mesma escala). ... 49
Figura 13. Efeito do número de promediações no espectro de RMN de ¹H editados por T2 obtido pela sequência de pulsos cpmgpr. ... 50
Figura 14. Principais parâmetros de aquisição da sequência “stimulated echo experiment using
bipolar gradiente de campo” stebpgp1s191d. ... 52
Figura 15. Efeito do intervalo binomial no espectro de RMN de ¹H editado por difusãoobtido pela sequência de pulsos stebpgp1s191d. ... 53
Figura 16. Efeito do tempo de difusão no espectro de RMN de ¹H editado por difusão obtido pela
sequência de pulsos stebpgp1s191d. Espectros obtidos com um pulso de gradiente de campo de 2,0 ms. O ... 55
Figura 17. Efeito do pulso de gradiente de campo no espectro de RMN de ¹H editado por difusão
obtido pela sequência de pulsos stebpgp1s191d. Espectros obtidos com um tempo de difusão igual a 100 ms. ... 56
Figura 18. Efeito da intensidade do gradiente de campo no espectro de RMN de ¹H editado por
difusão obtido pela sequência de pulsos stebpgp1s191d. ... 57
Figura 19. Efeito do número de promediações no espectro de RMN de ¹H editado por difusão obtido
pela sequência de pulsos stebpgp1s191d. ... 58
Figura 20. Espectros modelos obtidos para uma amostra de plasma de um paciente obeso. a)
espectro de RMN de ¹H; b) espectro de RMN de ¹H editado por T2 e c) espectro de RMN de ¹H editado por difusão. ... 60
Figura 21. Cromatrograma CG-EM/MSI modelo obtido para uma amostra de plasma de um sujeito
obeso. ... 61
Figura 22. Visão esquemática do processo de modelagem hierárquica.. ... 63 Figura 23. Taxa de erro de validação cruzada para duas rodadas com a) 4 e b) 5 grupos de
amostras. Foram selecionadas duas variáveis latentes para o modelo de HiPLS-DA. ... 64
Figura 24. Variância explicada no modelo HiPLS-DA com duas variáveis latentes. ... 64 Figura 25. a) curva ROC e b) gráfico de sensibilidade (linhas azuis) e especificidade (linhas
vermelhas) em função da fronteira de classe para o modelo HiPLS-DA. ... 65
Figura 26. a) Gráfico de escores das duas primeiras variáveis latentes (LV) e b) gráfico de pesos da
primeira variável latente do modelo HiPLS-DA. As "supervariáveis" mais relevantes para o modelo foram selecionadas pelo valor Wilks' lambda (apresentadas na tabela) e são indicadas pela seta. ... 67
Figura 27. a) Região alifática do espectro de RMN de ¹H editado por T2 de uma amostra de plasma para um indivíduo antes BGYR, b) pesos da segunda componente principal (PC2) do modelo PCA do nível inferior para o Bloco X1 (t2X1 "supervariável"); c) deconvolução dos sinais das
metilas dos aminoácidos de cadeia ramifica. Ressonâncias com valores de pesos positivos correspondem a compostos encontrados em níveis mais elevados antes de BGYR. As quebras inseridas em 3,20-3,40 e 3,60-3,70 ppm, correspondem à remoção do sinal do H2EDTA
livre.. ... 71
Figura 28. a) Região aromática do espectro de RMN de ¹H editado por T2 de uma amostra de plasma para um indivíduo antes BGYR e b) pesos da segunda componente principal (PC2) do modelo PCA do nível inferior para o Bloco X2 (t2X2 "supervariável"). Ressonâncias com valores de pesos positivos correspondem a compostos encontrados em níveis mais elevados antes de BGYR. ... 71
Figura 29. a) espectro de RMN de ¹H editado por difusão de uma amostra de plasma para um
indivíduo antes BGYR, b) pesos da segunda componente principal (PC2) do modelo PCA do nível inferior para o Bloco X3 (t2X3 "supervariável") e c) expansão e deconvolução dos sinais das metilas de lipoproteínas. Ressonâncias com valores de pesos positivos correspondem a compostos encontrados em níveis mais elevados antes de BGYR.. ... 72
Figura 30. a) cromatograma CG-EM de uma amostra de plasma para um indivíduo antes BGYR e b)
pesos da segunda componente principal (PC2) do modelo PCA do nível basal para o Bloco X4 (t2X4 "supervariável") e ressonâncias com valores de pesos positivos correspondem a compostos encontrados em níveis mais elevados antes de BGYR. ... 73
Figura 31. Esquema da biossíntese dos principais AG encontrados em plasma. i) As enzimas ∆12 e
∆15-dessaturases são encontradas apenas em plantas, ii) AG num mesmo nível do caminho biossintético competem pela mesma enzima. ... 81
Figura 32. Região alifática do espectro de RMN de ¹H editado por T2 para um paciente obeso contendo a) 32 k pontos após processamento e b) 908 intervalos após aplicação do "Optimized
Bucketing Algorithm". As quebras inseridas em 3,20-3,40 e 3,60-3,70 ppm, correspondem à
remoção dos sinais do H2EDTA2- livre. ... 83
Figura 33. a) Gráfico da raiz quadrada dos erros médios quadráticos para as amostras de calibração
(RMSEC), validação cruzada (RMSECV) e previsão do conjunto de validação externa (RMSEP) e b) variância capturada pelo modelo de NPLS-DA em função do número de variáveis latentes durante a validação cruzada. ... 86
Figura 34. Gráficos de escores do modelo de NPLS-DA para os dados de RMN de ¹H editados por T2 com dois fatores para os dados centrados na média na dimensão das amostras. ... 87
Figura 35. a) Espectro de RMN de ¹H editado por T2; b) pesos do modo espectral do primeiro fator do modelo de NPLS-DA mostrando as alterações no perfil metabólico. ... 88
Figura 36. Predição das amostras pelo modelo de NPLS-DA para os dados de RMN de ¹H editado
Figura 37. a) Gráfico da raiz quadrada dos erros médios quadráticos para as amostras de calibração
(RMSEC), validação cruzada (RMSECV) e previsão do conjunto de validação externa (RMSEP) e b) variância capturada pelo modelo de NPLS-DA em função do número de variáveis latentes durante a validação cruzada. ... 90
Figura 38. Gráficos de escores do modelo de NPLS-DA para os dados de RMN de ¹H editados por
difusão com dois fatores para os dados centrados na média na dimensão das amostras. ... 90
