Análise dos ectoparasitos:

Do total de 229 ectoparasitos incluídos no estudo, 186 foram coletados em cães domiciliados e clinicamente saudáveis nos bairros Ribeirão das Lages, Casa Amarela e Santanésia em Piraí, 43 coletados do meio ambiente, vegetação formada por arbustos, e árvores nativas, na região de Ribeirão das Lages.

4.2.1- Identificação Taxonômica

189 amostras (soro de cães)

45 Ehrlichia (23,8%) 09 Bartonella (4,76%) 76 amostras soroeativas 22 Rickettsia (11,64%)

69

Todos os ectoparasitas coletados da vegetação arbustiva (com altura de 20 a 50 cm) foram identificados como ninfas do gênero Amblyomma (Tabela 4.1), exceto uma amostra que foi identificada como pulga da espécie Ctenocephalides canis. Os resultados obtidos estão em concordância com os descritos por Labruna et al (2002) que observaram que os estádio de vida livre de A. cajennense, na sua maioria larvas, eram coletados em regiões específicas com vegetação apresentando altura que variava entre 15 e 50cm no Estado de São Paulo, fato que favorecia a infecção dos hospedeiros. Observação semelhante foi obtida por Estrada e colaboradores (2006) que coletaram 1708 exemplares de A. cajennense em vegetação de uma área urbana de Campinas, reforçando o conceito de que a altura da vegetação favorece a manutenção e consequente coleta do gênero Amblyomma e em especial a espécie A. cajennense.

Tabela 4.1: Ectoparasitos coletados em animais e em vegetação no Município de Piraí, Rio de Janeiro (2006-2007).

A= adulto; N*= ninfa de Amblyomma ; L= larva

A observação no presente trabalho de maior incidência de A. cajennense está de acordo com Figueredo et al., (1999) que estudaram as regiões Sudeste e Centro Oeste do Brasil. Labruna et al., (2007), relataram que em cães de área rural, havia o predomínio de infestação por A. cajennense e Boophilus spp., enquanto na área urbana R. sanguineus era a espécie mais frequente. Provavelmente a presença de bovinos na região estudada pelo grupo de São Paulo possa justificar a presença de Rhipicephalus (Boophilus) microplus na região rural.

Localidades A cajennense R sanguineus C felis C canis Anocentor Total

A N * L A N L Lages (vegetação) 42 - - 01 - 43 Lages(cães) 03 04 43 02 08 10 - 70 CasaAmarela/ Santanésia 12 82 01 20 01 116 TOTAL 03 58 - 125 03 - 08 31 01 229

70

Galvão et al., (1988); Lemos et al., (1996); Souza et al., (2006), relataram que o estádio de ninfa de Amblyomma spp. ocorre durante todo o ano na mata ciliar, sendo em maior abundância de julho a dezembro (segundo semestre do ano), fato esse importante no estudo da epidemiologia das rickettsioses, pois a maior prevalência dos ectoparasitos neste estudo coincide com o ciclo biológico natural da espécie e com o maior número de casos de FMB.

Dos ectoparasitos coletados em cães, 70 amostras pertenciam aos cães domiciliados no bairro Lages, sendo: 43 R. sanguineus adultos, 2 R. sanguineus ninfa; 4 A. cajennense adultos, 3 ninfas de Amblyomma; 08 C. felis e 10 C. canis e 116 amostras coletadas dos cães no bairros Casa Amarela e Santanésiaem Piraí, sendo: 1 Anocentor; 1 R. sanguineus ninfa; 82 R. sanguineus adulto; 12 ninfas do gênero Amblyomma; 20 C. canis. (Tabela 4.1.)

No presente estudo foi identificada infestação frequente dos cães por A. cajennense e R. sanguineus em área urbana localizada próxima à mata ciliada. A presença de equinos soltos, em charrete ou em carroças na área de estudo, favorecendo o ciclo da espécie A. cajennense, a proximidade com fragmentos de mata ciliada, entre outros fatores, reforçam a assertiva de que a região de Piraí, embora considerada urbana, apresenta condições favoráveis a transmissão de rickettsias para a população de cães e consequentemente, para a população humana.

