1
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL
NAMIR SANTOS MOREIRA
BARTONELLA, EHRLICHIA E RICKETTIAS DO GRUPO DA FEBRE MACULOSA EM CÃES E EM ARTRÓPODES:UM ESTUDO NA REGIÃO DO
MÉDIO PARAÍBA, ESTADO DO RIO DE JANEIRO.
Niterói – RJ 2011
2
NAMIR SANTOS MOREIRA
BARTONELLA, EHRLICHIA E RICKETTIAS DO GRUPO DA FEBRE MACULOSA EM CÃES E EM ARTRÓPODES:UM ESTUDO NA REGIÃO DO
MÉDIO PARAÍBA, ESTADO DO RIO DE JANEIRO.
Tese apresentada ao Programa De Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica Veterinária.
Orientadora: Prof. Dra. Nádia Regina Pereira Almosny. Co-orientadora: Prof. Dra. Elba Regina Sampaio de Lemos.
Niterói – RJ 2011
3
NAMIR SANTOS MOREIRA
BARTONELLA, EHRLICHIA E RICKETTIAS DO GRUPO DA FEBRE AMCULOSA EM CÃES E EM ARTRÓPODES:UM ESTUDO NA REGIÃO DO
MÉDIO PARAÍBA, ESTADO DO RIO DE JANEIRO.
Tese apresentada ao Programa De Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica Veterinária.
Aprovada em de 2011.
BANCA EXAMINADORA
... Profª Drª Nádia Regina Pereira Almosny - Orientadora
Universidade Federal Fluminense
. ... Prof. Dr. Elba Regina Sampaio de |Lemos - co orientadora
Fundação Oswaldo Cruz
. ... Prof. Dr. Aloysio Melo de Figueiredo Cerqueira
Universidade Federal Fluminense
. ... Prof. Dr. Carlos Luiz Massard
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
... Prof. Dr Adivaldo Henrique da Fonseca
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro ...
Prof. Drª Cláudia Soares Santos Lessa UNIRIO
4
A Deus, que me deu força para seguir em frente A meu marido William, sempre presente, apoiando e incentivando meu crescimento.
5 AGRADECIMENTOS
A minha mãe Vânia, que me socorre cuidando do Bernardo na minha ausência, pelo seu amor e orações.
Ao meu pai, que não imaginava que eu chegaria até aqui.
À Drª Nadia Regina Pereira Almosny por mais uma vez me orientar e acreditar que eu seria capaz. Muito mais que uma orientadora, exemplo de pessoa e profissional a ser seguido.
À Drª Elba Regina Sampaio de Lemos, pelo carinho, orientação.
A equipe do LHR, Alexsandra Favacho, Tatiana Rozental, Danielle de Almeida, Raphael Gomes, Alessandro Guterres, Renata de Oliveira, Cristiane Silva, Angélica Mares Guia, Endiá, Jairo Dias Barreira, Grasiely, Adonaí Pessoa, sem vocês teria sido impossível esse trabalho, meu muito obrigada de coração.
Ao Dr Jairo Dias Barreira pela taxonomia dos ectoparasitos
A amiga Aline Moreiras de Souza, pela amizade, apoio incondicional e ajuda na coleta das amostra.
A professora Marcia de Souza Xavier, pela amizade, companheirismo e ajuda na coleta das amostras
Ao amigo e médico veterinário Anderson Monteiro, pelo apoio, amizade, os cafés as quartas feiras e pela substituição nas “intermináveis” aulas do primeiro período. Ao professor, Walker Nunes, coordenador na faculdade de Veterinária, UNIPLI, pelo apoio e incentivo.
Ao aluno e amigo Jorlan, pela ajuda no desenvolvimnto do experimento. É gratificante ver onde você chegou.
Aos Médicos Veterinários: Rafael de Azevedo, Letícia Maia, Camilla, Francisco Lima Júnior, Ananda Muller, Pedro Velho, Andrea , pela ajuda na coleta das amostras. Aos Médicos Veterinários e amigos de turma, Miguel, Tatiana Didonet, Flávia Liparisi, aprendi muito com vocês.