Figura 39. a) Espectro de RMN de ¹H editado por difusão; b) pesos espectrais para o primeiro fator
de NPLS-DA.. ... 91
Figura 40. Predição das amostras por um modelo de NPLS-DA para os dados de RMN de ¹H
editados por difusão com dois fatores. Legenda: amostras do conjunto de calibração antes (+) e 12 meses após BGYR (o); amostras do conjunto de validação antes () e 12 meses após BGRY (x) ... 92
Figura 41. a) Resolução multivariada de curvas (MCR) aplicada ao grupo metil de lipoproteínas do
espectro de RMN de ¹H editado por difusão e b) estimativas iniciais utilizadas no modelo MCR. ... 93
Figura 42. Variação da proporção de glicose em função do tempo para o teste de tolerância à
refeição... 95
Figura 43. Variação da proporção de lactato em função do tempo para o teste de tolerância à
refeição... 96
Figura 44. Variação da proporção de a) leucina/isoleucina e b) valina em função do tempo para o
teste de tolerância à refeição.. ... 97
Figura 45. Variação da proporção de alanina em função do tempo para o teste de tolerância à
refeição... 98
Figura 46. Variação da proporção de a) VLDL, b) LDL e c) HDL em função do tempo para o teste de
tolerância à refeição.. ... 99
Figura 47. Sequências de pulsos de RMN de ¹³C: a) desacoplamento de banda larga do ¹H; b)
desacoplamento descontínuo inverso do ¹H ... 108
Figura 48. Representação esquemática do processo de interesterificação enzimática dos TAG 1 e 2,
produzindo os novos TAG 3 e 4. ... 111
Figura 49. Espectros de RMN de ¹H modelos obtidos para uma amostra do caldo de fermentação
pelas sequências de pulsos: a) PRESAT; b) NOESY1DPR; c) “Excitation Sculpting” e d)
WATERGATE. ... 115
Figura 50. Formas tautoméricas da D-frutose encontradas em solução aquosa à 25ºC. Adaptado de
Barclay et al.149 ... 116
Figura 51. Comparação dos valores obtidos para a concentração de etanol por RMN de ¹H e CLAE.
... 129
Figura 52. Variação da concentração de etanol durante o processo fermentativo determinado por
RMN de ¹H e CLAE. ... 132
Figura 53. Estrutura básica dos TAG. ... 134 Figura 54. Espectro de RMN de ¹H (500 MHz) em CDCl3 modelo para uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado. ... 134
Figura 55. Mapa de correlação de ¹H-¹³C HMBC seletivo (400 MHz, janela 10 ppm) em CDCl3 para uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado após 9 horas de interesterificação enzimática, mostrando o assinalamento dos carbonos carbonílicos. ... 135
Figura 56. a) Espectro de RMN de ¹³C (500 MHz) em CDCl3 modelo para uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado; b) expansão e deconvolução dos sinais das carbonilas dos TAG e DAG e c) expansão dos sinais do glicerol esterificado em TAG e 1,3-DAG. ... 136
Figura 57. Migração espontânea do grupo acil de 1,2-DAG para formação de 1,3-DAG permitindo a
randomização da distribuição de AG na posição sn-2 do TAG. ... 143
Figura 58. Alteração da especificidade de AGI sn-2 em função do tempo reacional nas reações de
interesterificação ... 144
Figura 59. Preparação das amostras de fermentação para monitoramento da produção de bioetanol
por RMN de ¹H e CLAE ... 159
Figura 60. Cromatograma modelo obtido por CLAE das amostras de fermentação ... 160 Figura A61. Espectro de RMN de ¹H editado por T2 (400,1819 MHz) para uma amostra de plasma para um indivíduo obeso. O espectro foi adquirido pela sequência de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) e pré-saturação do sinal residual da água (PRESAT). ... 167
Figura A62. Espectro de RMN de ¹H editado por difusão (400,1819 MHz) para uma amostra de
plasma para um indivíduo obeso. O espectro foi adquirido pela sequência de pulsos de eco de spin estimulado (stebpgp1s191d) e WATERGATE 3-9-19. ... 168
Figura A63. Espectro de RMN de ¹H-¹H TOCSY 1D seletivo (400,1819 MHz) para uma amostra de
plasma liofilizada e ressuspendida em D2O (tampão fosfato, pH = 7,4; 50 mmol.L -1
) proveniente de um indivíduo antes BGYR. A irradiação seletiva da treonina foi realizada em 1,280 ppm e o tempo de mistura foi igual a 70 ms. ... 169
Figura A64. Espectro de RMN de ¹H-¹H TOCSY 1D seletivo (400,1819 MHz) para uma amostra de
plasma liofilizada e ressuspendida em D2O (tampão fosfato, pH = 7,4; 50 mmol. L-1
) proveniente de um indivíduo antes BGYR. A irradiação seletiva do lactato foi realizada em 1,320 ppm e o tempo de mistura foi igual a 30 ms. ... 169
Figura A65. Espectro de RMN de ¹H-¹H TOCSY 1D seletivo (400,1819 MHz) para uma amostra de
plasma liofilizada e ressuspendida em D2O (tampão fosfato, pH = 7,4; 50
mmol.L-1) proveniente de um indivíduo antes BGYR. A irradiação seletiva da alanina foi realizada em 1,450 ppm e o tempo de mistura foi igual a 30 ms. ... 170
Figura A66. Espectro de RMN de ¹H-¹H TOCSY 1D seletivo (600,1729 MHz) para uma amostra de
plasma liofilizada e ressuspendida em D2O (tampão fosfato, pH = 7,4; 50 mmol.L -1
) proveniente de um indivíduo antes BGYR. A irradiação seletiva da β-glicose foi realizada em 1,650 ppm e o tempo de mistura foi igual a 150 ms. ... 170
Figura A67. Espectro de RMN de ¹H-¹H TOCSY 1D seletivo (400,1819 MHz) para uma amostra de
plasma liofilizada e ressuspendida em D2O (tampão fosfato, pH = 7,4; 50 mmol.L -1
) proveniente de um indivíduo antes BGYR. A irradiação seletiva do sulfato de p-cresol foi realizada em 6,840 ppm e o tempo de mistura foi igual a 30 ms. ... 171
Figura B68. Região alifática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2. Espectros antes BGYR são coloridas em azul e espectros após em vermelho. ... 172
Figura B69. Variância explicada no modelo de PCA para a região alifática dos espectros de RMN de
¹H editados por T2. ... 172
Figura B70. Gráfico de escores das duas primeiras componentes principais do modelo PCA da região