Estudos realizados no Brasil mostraram resultados semelhantes no município de Pedreira, estado de São Paulo e em outra região do município de Piraí, onde dos 578 carrapatos coletados, 369 foram identificados como gênero Amblyomma (LEMOS et al 1996, ROZENTAL et al, 2002). Em Minas Gerais, Cardoso et al, (2006) encontraram, também em cães, na área peri-urbana do Município de Caratinga, carrapatos das espécies A. cajennense (73%), R. sanguineus (23%) A. nitens (4%), nos três estádios de desenvolvimento, sendo maior porcentagem (68%) de formas adulta.

Mais recentemente, em 2009, Rozental e colaboradores demonstraram, em estudo realizado no município fluminense de Barra do Piraí, onde 1.233 exemplares de carrapatos coletados de cães da região urbana de Barra do Piraí foram analisados, 1.017,

71

do total submetido à caracterização taxonômica, eram da espécie R. sanguineus, resultado que confirmou mais uma vez esta espécie como a mais prevalente no cão.

4.2.2- Análise molecular (PCR) dos ectoparasitos

Os 186 ectoparasitos incluídos nesta presente pesquisa e submetidos à PCR, foram agrupados em “pool” totalizando 97 amostras de DNA. Este procedimento foi realizado considerando que algumas amostras de ectoparasitos, da mesma espécie e da mesma fase de desenvolvimento, que pertenciam ao mesmo hospedeiro, foram processadas juntas, formando pool de 3 a 5 exemplares, a fim de se obter um maior volume de DNA. A decisão de se realizar a análise utilizando “pools” foi baseada em publicações de autores brasileiros, cujo critério de agrupamento foi a fase evolutiva, a fonte de coleta, o gênero e a espécie do artrópode. Guedes e colaboradores (2005), Estrada e colaboradores (2006) e Rozental e colaboradores no Estado do Rio de Janeiro (2009) realizaram a análise molecular dos carrapatos utilizando lotes de três, 20 e cinco exemplares, respectivamente.

Assim, os 186 ectoparasitas obtidos no presente trabalho, agrupados em 97 amostras de DNA foram testadas para a presença do genoma de Bartonella (primers, CAT 1 e CAT 2) e R. rickettsii (primers TZ e CS). Destes ectoparasitas agrupados em “97 pools” e que foram submetidos à PCR foi possível detectar produto de amplificação em 72 (74,2%), conforme dados apresentados na Tabela 4.2.

Tabela 4.2. Frequência de “pools” de DNA de ectoparasitas positivos para a presença dos gêneros Bartonella e Rickettsia, por análise molecular (PCR), segundo espécies de artrópodes coletados em cães no Município de Piraí/RJ, em setembro de 2007 e 2008

Espécie de ectoparasitos Percentagem de amostras de ectoparasitos PCR positivo PCR Rickettsia PCR Bartonella PCR Bartonella /Rickettsia

72 R.sanguineus (46,39%) 45/97 (32,98%) 32/97 (24,74%) 24/97 (13,4%) 13/97 A.cajennense (9,27%) 9/97 (4,12%) 04/97 (5,15%) 05/97 (3,09%) 03/97 C.canis (10,3) 10/97 (5,15%) 05/97 (6,18%) 06/97 (4,12%) 04/97 C.felis (8,24) 8/97 (4,12%) 04/97 (6,18%) 06/97 (2,06%)02/97 Total 72 (74,2%) 45 (46,39%) 41 (42,2%) 25 (25,7%)

Em 45 amostras foi verificada a amplificação do genoma de Rickettsia; pelo primer TZ, primer CS e pelos dois primers TZ e CS concomitantemente em 34, 5 e 6 pools de DNA de ectoparasitas, respectivamente (Figura 4.4). As espécies de artrópodes foram: C. canis, C.felis, R. sanguineus e A. cajennense, conforme dados apresentados na tabela 4.2. Estes resultados confirmam a informação obtida na literatura científica de que A. cajennense é o vetor principal de R. rickettsii no Brasil, embora a participação de outras espécies de carrapatos tem sido comprovada ( LEMOS et al 1996; ROUX, 1996, GALVÃO, 1996, DE LEMOS et al 1997, LEMOS et al 1997, GUEDES et al , 2005, GEHRKE et al 2009, ROZENTAL et al ,2009).