Aos professores do Curso de pós graduação da UFF pela contribuição
6 SUMÁRIO
Lista de Tabelas p.08 Lista de Quadros p.09 Lista de Figuras p.10 Lista de abreviaturas, siglas e símbolos p.11
Resumo p. 12 Abstract p. 13 I- Introdução p. 14 II- Fundamentação Teórica p.19 2.1- Gênero Bartonella p.19 2.1.1- Características e Taxonomia p.19 2.1.3- Hospedeiros Vertebrados p.22
2.1.4-Vetores p. 25
2.1.5.- Patogenia e manifestações clínicas p.29 2.1.6. Diagnóstico p. 30 2.1.7- Prevenção p. 31 2.2 – Gênero Rickettsia p. 32 2.2.1- Características e Taxonomia p. 32 2.2.2- Febre Maculosa p.34 2.2.3- Transmissão p. 34 2.2.4- Hospedeiros vertebrados p.35 2.2.5- Vetores p.38
2.2.6- Patogenia e manifestações clínicas p.42 2.2.7. Diagnóstico p. 46
2.2.8- Prevenção p. 47 III- Material e Métodos p. 49 3.1- Área de estudo p.50 3.2- Desenho do estudo p.50 3.3- Aspectos éticos p.51 3.4 - Amostras p.52 3.4.1- Sangue de cães p.52 3.4.2- Ectoparasitos p.53
3.5- Coleta e acondicionamento das amostras p.53 3.5.1- Sangue de cães p. 53
3.5.2- Ectoparasitos p. 54
3.6- Análise Laboratorial p. 54
3.6.1- Análise sorológica – Imunofluorescência indireta p. 54 3.6.2. Análise Molecular p. 56
3.6.2.1.Extração de material genômico das amostras de sangue dos cães p. 56 3.6.2.2- Extração de material genômico das amostras de ectoparasitos p. 57 3.6.2.2.1. Procedimento de lavagem p. 57
3.6.2.2.2. Extração de DNA p. 58
3.6.2.3- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) p.59
3.6.2.3.1- PCR Bartonella (DNA cães e DNA de ectoparasitos) p. 60 a). DNA amostras de sangue dos cães p.60
7
3.6.2. 3.2.- Rickettsia (DNA cães e DNA ectoparasitos) p.61 a) DNA das amostrasde sangue dos cães p. 61 b) DNA das amostras de ectoparasitos p. 62
3.6.2.3.3. Eletroforese p. 62 3.6.2.3.4. Sequenciamento p. 63 IV- Resultados e Discussão p.65 4.1- Análise das amostras de sangue dos cães p. 65
4.1.1- Análise sorológica das amostras de sangue dos cães p. 65 4.1.2- Análise molecular( PCR) das amostras de sangue dos cães p.69 4.2- Análise dos ectoparasitos p.70
4.2.1. Identificação Taxonômica p.70
4.2.1- Análise molecular (PCR) dos ectoparasitos p.72
4.3. Sequenciamento das amostras de sangue e de ectoparasitos PCR positivo p.77 4.4 Análise conjunta dos resultados obtidos nas amsotras biológicas dos cães e dos ectoparasitos p. 78
V – Conclusões p.83 VI- Perspectivas p.82 VII- Referência Bibliográficas p.84
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados para detecção de bactérias do gênero Rickettsia e Bartonella. p. 59
Tabela 4.1: Ectoparasitos coletados em animais e em vegetação no Município de Piraí, Rio de Janeiro (2006-2007) p 70
Tabela 4.2. Frequência de “pools” de DNA de ectoparasitas positivos para a presença dos gêneros Bartonella e Rickettsia, por análise molecular (PCR), segundo espécies de artrópodes coletados em cães no Município de Piraí/RJ, em setembro de 2007 e 2008 p 73
Tabela 4.3. Análise molecular dos ectoparasitas Bartonella PCR positivos coletados no Município de Piraí (setembro 2007 e 2008), RJ e que foram submetidos ao seqüenciamento. p77
Tabela 4.4. Relação dos cães sorrreativos e de ectoparasitos PCR positivos para Bartonella e Rickettsia. p 78
.
.