alifática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2. Amostras antes BGYR são coloridas em azul (■), e amostras após em vermelho (●). ... 173
Figura B71. Gráfico de resíduos Q contra Hotelling T² do modelo PCA da região alifática dos
espectros de RMN de ¹H editados por T2. . Amostras antes BGYR são coloridas em azul (■), e amostras após em vermelho (●). Todas as amostras foram mantidas no modelo. ... 173
Figura B72. Gráficos de pesos do modelo de PCA da região alifática dos espectros de RMN de ¹H
editados por T2. Os pesos correspondem as "super variáveis" t1X1, t2X1, t3X1, t4X1, t5X1 e t6X1 na análise HiPLS-DA. ... 174
Figura B73. Região aromática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2. Espectros antes BGYR são coloridas em azul e espectros após em vermelho. ... 175
Figura B74. Variância explicada no modelo de PCA para a região aromática dos espectros de RMN
Figura B75. Gráfico de escores das duas primeiras componentes principais do modelo PCA da região
aromática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2. Amostras antes BGYR são coloridas
em azul (■), e amostras após em vermelho (●). ... 176
Figura B76. Gráfico de resíduos Q contra Hotelling T² do modelo PCA da região aromática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2. Amostras antes BGYR são coloridas em azul (■), e amostras após em vermelho (●). Todas as amostras foram mantidas no modelo. ... 176
Figura B77. Gráficos de pesos do modelo de PCA da região alifática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2. Os pesos correspondem as "super variáveis" t1X2, t2X2, t3X2 e t4X2 na análise HiPLS-DA. ... 177
Figura B78. Espectros de RMN de ¹H editados por difusão. Espectros antes BGYR são coloridas em azul e espectros após em vermelho. ... 178
Figura B79. Variância explicada no modelo de PCA para os espectros de RMN de ¹H editados por difusão. ... 178
Figura B80. Gráfico de escores das duas primeiras componentes principais do modelo PCA dos espectros de RMN de ¹H editados por difusão. Amostras antes BGYR são coloridas em azul (■), e amostras após em vermelho (●). ... 179
Figura B81. Gráfico de resíduos Q contra Hotelling T² do modelo PCA dos espectros de RMN de ¹H editados por difusão. Amostras antes BGYR são coloridas em azul (■), e amostras após em vermelho (●). Todas as amostras foram mantidas no modelo. ... 179
Figura B82. Gráficos de pesos do modelo de PCA dos espectros de RMN de ¹H editados por difusão. Os pesos correspondentes as "super variáveis" t1X3, t2X3, t3X3 e t4X3 na análise HiPLS-DA. . 180
Figura B83. Cromatogramas de CG-EM. Espectros antes BGYR são coloridas em azul e espectros após em vermelho. ... 181
Figura B84. Variância explicada no modelo de PCA para os cromatogramas de CG-EM. ... 181
Figura B85. Gráfico de escores das duas primeiras componentes principais do modelo PCA para os cromatogramas de CG-EM. Amostras antes BGYR são coloridas em azul (■), e amostras após em vermelho (●). ... 182
Figura B86. Gráfico de resíduos Q contra Hotelling T² do modelo PCA para os cromatogramas de CG-EM. Amostras antes BGYR são coloridas em azul (■), e amostras após em vermelho (●). Todas as amostras foram mantidas no modelo. ... 182
Figura B87. Gráficos de pesos do modelo de PCA dos cromatogramas. Os pesos correspondem as "super variáveis" t1X4, t2X4 e t3X4 na análise HiPLS-DA. ... 183
Figura B88. Gráfico de resíduos Q contra o T² Hotelling do modelo HiPLS-DA. Amostras antes BGYR são coloridas em azul, e amostras após em vermelho. Todas as amostras foram mantidas no modelo. ... 184
Figura B89. Gráfico de Wilks' lambda foram selecionas as "supervariáveis" com valores menores que 0,800 no modelo de HiPLS-DA. ... 184
Figura C90. Cromatograma gasoso obtido por espectrometria de massas empregando monitoramento seletivo de íons. ... 185
Figura C91. Principais fragmentos observados nos espectros de massas por monitoramento de íons seletivos: a) rearranjo de McLafferty; b) clivagem ; c) clivagem seguida de rearranjo da cadeia alquílica para formar o cátion cicloexaenila e d) clivagem seguida de rearranjo da cadeia alquílica para formar o cátion cicloexadienila. ... 185
Figura D92. Curva de calibração para o etanol utilizando TMSP como padrão interno. ... 191
Figura D93. Curva de calibração para o ácido lático utilizando TMSP como padrão interno. ... 192
Figura D94. Curva de calibração para o ácido acético utilizando TMSP como padrão interno. ... 192
Figura D96. Curva de calibração para o ácido succínico utilizando TMSP como padrão interno. .... 193
Figura D97. Curva de calibração para a frutose utilizando TMSP como padrão interno. ... 194
Figura D98. Curva de calibração para a glicose utilizando TMSP como padrão interno... 194
Figura D99. Curva de calibração para a sacarose utilizando TMSP como padrão interno. ... 195
Figura D100. Curva de calibração para o ácido fórmico utilizando TMSP como padrão interno. ... 196
Figura D101. Curva de calibração para o etanol utilizando ácido tartárico como padrão interno. .... 196
Figura D102. Curva de calibração para o ácido lático utilizando ácido tartárico como padrão interno. ... 196
Figura D103. Curva de calibração para o ácido acético utilizando ácido tartárico como padrão interno. ... 197
Figura D104. Curva de calibração para o ácido pirúvico utilizando ácido tartárico como padrão interno. ... 197
Figura D105. Curva de calibração para o ácido succínico utilizando ácido tartárico como padrão interno. ... 198
Figura D106. Curva de calibração para a frutose utilizando ácido tartárico como padrão interno. ... 198
Figura D107. Curva de calibração para a glicose utilizando ácido tartárico como padrão interno. ... 199
Figura D108. Curva de calibração para a sacarose utilizando ácido tartárico como padrão interno. 199 Figura D109. Curva de calibração para o ácido fórmico utilizando ácido tartárico como padrão interno. ... 200