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Figura 4.4 Eletroforese em gel de agarose 1% do produto da PCR para Rickettsia spp. de uma amostragem dos ectoparasitos coletados de cães em Piraí-Estado do Rio de Janeiro – Brasil. Pente A: amostras de ectoparasitos (poços 1-10), poço 11 controle negativo (C-); poço 12 controle positivo (C+); poço 13 peso molecular (PM – 100pb). Amostras positivas: poços 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 9. Pente B: amostras de ectoparasitos (poços 1-13), poço 14 controle negativo (C-); poço 15 controle positivo (C+); poço 16 peso molecular (PM – 100pb). Amostras positivas: poços 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12.

No Brasil, estudos com ectoparasitos confirmaram a infecção de A. cajennense com R. rickettsii, no Estado de São Paulo (GUEDES et al, 2005) e em 2006, Estrada e colaboradores relataram infecção por R. belli, uma espécie não patogênica. Outras espécies de carrapatos, como R. sanguineus, infectados por Rickettisa spp. também têm sido descritos na literatura brasileira (CUNHA, 2009; ROZENTAL et al, 2009) e estão de acordo com os resultados obtidos.

Assim, é possível observar nas últimas duas décadas um aumento no número de referências na literatura mundial sobre o assunto, fato que coloca em evidência a participação de outras espécies de carrapatos assim como pulgas como vetores em potencial das diferentes rickettsias. É importante considerar a participação da espécie R. sanguineus na transmissão da febre maculosa no mundo tem ultrapassado os limites dos continentes africano e europeu, onde esta espécie de ixodideo é o vetor principal de R.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 A B ←246 pb ←246 pb

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rickettsii (BERNASCONi et al 2002; EREMEEVA et al, 2006; HALLOS et al, 2006; WIKSWO et al , 2007; GEHRKE et al 2009).

A presença de R sanguineus e C. felis infectados por R. rickettsii foi descrita por Eremeeva e colaboradores em 2006, com o relato do primeiro isolamento de R. rickettsii em R. sanguineus nos Estados Unidos, confirmando assim a sua importância como vetor de R. rickettsii. Wikswo et al., (2007) e Gehrke et al., (2009) também demonstraram a presença de R. sanguineus infectado por R. rickettsii e R. felis e de Rickettsia sp infectando exemplares de C. felis, assim como Hallos e colaboradores (2006) que identificaram presença de Rickettsia spp. em C. felis e C .canis. e de Bernasconi et al., (2002) que detectaram 03 exemplares, de um total de 24 carrapatos da espécie R. sanguineus contendo o genoma de Rickettsia massiliae.

Em relação ao Brasil, R. sanguineus infectado por R. rickettsii tem sido relatado por Cardoso et al., (2006), e mais recentemente, por Rozental et al., (2009), Cunha et al., (2009) e Gehrke et al., (2009). Estudo realizado em Minas Gerais Cardoso et al.,( 2006) detectaram carrapatos da espécie R. sanguineus infectados por R. felis, fato considerado inédito. Rozental e colaboradores (2009) confirmaram a participação do R. sanguineus como possível vetor da febre maculosa brasileira em áreas endêmicas da região do Médio Paraíba, o que também foi constatado na presente pesquisa. Os dados obtidos por Gehrke e colaboradores, (2009) que estudaram a mesma região do Médio Paraíba ratificam os resultados do presente estudo. Cunha (2009), confirmou R. rickettsii em R.sanguineus adultos, na cidade de Resende Rio de Janeiro. Estes dados nacionais, associados às observações do presente estudo, confirmam a importância da espécie R. sanguineus no ciclo das rickettsias na natureza com a possibilidade de sua participação como transmissor de R. rickettsii no Brasil