9
LISTA DE QUADRO
Quadro 1: Exemplos de espécies de Bartonella com potencial patogênico ao homem, seus reservatórios primário e hospedeiro acidental p 21
Quadro 2: Vetores confirmados na transmissão de espécies do gênero Bartonella e suas respectivas referências. p 25
Quadro 3: Espécies de Bartonella presentes em Carrapatos vetores e suas respectivas origens e referências. p27
Quadro 4: Aspectos clínicos da infecção por Bartonella em cães p30 Quadro 5: Exemplos de Rickettsias Patogênicas do Grupo Febre Maculosa no Brasil e
no Mundo. p 33
10
LISTA DE FIGURA
Figura 1: Mecanismo de aderência e infecção da Rickettsia nas células endoteliais – (Walker 2007) p43
Figura 2. Mapa do Estado do Rio de Janeiro, em detalhe região do Médio Paraíba, local de coleta das amostras de sangue de cães e ectoparasitos. Setembro de 2007 e 2008. p 49
Figura 3.1 Regiões do Estado do Rio de Janeiro, em roxo a região do Médio Paraíba p50
Figura3.2: Bairro Casa Amarela – Piraí – RJ - Local de coleta das amostras de sangue dos cães e dos seus ectoparasitos. P 51
Figura 3.3: Técnica de arrasto de flanela utilizada para coleta de ectoparasitos no meio ambiente, no bairro Ribeirão das Lages- Piraí. Agosto de 2007. P53
Figura 4.1.Teste de imunofluorescência indireta com antígeno de Bartonella henselae,
aumento de 40X. Imagem A (controle negativo) , imagem B (amostra positiva) p66
Figura 4.2 Teste de imunofluorescência indireta com antígeno Rickettisa rickettsii, aumento de 40X. Imagem A (controle positivo), imagem B (amostra sororreativa) p 66
Figura 4.3: Relação do número de amostras de cães sororreativas para Bartonella, Ehrlichia e Rickettsia p 67
Figura 4.4 Fotodocumentação após eletroforese em gel de agarose do produto da PCR para Rickettsia spp. de amostras de ectoparasitos coletados de cães em Piraí-Estado do Rio de Janeiro – Brasil. p 73
Figura 4.5 Fotodocumentação após eletroforese em gel de agarose do produto da PCR para Bartonela spp. de amostras de ectoparasitos coletados de cães em Piraí-Estado do Rio de Janeiro – Brasil. p 76
Figura 4.6: Figura esquemática com o sumário dos resultados obtidos no estudo das amostras de sangue dos cães e dos carrapatos em relação à infecção por Rickettsia no Município de Piraí, RJ (2007-2008) p 80
11
Figura 4.7: Figura esquemática com o sumário dos resultados obtidos no estudo das amostras de sangue dos cães e dos carrapatos em relação à infecção por Bartonella no Município de Piraí, RJ (2007-2008) p 80
Figura 4.8: Figura esquemática com o sumário dos resultados obtidos no estudo das amostras de sangue dos cães e dos carrapatos em relação à infecção por Ehrlichia no Município de Piraí, RJ (2007-2008) p 81
Figura 4.9. Figura esquematica com um resumo dos ectoparasitas PCR positivos e sua correlação com os cães sororreativos p 81
LISTA DE ABREVIAÇÕES A. Anaplasma
A. cajennense Amblyomma cajennense A. ovale Amblyomma ovale A. aureolatum Amblyomma aureolatum B. Bartonella
CDC Centers for Disease Control
CID Coagulação intravascular disseminada CO2 Dióxido de carbono
DNA Ácido nucleico E. Ehrlichia
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EUA Estados Unidos da América
FBM Febre Maculosa Brasileira
FMMR Febre maculosa das Montanhas Rochosas I. Ixodes
IFI Imunofluorescência indireta LHR Laboratório de Hantavirose e Rickettsiose
MG Minas Gerais
PCR Reação em cadeia da polimerase RJ Rio de Janeiro
R. Rickettsia
R. sanguineus Rhipicephalus sanguineus
RGFM Rickettsias do grupo da febre maculosa SP São Paulo
Subsp Subespécie
12 RESUMO:
Nas últimas duas décadas o número de publicações sobre infecções causadas por rickettsias e bartonelas tem aumentado com identificação de novos agentes, conseqüência, entre outros fatores, de um maior contato humano com animais e artrópodes capazes de transmitir doença, do aumento do interesse da comunidade científica e de uma maior disponibilidade de novas técnicas diagnósticas. Considerando a importância dos animais domésticos de companhia na transmissão de rickettsias e bartonelas ao homem, objetivou-se nesse estudo, avaliar a circulação de rickettsias do grupo da febre maculosa (RGFM), Ehrlichia spp. e Bartonella spp. em cães domiciliados e clinicamente saudáveis nos bairros Ribeirão das Lages, Casa Amarela e Santanésia no Município de Piraí, Rio de Janeiro. Após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido pelo proprietário, foram coletados sangue e ectoparasitas em 189 cães. Na análise sorológica foi utilizado o teste de imunofluorescência indireta comercial (PANBIO) com um ponto de corte na titulação de 1:64 para a pesquisa de anticorpos R. rickettsii, Ehrlichia canis e anti-Bartonela henselae. A análise molecular, pela reação de polimerase em cadeia (PCR), foi realizada para detectar o genoma de RGFM, E. canis e Bartonella tanto em amostras de sangue dos cães quanto em seus ectoparasitos. Dos 189 soros de cães analisados, 45 (23,8%), 22 (5,82%) e 9 (4,76%) apresentaram reatividade respectivamente para E. canis, RGFM e Bartonella spp. Dos 186 ectoparasitas coletados dos cães incluídos no estudo, 128 (68,8%) eram Rhipicephalus sanguineus; 19 (10,2%), Amblyomma cajennense; 1 (0,53%), Anocentor nitens; 8 (4,3%), Ctenocephalides felis e 30 (16,1%), Ctenocephalides canis. A PCR foi detectada em 56,7% e 42,2% dos ectoparasitas analisados para o gênero Rickettsia (fragmento de 386 pares de base) e para Bartonella (fragmento de 414 pares de base), respectivamente. A análise filogenética preliminar dos produtos amplificados confirmou a circulação de Bartonella henselae e Rickettsia spp. em carrapatos. Os dados obtidos neste estudo confirmam a importância dos cães como animais sentinelas e amplificadores das doenças transmitidas por carrapatos e pulgas, assim como a circulação de bactérias do gênero rickettsias do grupo da febre maculosa e Bartonella na região do Médio Paraíba.