Figura E110. Estrutura dos compostos de interesse ... 201
Figura E111. Espectro de RMN de ¹³C (100,63 MHz) da frutose (0,32 mol·L-1) em D2O a 25°C ... 202
Figura E112. Mapa de correlação de ¹H-¹³C HSQC (400,1819 MHz) da frutose (0,32 mol·L-1) em D2O a 25°C. ... 203
Figura E113. Mapa de correlação de ¹H-¹³C HSQC (400,1819 MHz) da amostra liofilizada e ressuspendida em D2O a 25°C. ... 204
Figura F116. Comparação dos valores obtidos para a concentração de frutose por RMN de ¹H e CLAE. ... 206
Figura F117. Variação da concentração de frutose durante o processo fermentativo por RMN de ¹H e CLAE. ... 206
Figura F118. Comparação dos valores obtidos para a concentração de glicose por RMN de ¹H e CLAE. ... 207
Figura F119. Variação da concentração de glicose durante o processo fermentativo por RMN de ¹H e CLAE. ... 207
Figura F120. Comparação dos valores obtidos para a concentração de sacarose por RMN de ¹H e CLAE. ... 208
Figura F121. Variação da concentração de sacarose durante o processo fermentativo por RMN de ¹H e CLAE.. ... 208
Figura G122. Espectro de RMN de ¹H (499,8700 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado. ... 211
Figura G123. Espectro de RMN de ¹³C (125,6926 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado (aproximadamente 150 mg), usando desacoplamento em banda larga. ... 212
Figura G124. Espectro de RMN de ¹³C (125,6926 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado (aproximadamente 150 mg), usando desacoplamento inverso em banda larga. ... 213
Figura G125. Mapa de correlação de ¹H-¹³C HMBC (400,1819 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado (aproximadamente 150 mg). ... 214
Figura G126. Expansão dos sinais do glicerol em TAG e 1,3-DAG do mapa de correlação de ¹H-¹³C
HMBC (400,1819 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado (aproximadamente 150 mg). ... 215
Figura G127. Mapa de correlação de ¹H-¹³C HMBC “bandselective” (400,1819 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado (aproximadamente 150 mg), janela 10 ppm. ... 216
Figura G128. Mapa de correlação de ¹H-¹³C HSQC editado (400,1819 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado (aproximadamente 150 mg). ... 217
Figura G129. Mapa de correlação de ¹H-¹H COSY (400,1819 MHz) em CDCl3 de uma mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado (aproximadamente 150 mg). ... 218
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros de aquisição avaliados na sequência de cpmgpr ... 43
Tabela 2. Parâmetros de aquisição avaliados na sequência de pulsos stebpgp1s191d ... 52
Tabela 3. Principais parâmetros clínicos dos pacientes ... 59
Tabela 4. Principais parâmetros dos modelos PCA para cada bloco no nível inferior ... 62
Tabela 5. Assinalamento dos deslocamentos químicos dos metabólitos diferenciais nos espectros de RMN de ¹H (400 MHz) de amostras de plasma em tampão fosfato (pH = 7,4; 50 mmol.L-1) ... 69
Tabela 6. Desempenho do modelo NPLS-DA com dois fatores para os dados de RMN de ¹H editados por T2 na discriminação de indivíduos obesos antes e após BGYR... 89
Tabela 7. Desempenho do modelo NPLS-DA com dois fatores para os dados de RMN de ¹H editados por difusão na discriminação de indivíduos obesos antes e após BGYR ... 92
Tabela 8. Referências de deslocamento químico e padrões de calibração empregados rotineiramente em RMN quantitativo ... 106
Tabela 9. Assinalamento das ressonâncias utilizadas na quantificação dos compostos de interesse por RMN de ¹H quantitativo ... 115
Tabela 10. Deslocamento químico (), tempo de relaxação longitudinal (T1) para os compostos de interesse. ... 119
Tabela 11. Principias figuras de mérito obtidas por RMN de ¹H quantitativo ... 123
Tabela 12. Recuperações obtidas por RMN de ¹H para os ensaios de fortificação ... 128
Tabela 13. Repetibilidade obtida na determinação dos compostos de interesse presentes no caldo fermentativo por RMN de ¹H ... 131
Tabela 14. Deslocamentos químicos (), fração de aumento na intensidade do sinal devido ao efeito NOE ( fNOE) e tempo de relaxação longitudinal (T1) para as ressonâncias de interesse. ... 138
Tabela 15. Distribuição regioespecífica de AG em TAG por RMN de ¹³C e valores teóricos ... 139
Tabela 16. Distribuição regioespecífica dos AG nos TAG por RMN de ¹³C após a reação de interesterificação química ... 141
Tabela 17. Distribuição regioespecífica dos AG nos TAG por RMN de ¹³C após três horas de reação de interesterificação enzimática ... 142
Tabela 18. Distribuição regioespecífica dos AG nos TAG por RMN de ¹³C após seis e nove horas de reação de interesterificação enzimática ... 145
Tabela 19. Curvas de calibração obtidas para CLAE ... 160
Tabela E20. Atribuição dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C da frutose em solução aquosa à 25ºC . 201 Tabela F21. Comparação dos resultados obtidos por RMN de ¹H e CLAE ... 209
Tabela F22. Rendimento obtido no processo fermentativo ... 210
SUMÁRIO
CAPÍTULO I: ESTUDOS METABOLÔMICOS POR RMN DE ¹H NA INVESTIGAÇÃO DO PERFIL
METABÓLICO DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA. ... 22
1. INTRODUÇÃO DO CAPÍTULO I: ESTUDOS METABOLÔMICOS POR RMN DE ¹H NA INVESTIGAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA ... 23
1.1. Metabolômica ... 23
1.2. Ressonância magnética nuclear na metabolômica ... 27
1.3. Análises quimiométricas... 31
1.3.1. Análise de componentes principais (PCA)... 32
1.3.2. Análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) ... 33
1.3.3. Análise discriminante hierárquica por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) ... 34
1.3.4. Mínimos quadrados parciais multilineares (NPLS) ... 35
1.4. Obesidade e tratamento cirúrgico ... 36