No presente trabalho, das amostras testadas para pesquisa de DNA de Bartonella, utilizando-se o primer CAT 1 e CAT2, 41 (42,2%) apresentaram PCR positiva (Figura 4.5). Em 10 (10,3%) amostras estudadas, embora a amplificação pudesse ter sido identificada, foi considerada como uma “banda fraca”. A presença de co-infecção foi observada em 29 amostras testadas. Seis amostras apresentaram DNA positivas para Bartonella e Rickettsia em ambos os “primers” testados (TZ e CS) e 20 amostras foram

75

positivas para Bartonella e Rickettsia no primer TZ e três (3) amostra positiva para Bartonella e Rickettsia no “primer” CS.

Figura 4.5 – Eletroforese em gel de agarose 1% do produto de PCR para Bartonella spp. de uma amostragem de ectoparasitos coletados de cães no município de Piraí - Estado do Rio de Janeiro – Brasil. Amostras de ectoparasitos ( poços de 1 a 11), no poço 12 controle positivo (C+), apresenta um fragmento amplificado de 414 pb com o primer CAT1 e CAT2; poço 14 controle negativo (C-); poço 13 peso molecular (PM – 100pb). Amostras positivas: poços 2, 4, 5, 6, 7 e 8.

O genoma de Bartonella foi detectado em C. canis, C. felis, R. sanguineus (macho e fêmea), A. cajennense (adulto e ninfa). Estudos realizados fora do Brasil apontaram dados compatíveis com os observados neste estudo. BLANCO et al. (2006) identificaram a presença de infecção por B. henselae e B. clarridgeiae em 3,4% e 6,8% de C. canis e C. felis na Espanha e Wikswo et al (2007) detectaram DNA de B. henselae em R. sanguineus. Outro estudo realizado por Chang et al. (2001) detectaram 19,2% dos carrapatos da espécie Ixodes ricinus, carrapato comum na região da Califórnia, apresentaram PCR positiva para B. henselae, B quintana, B washoensis. Outro estudo na mesma região, foi possível identificar co infecção do Ixodes. pacificus com B. henselae e B. burgdoferi ou com A. phagocytophilum Holden et al., (2006).

76

4.3- Sequencimento das amostras de sangue e de ectoparasitas PCR positivos

Considerando o elevado custo e a dificuldade em se realizar o sequenciamento de todas as amostras de cães e de ectoparasitas que apresentaram DNA detectável através da PCR, isto é, que amplificaram o fragmento esperado, somente cinco amostras de DNA de ectoparasitos e duas amostras de ectoparasitos da vegetação PCR-positivos para Bartonella spp. foram seqüenciadas. As sequências de nucleotídeos obtidas foram alinhadas e comparadas com as sequências do mesmo gene descritas para espécie de Bartonella disponíveis no GeneBank, e as porcentagens de similaridade foram determinadas. Os resultados seguem expostos na Tabela 4.3 apresentada a seguir.

Tabela 4.3. Análise molecular dos ectoparasitas Bartonella PCR positivos coletados no Município de Piraí (setembro 2007 e 2008), RJ e que foram submetidos ao seqüenciamento.

Amostras Ectoparasito Identidade Cobertura Agente

Nº 01 C.felis 93% 98% B. henselae Z1 Nº 02 R.sanguineus 100% 99% B.henselae Nº03 C.felis 96% 99% B.henselae Nº04 A. cajennense (ninfa) 99% 100% B.henselae Nº 05 C.canis 96% 100% B. henselae

Embora apenas 5 amostras tenham sido molecularmente caracterizadas, os resultados obtidos indicam a circulação de Bartonella spp. em carrapatos da região de Piraí-RJ e sugerem que as espécies de carrapatos R. sanguineus e A. cajennense e as pulgas C. felis e C. canis podem ser vetores em potencial de Bartonella, resultado que está em concordância com a literatura brasileira e mundial (ISHIDA et al, 2001; DINIZ, 2007; BILLETER et al, 2008).

4.4. Análise conjunta dos resultados obtidos nas amostras bilógicas dos cães e dos