13 ABSTRACT
In the last two decades the number of publications about infections caused by Rickettsia and Bartonella has increased with the identification of new agents due, among other factors, increased human contact with animals and arthropods capable of transmitting disease, the increasing interest of the scientific community and the greater availability of new diagnostic techniques. Considering the importance of pets in the transmission of Rickettsia and Bartonella to humans, this study aimed to assess the movement of the spotted fever group rickettsia(SFGR), Ehrlichia spp. and Bartonella spp. in domestic dogs, clinically healthy on Ribeirão das Lages, Casa Amarela and Santanésia neighborhoods from Pirai, Rio de Janeiro. After signing an informed consent by the owner, blood and ectoparasites were collected from 189 dogs. For serological analysis commercial indirect immunofluorescence assays (PANBIO) was performed, with a titration cutoff point of 1:64, to detect R. rickettsii, Ehrlichia canis and anti-Bartonella henselae. Molecular analysis by polymerase chain reaction (PCR) were performed to detect the genome of SFGR, E. canis and Bartonella from blood samples from dogs and theirs ectoparasites. From the 189 examined dogs sera, 45 (23.8%), 22 (5.82%) and 9 (4.76%), respectively, were reactive to E. canis, SFGR and Bartonella spp. From the ectoparasites collected from 186 dogs included in this study, 128 (68.8%), Rhipicephalus sanguineus, 19 (10.2%) Amblyomma cajennense, 1 (0.53%) Anocentor nitens, eight (4.3%) Ctenocephalides felis and 30 (16.1%), Ctenocephalides canis were identified. Through PCR amplification it was possible to detect the 386-bp fragment (genus Rickettsia) in 56.7% of the ectoparasites and the 414-bp fragment (genus Bartonella) in 42.2% of the ectoparasites. A preliminary phylogenetic analysis of the amplified product confirmed the movement of Bartonella henselae and Rickettsia spp. in ticks, allowing the understanding of the importance of dogs as sentinel animals and amplifiers of diseases transmitted by ticks and fleas as well as the movement of the spotted fever group rickettsia and Bartonella in the Medio Paríba region.
14 I- INTRODUÇÃO:
Com avanço da área urbana em direção a área rural, o homem vem invadindo um território que anteriormente era habitado somente por animais, vetores de doenças, que até então parasitavam espécies especificas de animais, e que começam também a parasitar, mesmo que acidentalmente, animais domésticos e o próprio homem. Assim, o número de zoonoses transmitidas por artrópodes como ácaros, carrapatos, piolhos e pulgas tem aumentado, como é o caso das rickettsioses (FEREITA et al., 2000; LABRUNA et al, 2007; CHOMEL et al.,2010).
Rickettsioses são doenças infecciosas emergentes e re-emergentes transmitidas por artrópodes, causadas por rickettsias, bactérias intracelulares obrigatórias, de distribuição cosmopolita (PADDOCK et al., 2005; PAROLA et al., 2009).
Embora as rickettsioses, sob o aspecto taxonômico, devam ser consideradas, na atualidade, como um grupo de doenças causadas restritamente por proteobactérias, Gram negativas subgrupo 1 pertencentes à ordem Rickettsiales, Bartonella spp. e Coxiella burnetti, proteobactérias do subgrupo 2 e proteobactéria grupo , respectivamente, ainda permanecem sendo estudadas no campo da rickettsiologia (LEMOS, 2005).