2. OBJETIVOS DO CAPÍTULO I: ESTUDOS METABOLÔMICOS POR RMN de ¹H NA INVESTIGAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA . 40 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO DO CAPÍTULO I: ESTUDOS METABOLÔMICOS POR RMN DE ¹H NA INVESTIGAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA ... 41
3.1. Aperfeiçoamento dos parâmetros de aquisição dos espectros de RMN ... 41
3.1.1. Aperfeiçoamento dos parâmetros de aquisição da sequência de pulsos cpmgpr para obtenção dos espectros de RMN de ¹H editados por T2 ... 41
3.1.1.1. Frequência de irradiação ... 43
3.1.1.2. Potência do desacoplador ... 44
3.1.1.3. Tempo de repetição ... 45
3.1.1.4. Tempo de spin-eco total ... 46
3.1.1.5. Tempo de evolução () ... 48
3.1.1.6. Número de promediações ... 49
3.1.2. Aperfeiçoamento dos parâmetros de aquisição da sequência de pulsos stebpgp1s191d para obtenção dos espectros de RMN de ¹H editados por difusão ... 50
3.1.2.1. Intervalo binomial para supressão da água ... 52
3.1.2.2. Tempo de difusão (“big DELTA”) e pulso de gradiente de campo (“little DELTA”) ... 54
3.1.2.3. Intensidade do gradiente de campo ... 56
3.1.2.4. Número de promediações ... 57
3.2. Avaliação do metabolismo basal ... 58
3.2.1. Principais parâmetros clínicos ... 59
3.2.2. Espectros e cromatogramas ... 60
3.2.3. Análise quimiométrica dos dados ... 61
3.2.3.2. Análise discriminante hierárquica por mínimos quadrados parciais (HiPLS-DA) - nível
superior ... 63
3.2.4. Assinalamento dos sinais associados à BGYR pela análise quimiométrica ... 68
3.2.5. Alterações observadas no perfil metabólico e lipoproteico ... 70
3.2.6. Identificação e alterações dos metabólitos relacionados à BGYR monitorados por CG-EM ... 72
3.2.7. Alterações metabólicas relacionadas à homeostase energética ... 73
3.2.8. Alterações nas concentrações de aminoácidos ... 74
3.2.9. Alterações na concentração de carnitinas ... 76
3.2.10. Alterações relacionadas à microbiota intestinal ... 77
3.2.11. Alterações relacionadas ao perfil lipoproteico ... 78
3.2.12. Alterações relacionadas ao perfil de ácidos graxos ... 79
3.3. Avaliação do metabolismo pós-prandial ... 82
3.3.1 Organização dos dados obtidos por RMN de ¹H para a análise quimiométrica ... 82
3.3.2. Avaliação preliminar dos métodos quimiométricos aplicados aos dados de RMN de ¹H ... 83
3.3.3. Aplicação do modelo NPLS-DA aos dados de RMN de ¹H para o estudo da resposta metabólica ao teste de tolerância à refeição ... 84
3.3.4. Aplicação do modelo NPLS-DA no estudo da reposta metabólica obtida por RMN de ¹H editado por T2 ao teste de tolerância à refeição ... 85
3.3.5. Aplicação do modelo NPLS-DA no estudo da reposta lipoproteica obtida por RMN de ¹H editado por difusão ao teste de tolerância à refeição ... 89
3.3.6. Aplicação de resolução multivariada de curvas na obtenção da concentração relativa de VLDL, LDL e HDL ... 92
3.3.7. Alterações relacionadas ao metabolismo energético ... 93
3.3.8. Alterações nas concentrações de aminoácidos ... 96
3.3.9. Alterações relacionadas ao perfil lipoproteico ... 98
4. CONCLUSÕES DO CAPÍTULO I: ESTUDOS METABOLÔMICOS POR RMN DE ¹H NA INVESTIGAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA ... 101
CAPÍTULO II: MONITORAMENTO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR RMN DE ¹H E INVESTIGAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO REGIOESPECÍFICA DA REAÇÃO DE INTERESTERIFICAÇÃO DE TRIACILGLICERÍDEOS POR RMN DE ¹³C. ... 103
5. INTRODUÇÃO DO CAPÍTULO II: MONITORAMENTO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR RMN DE ¹H E INVESTIGAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO REGIOESPECÍFICA DA REAÇÃO DE INTERESTERIFICAÇÃO DE TRIACILGLICERÍDEOS POR RMN DE ¹³C ... 104
5.1. Ressonância magnética nuclear quantitativa ... 104
5.1.1. Preparação das amostras ... 105
5.1.2. RMN de ¹H em análises quantitativas ... 106
5.1.3. RMN de ¹³C em análises quantitativas ... 107
5.2. Monitoramento da produção de bioetanol por RMN de ¹H... 108
5.3. Monitoramento da distribuição regioespecífica de triacilglicerídeos submetidos à reação de interesterificação por RMN de ¹³C ... 109
6. OBJETIVOS DO CAPÍTULO II: MONITORAMENTO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR RMN DE ¹H E INVESTIGAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO REGIOESPECÍFICA DA REAÇÃO DE
INTERESTERIFICAÇÃO DE TRIACILGLICERÍDEOS POR RMN DE ¹³C ... 113
6.1. Objetivos específicos: monitoramento da produção de etanol por RMN de ¹H ... 113
6.2. Objetivos específicos: investigação da distribuição regioespecífica da reação de interesterificação de triacilglicerídeos por RMN de ¹³C ... 113
7. RESULTADOS DO CAPÍTULO II: MONITORAMENTO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR RMN de ¹H E INVESTIGAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO REGIOESPECÍFICA DA REAÇÃO DE INTERESTERIFICAÇÃO DE TRIACILGLICERÍDEOS POR RMN DE ¹³C ... 114
7.1. Monitoramento da produção de etanol por RMN de ¹H quantitativo ... 114
7.1.1. Assinalamento dos compostos de interesse presentes no caldo fermentativo ... 114
7.1.2. Eliminação do sinal da água ... 117
7.1.3. Tempo de repetição ... 118
7.1.4. Número de transientes e tempo de análise ... 119
7.1.5. Outros parâmetros relevantes na aquisição dos espectros de RMN de ¹H quantitativos ... 120
7.1.6. Processamento dos espectros ... 121
7.1.7. Validação da metodologia proposta ... 122
7.1.7.1. Curvas de calibração ... 122
7.1.7.2. Linearidade ... 125
7.1.7.3. Limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ)... 125
7.1.7.4. Seletividade ... 126
7.1.7.5. Exatidão ... 126
7.1.7.6. Precisão ... 129
7.1.8. Emprego de ultrassom no processo fermentativo ... 131
7.2 Monitoramento da distribuição regioespecífica de triacilglicerídeos submetidos à reação de interesterificação por RMN de ¹³C ... 133