As doenças infecciosas transmitidas por artrópodes como carrapatos, pulgas, ácaros e piolhos apresentam dispersão mundial. O seu maior reconhecimento, na atualidade, pode ser entre outros fatores, consequente o aumento real na incidência destas infecções pelo maior contato da população humana com a natureza ou a maior disponibilidade de técnicas diagnósticas, técnicas estas mais sensíveis e específicas que têm permitido a identificação de zoonoses emergentes e re-emergentes, até então desconhecidas. Ehrlichiose, febre maculosa e bartonelose são alguns exemplos destas doenças que, normalmente, encontradas em animais domésticos (cães, gatos e equinos) podem ser transmitidas acidentalmente ao homem. (LEMOS et al., 1997 a)
Febre maculosa e ehrlichiose, zoonoses transmitidas por carrapatos (do termo inglês “tick-borne diseases”), estão associadas com doenças de elevada morbidade e letalidade, na ausência de tratamento específico, tanto em animais quanto em humanos.
15
Os achados clínicos, laboratoriais e patológicos destas duas infecções vêm sendo descritos tanto em casos experimentais quanto aos ocorridos de forma natural (GREENE et al, 1985; BREITSCHWERDT et al., 1988; TROY et al., 1990; GREENE et al., 1993; LABRUNA et al., 2005; PIRANDA et al., 2008).
A importância médica e veterinária da infestação de carrapatos em animais está ligada à transmissão de uma grande variedade de agentes infecciosos. As doenças infecciosas transmitidas por carrapatos estão dentre as infecções de maior interesse e de maior potencial devastador entre os seres humanos e podendo ser viral, bacteriano em geral ou rickettsial. (SHAW et al., 2000).
Em relação às bartoneloses, um grupo de zoonoses causadas por diversas espécies de bactéria do gênero Bartonella cuja perpetuação na natureza depende dos vetores como pulgas, carrapatos e flebotomíneos. Desde início do século XXI vêm sendo descritas no Brasil não somente em pacientes imunocomprometidos, mas também em indivíduos imunocompetentes, além de felinos domiciliados e clinicamente sadios (LAMAS et al., 2006; SOUZA et al., 2009). Estudos recentes apontam para a importância dos carrapatos (Amblyomma cajennense e Rhipicephalus sanguineus) na manutenção das bartonelas na natureza e como fonte de infecção para cães. (DINIZ et al., 2007; BILLETE et al., 2008; CHOMEL et al., 2009)
Os gatos são os principais reservatórios de Bartonella henselae, agente da doença da arranhadura do gato, com relatos em diversos países (CHOMEL e KASTEN, 2010). A infecção por Bartonella é considerada uma zoonose emergente, cuja ocorrência pode ser proveniente de diversos fatores como alterações ambientais e o estado do indivíduo (BOLOUIS et al., 2005). Nos cães, embora faltem estudos mais completos sobre a interação entre o agente e o hospedeiro, casos de endocardite têm sido associados à bartonelose (BREITSCHWERDT et al., 1995 e 1999; BILLETER et al., 2008; DINIZ et al., 2007)
Rickettsioses do grupo da febre maculosa (RGFM) são doenças causadas por pequenas bactérias intracelulares obrigatórias, proteobactérias do subgrupo alfa 1, que
16
acometem tanto aos animais quanto ao homem e que são transmitidas por carrapatos (mais frequentemente), pulgas (Rickettsia felis) e ácaros (Rickettsia akari) (LEMOS, 2005)
No Brasil, a febre maculosa brasileira (FMB) é a principal RGFM, uma rickettsiose de grande importância na saúde pública podendo acometer tanto ao homem quanto ao cão, tendo como agente etiológico, a bactéria Rickettsia rickettsii, um microorganismo gram-negativo intracelular obrigatório encontrado no carrapato A. cajennense (Fabricius, 1787), vulgarmente conhecido como carrapato estrela, carrapato do cavalo e micuim. (MAGALHÃES, 1953, LEMOS et al., 1997; ESTRADA et al., 2006). Cunha e colaboradores, (2009) relataram a primeira detecção molecular de R. rickettsii em R.sanguineus naturalmente infectados em Resende, Estado do Rio de Janeiro.
A espécie de carrapato A. cajennense é encontrada em abundância em todos os estados das regiões Sudeste e Centro Oeste do Brasil. Nas áreas rurais da região Sudeste, os equinos são os principais hospedeiros urbanos para todos os estádios da espécie A. cajennense, muito embora outras diferentes espécies de mamíferos e aves possam ter participação efetiva no ciclo do ixodídeo. A maior importância dos equinos como hospedeiro primário de A. cajennense decorre ao fato de serem animais domésticos, criados em áreas cercadas com alta incidência de animais e massa corpórea capaz de albergar grandes infestações de carrapatos (LABRUNA et al., 2000) e, também por poderem circular por uma grande região, como os cavalos de carroceiro, dispersando estes vetores (FREITAS et al., 2010). Por outro lado, os animais silvestres, especialmente os de pequeno e médio porte, dificilmente albergam uma carga tão alta de carrapatos. Por esta razão, nos ambientes silvestres, com o mínimo de intervenção humana, as populações de carrapatos tendem a ser mais baixas. (ESTRADA et al., 2006)
A transmissão transovariana e sobrevivência natural transestadial verificada por R. rickettsii e seus vetores são fundamentais para perpetuação desses agentes na natureza, porém acredita-se que a presença de um hospedeiro amplificador, auxilia a manutenção da bactéria. Sendo assim trabalhos sugeriram que o gambá (Didelphis aurita) e a capivara (Hydrochaeris hydrochaeris) são amplificadores, nas regiões citadas como áreas de FMB (HORTA et al., 2005; LABRUNA, 2007).
17
Em termos práticos, os hospedeiros primários de A. cajennense são as antas, as capivaras e os eqüinos. Em uma área onde uma população de A. cajennense está estabelecida, pelo menos uma destas três espécies de hospedeiros deverá estar presente. Uma vez que a população de carrapatos cresce, ele passa a parasitar outros hospedeiros, chamados secundários, o homem e o cão, por exemplo. (ESTRADA et al., 2006).
Outras espécies de Amblyomma são citadas na literatura como vetores da FMB: A. aureolatum que pode ser encontrado infestando cães e eqüinos em São Paulo, foi descrito por Moraes-Filho e colaboradores (2009) como vetor da R.rickettsii na região metropolitana de São Paulo. Silva e colaboradores, (2011) sinalizam A.ovale como sendo um vetor em potencial para Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa em humanos, no Brasil.
Estudos mostram que R. sanguineus pode transmitir R. rickettsii em condições experimentais bem como natural, tanto no Brasil, quanto em outros países americanos (PIRANDA et al., 2008, CUNHA et al., 2009; ROZENTAL et al., 2008)
Cães infectados experimentalmente por R. rickettsii podem desenvolver a doença e apresentar trombocitopenia, depressão, inapetência, febre e lesão ocular, sinais esses presentes na ehrlichiose. (PIRANDA et al., 2008; LABRUNA et al,2009). A ocorrência de infecção natural por Rickettsia spp. nos animais é conhecida desde o início do século passado. Para um melhor entendimento do ciclo enzoótico da doença é fundamental o conhecimento da biologia dos hospedeiros, das espécies dos vetores e a interrelação entre o hospedeiro, vetor e o meio ambiente (HORTA et al., 2005; MORAES-FILHO et al., 2009). Burgdorfer e colaboradores (1975) relataram presença de R. rickettsii em 167 (18,9%) de 884 exemplares de R. sanguineus nos Estados Unidos.
Segundo Labruna (2005) trabalhos realizados desde a década de 30 têm levado a suspeitar das capivaras, gambás e coelhos como possíveis hospedeiros amplificadores de R. rickettsii para A. cajennense. Horta et al., (2004) relatou estudos realizados em São Paulo que comprovaram a infecção natural por R. rickettsii em animais selvagens, domésticos (cão) e no homem. No Rio de Janeiro, estudos indicaram presença de A. cajennense e R. sanguineus positivos para genes rickettsiais pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) (GEHRKE et al., 2009; ROZENTAl et al.,2009; CUNHA
18
et al., 2009). WALKER (2006) sinalizou para a importância de se estudar o carrapato vermelho do cão, R. sanguineus como um possível vetor para R.rickettsii.
Quanto ao gênero Ehrlichia, um grupo de parasitos intracitoplasmáticos de leucócitos e plaquetas do sangue circulante que infectam diversas espécies de mamíferos, inclusive seres humanos, é transmitido biologicamente por carrapato e as espécies Ehrlichia canis; Anaplasma platys; A. phagocytophilum; E.risticii e E. ewingii têm sido descritas causando infecção natural em cães como ehrlichiose canina simples ou como, co-infecção com outras rickettsioses no território brasileiro (BREITSCHWERDT et al., 1998; MACHADO, 2006).
Considerando que a ehrlichiose canina é uma doença muito bem conhecida pelos médicos veterinários e que muitos dos animais que apresentam sinais sugestivos de ehrlichiose, quando submetidos ao diagnóstico laboratorial para E.canis são negativos, a possibilidade de infecção por R. rickettsii deve ser suspeitada visto que clinicamente a febre maculosa e a ehrlichiose são semelhantes e que, em ambos os casos, temos um carrapato como vetor (ALMOSNY, 2002; LABRUNA et al., 2009).