7.2.1. Reações de interesterificação química e enzimática ... 133
7.2.2. Assinalamento das regiões de interesse dos espectros de RMN de ¹³C ... 133
7.2.3. Fração de aumento na intensidade do sinal devido ao efeito NOE ... 137
7.2.4. Distribuição regioespecífica obtida para a mistura binária de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado ... 138
7.2.5. Distribuição regioespecífica obtida para a reação de interesterificação química da mistura binária de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado ... 140
7.2.6. Distribuição regioespecífica obtida para a reação de interesterificação enzimática da mistura de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado ... 141
7.2.7. Distribuição regioespecífica obtida para a mistura binária de óleo de girassol/óleo de girassol totalmente hidrogenado: Influência do tempo reacional ... 143
7.2.8. Distribuição regioespecífica obtida para as reações de interesterificação das outras misturas binárias ... 145
8. CONCLUSÕES DO CAPÍTULO II: MONITORAMENTO QUANTITATIVO DA PRODUÇÃO DE ETANOL E INVESTIGAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO REGIOESPECÍFICA DA REAÇÃO DE
INTERESTERIFICAÇÃO DE TRIACILGLICERIDEOS ... 147
9. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ... 149
9.1 Procedimentos experimentais capítulo I: Estudos metabolômicos por RMN de ¹H na investigação do perfil metabólico de pacientes obesos submetidos à cirurgia bariátrica ... 149
9.1.1. Indivíduos e reagentes. ... 149
9.1.1.1. Reagentes... 149
9.1.1.2. Indivíduos e amostras ... 149
9.1.1.3. Coleta e armazenamento das amostras de plasma ... 150
9.1.1.4. Parâmetros Clínicos ... 150
9.1.2. Análise do perfil metabólico e lipoproteico por RMN de ¹H basal ... 150
9.1.2.1. Preparação das amostras para a análise por RMN de ¹H ... 150
9.1.2.2. Obtenção dos espectros de RMN de ¹H editados por T2 e espectros de RMN de ¹H editados por difusão ... 151
9.1.2.3. Processamento dos espectros de RMN de ¹H editados por T2 e dos espectros de RMN de ¹H editados por difusão... 152
9.1.2. 4. Obtenção dos espectros de TOCSY 1D-seletivo ... 152
9.1.2.5. Extração dos lipídios presentes no plasma ... 153
9.1.2.6. Separação dos ésteres metílicos de ácidos graxos por cromatografia a gás ... 153
9.1.2.7. Identificação dos AG presentes em plasma ... 154
9.1.3. Análise quimiométrica de dados no nível basal ... 154
9.1.3.1. Alinhamento dos espectros e cromatogramas ... 155
9.1.3.2. Análise de componentes principais (PCA) - análise exploratória... 155
9.1.3.3. Análise de Componentes Principias (PCA) - Modelo no nível inferior ... 156
9.1.3.4. Análise Discriminante Hierárquica por Mínimos Quadrados Parciais (HiPLS-DA) - Modelo no Nível Superior ... 156
9.1.4. Análise quimiométrica de dados das respostas do teste de refeição ... 157
9.1.4.1. Alinhamento dos espectros e definição dos intervalos ... 157
9.1.4.2. Análise de componentes principais (PCA) - análise exploratória... 157
9.1.4.3. Modelo de NPLS-DA ... 157
9.1.4.4. Resolução Multivariada de Curvas (MCR) ... 158
9.2. Monitoramento da produção de etanol por RMN de ¹H... 158
9.2.1. Coleta das amostras ... 158
9.2.2. Padrões e reagentes ... 159
9.2.3. Quantificação dos compostos por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 159
9.2.4. Quantificação por Ressonância magnética nuclear de hidrogênio ... 160
9.3. Monitoramento da distribuição regioespecífica de triacilglicerídeos submetidos à reação de interesterificação por RMN de ¹³C ... 161
9.3.1. Materiais e métodos ... 161 9.3.2. Preparação das amostras para as análises por RMN ... 162 9.3.3. Aquisição de espectros de RMN de ¹H de rotina ... 162 9.3.4. Espectros de RMN de ¹³C quantitativos ... 162 9.3.5. Assinalamento e deconvolução dos espectros de RMN de ¹³C ... 163 9.3.6. Medida do tempo de relaxação transversal (T1) e da fração de aumento na intensidade do sinal devido ao efeito NOE ( fNOE) ... 163 9.3.7. Espectros bidimensionais: ¹H-¹³C HSQC-DEPT, ¹H-¹³C HMBC e ¹H-¹H COSY. ... 164 9.3.8. Análise estatística dos dados ... 165 ANEXO A: ESPECTROS DE RMN DE ¹H OBTIDOS PARA AMOSTRAS DE PLASMA DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA. ... 167 ANEXO B: ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA DOS DADOS OBTIDOS POR RMN DE ¹H E CG-EM PARA AMOSTRAS DE PLASMA DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA. 172 B.1. BLOCO X1: Modelo de PCA no nível inferior para a região alifática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2 ... 172 B2. BLOCO X2: Modelo de PCA no nível inferior para a região aromática dos espectros de RMN de ¹H editados por T2 ... 175 B.3. BLOCO X3: Modelo de PCA no nível inferior para os espectros de RMN de ¹H editados por difusão ... 178 B.4. BLOCO X4: Modelo de PCA no nível inferior para os cromatogramas de CG-EM ... 181 B.5. Análise Discriminante Hierárquica por mínimos quadrados parciais (HiPLS-DA) ... 184 ANEXO C: ESPECTROS DE MASSAS DE VARREDURA DE ÍONS TOTAIS PARA AS AMOSTRAS DE PLASMA DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA. ... 185 ANEXO D: CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA MONITORAMENTO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR RMN DE ¹H. ... 191 ANEXO E: ESTRUTURA DOS COMPOSTOS DE INTERESSE E ESPECTROS DE RMN BIDIMENSIONAIS PARA O MONOTORAMENTO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR RMN de ¹H201 ANEXO F: COMPARAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS OBTIDOS POR RMN DE ¹H E CLAE NO
MONITORAMENTO DO PROCESSO FERMENTATIVO. ... 205 ANEXO G: MONITORAMENTO DA DISTRIBUIÇÃO REGIOESPECÍFICA DE TRIACILGLICERÍDEOS POR RMN DE ¹³C ... 211
CAPÍTULO I:
ESTUDOS METABOLÔMICOS POR RMN DE ¹H NA INVESTIGAÇÃO
DO PERFIL METABÓLICO DE PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À
CIRURGIA BARIÁTRICA.
1. INTRODUÇÃO DO CAPÍTULO I: ESTUDOS METABOLÔMICOS
POR RMN DE ¹H NA INVESTIGAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE
PACIENTES OBESOS SUBMETIDOS À CIRURGIA BARIÁTRICA
1.1. Metabolômica
Metabolômica e metabonômica são termos aplicados no estudo de organismos ou sistemas biológicos destinados a monitorar um grande número de metabólitos.1 Formalmente há uma diferença sutil entre os termos, mas há um elevado grau de sobreposição e na prática eles são utilizados como sinônimos.2,3,4 Em termos práticos, podemos entender metabolômica como uma combinação de metodologias analíticas de alto desempenho e análise estatística multivariada no estudo do metaboloma do organismo. Metaboloma se refere ao conjunto completo de metabólitos de um organismo, sendo uma importante fonte de informação celular que integra estímulos ambientais com sinais intracelulares para coordenar as decisões em processos como a utilização de nutrientes, a sinalização ou a diferenciação celular.5,6
A ideia de que fluídos biológicos podem refletir a saúde do indivíduo não é recente. Na antiguidade, chineses utilizavam formigas para avaliar se a urina do paciente continha níveis elevados de glicose e detectar diabetes. Na Idade Média, características como cor, sabor e odor da urina eram utilizadas na identificação de diversas condições clínicas.7 No início dos anos 50, Roger Williams e colaboradores introduziram o conceito de que indivíduos possuem um "perfil metabólico". Estes pesquisadores utilizaram mais de 200 mil cromatogramas em papel, para demonstrar de forma convincente que biofluídos podem representar o perfil metabólico do individuo.8 As ideias de Williams sobre a utilidade do padrão
1
Weckwerth, W.; Morgenthal, K. Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation. DDT. 2005, 10: 1551-1558.
2 Robertson, D.G. Metabonomics in toxicology: a review. Toxicol. Sci. 2005, 85: 809–822. 3
Lindon, J.C.; Nicholson, J.K. Spectroscopic and statistical techniques for information recovery in metabonomics and metabonomics. Annu. Rev. Anal. Chem. 2008, 1: 45–69.
4
Oliver, S.G.; Winson, M.K.; Kell, D.B.; Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Tibtech.
1998, 16: 373-378.
5 Samuelsson, L.M.; Larsson, D.G. Contributions from metabolomics to fish research. Mol. Biosyst. 2008, 4: 974– 979.
6
Nicholson J.K.; Foxall, P.J.; Spraul, M.; Farrant, R.D.; Lindon, J.C. 750 MHz ¹H and 1H-13C NMR spectroscopy of human blood plasma. Anal. Chem. 1995, 67: 793–811.
7 Nicholson, J.K.; Lindon, J.C. Systems biology: metabonomics. Nature. 2008, 455: 1054–1056. 8
Gates, S.C.; Sweeley, C.C. Quantitative metabolic profiling based on gas chromatography. Clin. Chem. 1978, 24: 1663-1673.
metabólico permaneceram dormentes até que as cromatografias gasosas e líquidas se tornaram suficientemente avançadas para que estudos similares fossem realizados com esforços consideravelmente menores.9 Devido ao desenvolvimento dos métodos de análise, técnicas como genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica tem observado um crescimento vertiginoso nos últimos vinte anos (Figura 1).
Figura 1. Crescimento do número de aplicações envolvendo proteômica, trancriptômica e
metabolômica. Adaptado de Sévin et. al.10
A primeira aplicação de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) na determinação de metabólitos em amostras biológicas foi descrita em 1976. Seeley et al. determinaram que 90% dos ATP celulares no músculo estão complexados ao magnésio.11 Desde então, a aplicabilidade da RMN na avaliação de amostras biológicas tem sido expandida. Nos últimos anos, o grupo dos professores Lindon e Nicholson tem impulsionado o desenvolvimento e aplicação da metabolômica, empregando com sucesso RMN de ¹H no estudo de diversos perfis metabólicos e sendo pioneiros na aplicação de métodos de reconhecimento de padrões (métodos quimiométricos) na análise de dados metabolômicos.7 Outra contribuição significativa para metabolômica advém do Projeto do Metaboloma Humano (hmp, do inglês “human metabolome project”), liderado pelo Dr. David Wishart, da
9
Williams, G.Z.; Young, D.S.; Stein, M.R.; Cotlove, E. Biological and analytic components of variation in long-term studies of serum constituents in normal subjects. I. Objectives, subject selection, laboratory procedures and estimation of analytic deviation. Clin. Chem. 1970, 16: 1016-1021.
10
Sévin, D.C.; Kuehne, A.; Zamboni, N.; Sauer, U. Biological insights through nontargeted metabolomics. Curr.
Opin. Chem. Biol. 2015, 34: 1–8.
11
Seeley, P.J.; Busby, S.J.W.; Gadian, D.G.; Radda, G.R.; Richards, R.E. A New approach to metabolite compartmentation in muscle biochemical. Soc. Trans. 1976, 4: 62–64.
Universidade de Alberta no Canadá. Em 2007, o grupo completou a primeira versão do metaboloma humano contendo aproximadamente 2.500 metabólitos. A versão atual do Banco de Dados do Metaboloma Humano (HMDB, do inglês “Human Metabolome Database”; versão 3.6) contém mais de 41.815 metabólitos endógenos ou não.12 O HMDB é um banco de dados gratuito destinado a aplicações em metabolômica, química clínica, descoberta de biomarcadores e educação em geral.13 De acordo com o banco de dados alterações metabólicas já foram associadas a mais de 400 doenças.14
Entre as vantagens da metabolômica está o número relativamente pequeno de entidades envolvidas, comparada a outras abordagens "ômicas" (Figura
2). Adicionalmente, metabolômica fornece uma oportunidade única de avaliar o
metabolismo integrado do organismo (hospedeiro + simbiontes), sendo o método de escolha para uma caracterização global de respostas metabólicas, podendo ser integrado com outras abordagens “ômicas”.15,16
Figura 2. Comparação entre genoma, transcriptoma, proteoma e metaboloma em humanos,
apresentando o número de entidades descritas atualmente. Adaptado de Kumar et al.17
12
Disponível em <http://www.hmdb.ca/>, acessado em 26 de maio de 2014.
13 Wishart, D.S.; Jewison, T.; Guo, A.C. et al. HMDB 3.0 — The human metabolome database in 2013. Nucleic
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15 Nicholson, J.K.; Wilson, I.D. Opinion: understanding ‘global’ systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nat. Rev. Drug Discov. 2003, 2: 668–676.
16 Fuhrer, T. Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 2015, 31: 73–78. 17
Kumar, A.P.; Ruhel, R.K.; Medhi, B. Potential of metabolomics in preclinical and clinical drug development.