Dessa forma e considerando que a relação homem animal vem se estreitando cada vez mais, com movimentos sempre crescentes da preservação e contato com a natureza, é esperado que um número maior de indivíduos possa adquirir infecções por rickettsias (PADDOCK, 2005). Diante do exposto, tornam-se necessárias pesquisas que busquem identificar os agentes nos animais domésticos e silvestres e em seus transmissores artrópodes com o objetivo de aumentar o conhecimento sobre este grupo de zoonoses transmitidas por carrapatos e colaborar com a vigilância destes agravos, tanto em animais quanto na população humana, que, na ausência de tratamento antimicrobiano específico, apresentam elevada letalidade.
Com a hipótese de que os cães domiciliados na região do Piraí seriam animais sentinelas para diferentes agentes transmitidos por carrapato como FMB, ehrlichiose e bartonelose, um projeto com o objetivo de confirmar a circulação de Bartonella spp., Ehrlichiaspp. e Rickettsia spp. em sangue de cães e em ectoparasitos no município de Piraí, localizado na região do Médio Paraíba – Rio de Janeiro foi desenvolvido, após relato de casos de rickettsioses ocorridos na referida região
19 II- FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 – Gênero Bartonella
2.1.1- Características e Taxonomia
As bartoneloses são doenças mundialmente dispersas causadas por alfaproteobactérias, da ordem Rhizobiales, família Bartonellaceae, cujas espécies, até 1993, consideradas pertencentes ao gênero Rochalimea, foram transferidas para o gênero Bartonella em decorrência da remota relação filogenética com os membros da família Rickettsiaceae (BRENNER et al., 1993; LEMOS, 2005).
Assim, até 1993, o gênero Bartonella era composto apenas pela espécie Bartonella bacilliformis, agente responsável pela doença humana conhecida como doença de Carrion e verruga peruana. Com o avanço tecnológico no campo da biologia molecular e o cultivo celular, várias espécies de Bartonella posteriormente foram incluídas, a partir da identificação de novas espécies e da transferência dos gêneros Rochalimea e Grahamella da família Rickettsiaceae para a família Bartonellaceae no gênero Bartonella que hoje, é composto por um grupo de mais de 23 espécies e subespécies Bartonella (BRENNER et al., 1993, BLANCO et al., 2008, LAMAS et al., 2008).
As bactérias do gênero Bartonella são Gram negativas, anaeróbias, móveis, intracelulares facultativas, pertencentes à classe das Proteobactérias (alfabactérias). (MAGGI e BREITSCHWERDT, 2005; BLANCO et al., 2008). Essas bactérias infectam eritrócitos, podendo invadir células endoteliais, células progenitoras CD34+e células dendríticas dos hospedeiros, levando a uma infecção persistente. (BOULOUIS et al., 2005; BILLETER, 2008).
20 Classificação da Bartonella: Reino Bacteria Filo Proteobacteria
Classe Alphaproteobacteria Ordem: Rhizobiales
Família: Bartonellaceae Genero Bartonella
CHOMEL et al., (2010) descreve a existência de 13 espécies ou subespécie suspeitas de serem patogênicas para humanos.(Quadro1)
Devido ao seu potencial zoonótico e de sua elevada incidência em diferentes regiões do mundo, espécies do gênero Bartonella são consideradas patógenos emergentes, com habilidade em infectar mamíferos reservatórios e hospedeiros, cuja transmissão está associada com inúmeros vetores incluindo, carrapatos, pulgas e piolhos (MAGGI e BREITSCHWERDT, 2005; KAMRANI, 2008; CHOMEL, 2010).
Várias espécies de Bartonella foram identificadas com grande potencial de causar doenças: Bartonella henselae, Bartonella clarridgeiae, Bartonella alsatica, Bartonella elizabethae, Bartonella grahamii, Bartonella vinsonii subsp. arupensis, Bartonella vinsonii subsp. Berkhoffii, Bartonella washoensis e Bartonella rochalimae (BILLETER et al., 2008). Maggi & Breitschwerdt (2005), descreveram a existência de 17 espécies de Bartonella sendo oito espécies isoladas em humanos (Quadro 1): B. bacilliformis na doença de Carrion e verruga peruana; B. quintana na febre das trincheiras, B. elizabethae, B. henselae, B. quintana, B. vinsonii subsp arupensis, B. vinsonii subsp. berkhofii e B. washoensis nas endocardites, B. quintana e B. henselae na angiomatose bacilar em pacientes imunocompetentes e B. henselae e B. clarridgeiae na doença da ranhadura do gato.