Outras vantagens da metabolômica são:18,19,20
1. Uma vez que o metaboloma é o produto final da expressão gênica, variações na concentração dos metabólitos são, em tese, amplificadas em relação às alterações nos níveis de transcriptores e proteínas;
2. O metaboloma está mais próximo do nível funcional da célula;
3. As amostras de biofluídos, frequentemente empregadas em metabolômica, são de fácil obtenção;
4. As técnicas analíticas para determinação de metabólitos são mais desenvolvidas, comparadas às técnicas empregadas em transcriptômica e proteômica.
Devido às inúmeras vantagens, metabolômica possui atualmente diversas aplicações como: diferenciação de fenótipos; diagnósticos médicos; avaliação de estados patológicos; atividade e toxicidade de fármacos; busca de novos biomarcadores; elucidação de rotas metabólicas; avaliação da influência do estilo de vida, da dieta, do ambiente entre outras. Recentemente, metabolômica tem sido empregado no estudo diabetes do tipo 1 e 2,21 doenças autoimunes,22 câncer,23 Alzheimer24 entre muitas outras.
Entre as limitações encontradas pela metabolômica, podemos destacar três limitações principais. Primeiro, é necessário estabelecer um compromisso entre a abrangência do metaboloma investigado e o “throughput” da técnica analítica. Segundo, dificuldades quanto à identificação sistemática dos metabólitos.
18
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Finalmente, o maior gargalo encontrado pela metabolômica se encontra na interpretação de dados e geração de hipóteses.25
Duas abordagens distintas têm sido utilizadas em estudos metabolômicos: metabolômica direcionada (“target”) e não direcionada (“nontarget”). A metabolômica não direcionada compreende a análise completa de todos os metabólitos detectados pelo método analítico empregado. Esta abordagem é normalmente associada a métodos quimiométricos para a extração de informações associadas ao fenótipo investigado. As desvantagens da metabolômica não direcionada são o tempo necessário para o processamento dos dados e a dificuldade na identificação e caracterização de metabólitos desconhecidos. Por outro lado, a metabolômica direcionada consiste na quantificação de um conjunto de metabólitos conhecidos, facilitando o processamento e identificação dos metabólitos, mas limita a amplitude do estudo. Atualmente, mais de 80% dos diagnósticos são baseados na detecção de biomarcadores. Tradicionalmente, biomarcadores consistem em características moleculares únicas, associadas a uma dada doença. Com o desenvolvimento da metabolômica é possível monitorar assinaturas de biomarcadores, associadas a um conjunto de metabólitos. Potencialmente, estas assinaturas permitem uma detecção mais sensível e específica de várias doenças. No entanto, com exceção dos biomarcadores usados para detecção de defeitos metabólicos inatos, nenhuma das supostas assinaturas de biomarcadores já descritas foram aplicadas em clínica até o momento.10
1.2. Ressonância magnética nuclear na metabolômica
Metabolômica é fundamentada no emprego de técnicas analíticas de alto desempenho na determinação simultânea de vários metabólitos presentes em tecidos e biofluídos. RMN de ¹H é frequentemente aplicada em estudos metabolômicos, sendo a análise conduzida em várias etapas, como ilustrado na
Figura 3.3
25
Doerfler, H.; Sun, X.; Wang, L.; Engelmeier, D.; Lyon, D.; Weckwerth, W. m/z GroupAnalyzer — predicting pathways and novel chemical structures from untargeted high-throughput metabolomics data. PLOS ONE,
Figura 3. Estratégia para análise de dados metabolômicos obtidos por RMN
A) Após planejamento experimental e coleta das amostras, realiza-se a aquisição e
processamentos dos espectros de RMN;
B) Os espectros são convertidos numa matriz de dados a qual é pré-processada (centragem
na média é o processamento mais utilizado);
C) Métodos quimiométricos não supervisionados são utilizados na investigação de padrões
(análise exploratória);
D) Os padrões evidenciados pelo gráfico de escores são interpretados em termos do gráfico
de pesos, permitindo a identificação de biomarcadores;
E) Análise de correlação metabólica é empregada para construção de mapas de
correlações diferenciais;
F) Mapas de correlações diferenciais são empregados na investigação de vias metabólicas,
avaliando-se a correlação entre diferentes metabólitos;
G) Métodos supervisionados de reconhecimento de padrões são utilizados para predição de
amostras independentes.
Finalmente, metabólitos individuais podem ser atribuídos ao perfil metabólico com base nos respectivos valores de deslocamentos químicos, multiplicidades de sinais e constantes de acoplamento observados. A confirmação dos assinalamentos pode ser realizada por experimentos adicionais, como aquisição de espectros de correlação homo e heteronucleares, adição da suposta substância, entre outros experimentos.
Espectros de RMN de ¹H editados podem ser empregados tanto na obtenção do perfil metabólico, quanto do perfil lipoproteico de amostras de plasma. Espectros de RMN de ¹H de plasma não editados apresentam sinais finos (relativo a metabólitos de baixa massa molar) sobrepostos a sinais alargados (associados às macromoléculas). A edição do espectro com base no tempo de relaxação transversal
permite a obtenção do perfil metabólico, pois macromoléculas possuem tempos de relaxação transversais curtos e são, portanto suprimidas dos espectros. Alternativamente, a edição do espectro por difusão pode ser empregada na investigação do perfil lipoproteico, pois moléculas com baixa massa molar difundem-se mais rapidamente e são, portanto suprimidas dos espectros.
RMN de ¹H tem sido empregado no estudo do perfil lipoproteico.26,27,28 Lipoproteínas são proteínas responsáveis pelo transporte de lipídios em plasma, tradicionalmente quantificadas por métodos colorimétricos ou ultracentrifugação serial. Alternativamente, RMN de ¹H pode ser empregada na quantificação direta das principais frações lipídicas em amostras de plasma ou soro, reduzindo significativamente o tempo experimental e a quantidade de amostras necessárias.29,30 A quantificação de lipoproteínas por RMN de ¹H é facilitada pelo emprego de sequências de spin-eco com gradientes pulsado (PGSE). A sequência é empregada para editar espectros com base no coeficiente de difusão dos compostos. Ajustando-se a intensidade e a duração do gradiente de campo podem-se suprimir os sinais relativos aos compostos de baixa massa molar (que podem-se difundem mais rapidamente) e obter apenas os sinais relativos às macromoléculas.31,32,33
O processamento dos espectros assim obtidos tem frequentemente aplicado deconvolução espectral na obtenção das concentrações das lipoproteínas.33 A desvantagem desta metodologia é assumir que os deslocamentos químicos e a forma do sinal sejam reprodutíveis ao longo das amostras, o que nem
26
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