Outras espécies de Bartonella, incluindo B. alsatica, B. doshiae, B. grahamii, B. henselae, B. koehlerae, B. peromysci, B. talpae, B. taylorii, B. tribocorum e B. bovis foram isoladas em animais, incluindo cães, gatos, bovinos, veados e leões, sem relato de
21
patogenicidade para animais ou população humana (CHOMEL et al. , 2001; MEXAS et al., 2002; CHOMEL et al., 2006).
Quadro 1: Exemplos de espécies de Bartonella com potencial patogênico ao homem, seus reservatórios primário e hospedeiro acidental.
Adaptação de Chomel & Kasten, 2010
2.1.2- Transmissão
Com tropismo eritrocitário, os organismos do gênero Bartonella causam uma duradoura bacteremia em mamíferos e são transmitidos ao homem através de mordida ou arranhadura do gato como também por diferentes vetores, incluindo, flebotomíneos, pulgas, piolhos e potencialmente também, pelos carrapatos. (BREITSCHWERDT, 1999;, PAROLA et al., 2002; HALLOS et al., 2004; MAC DONALD et al., 2004; MAGGI E BREITSCHWERDT et al., 2005;; BREITSCHWERDT et al., 2005; DUNCAN et al., 2007; BILLETER et al., 2008 ).
Embora B. henselae tenha sido encontrada em pulgas assim como em carrapatos, até agora não há nenhuma evidência de que uma mordida de uma pulga infectada possa levar ao desenvolvimento da doença da arranhadura do gato por B. henselae. Dessa forma, é imprescindível a realização de projetos de pesquisa que verifiquem a presença Bartonella Reservatório primário Hospedeiro acidental B. bacilliformis
B. clarridgeiae
Homem
Felis catus Sem registro
B. elizabethae Ratus norvegicus(rato) Homem, cão
B. henselae Felis catus (gato) Homem, cão, cavalo e animais marinhos
B. quintana Homem Gato e cão
B. rochalimae Canideos Homem e cão
22
da bactéria em carrapatos e pulgas presentes no meio ambiente e em animais domésticos e selvagens (BREITSCHWERDT et al., 2005; BREITSCHWERDT et al., 2007)
2.1.3- Hospedeiros Vertebrados
Mamíferos e roedores estão envolvidos no ciclo natural da bartonelas. Várias espécies de Bartonella foram isoladas de pequenos roedores e co-infecção de espécies de Bartonella com Borrelia burgdorferi têm sido demonstradas em pequenos ratos selvagens capturados, frequentemente parasitados por larvas e ninfas de carrapatos. (CHOMEL et al., 2001; CHOMEL et al., 2004; BOLOUIS et al.,2005)
Yoshikawa et al. (2009) descreveram alta prevalência da infecção por Bartonella spp. em animais selvagens e domésticos na Europa, Ásia, América do Sul e América do Norte. Sendo esses animais considerados reservatórios e fonte de infecção para o homem.
Coiotes e raposas foram descritas por Breitschwerdt et al., (2007) como reservatórios de Bartonella vinsonii subsp. berkhofii, a partir de relatos de que coiotes apresentavam alta bacteremia em regiões com alto potencial de transmissão do carrapato vetor. Chomel & Kasten (2010), confirmaram o coiote como reservatório de bartonella (quadro 1)
Em relação aos felinos domésticos, estes são considerados reservatórios primários de três espécies de Bartonella - B. henselae, B. clarridgeiae e B. kohlerae, agentes bacterianos que causam manifestações clínicas em pacientes humanos, principalmente imunossuprimidos. (CHOMNEL, 2003). Holden e colaboradores (2006) identificaram a prevalência de 62% de B.henselae em gatos domésticos. Outro estudo realizado por Bolouis et al (2005) em gatos domésticos demonstraram uma prevalência variada de 5 a 80% para B. henselae, confirmando assim as variações nos índices de prevalência, levando em consideração a localização geográfica (Europa Ásia, Américas) e o status da população (gato doméstico ou de rua). Os gatos jovens são mais propensos a ser infectados e transmitir a bactéria para as pessoas com cerca de 40% dos gatos reativos para B. henselae em algum momento de suas vidas.
23
Na literatura, as infecções por Bartonella em cães, podem ocorrer, até o momento, por 5 espécies de bactérias: i) B. clarridgeiae e B. vinsonni subsp. berkhofftii, responsáveis por endocardites em cães; ii) B. elizabethae, DNA detectado em cães com perda de peso e morte súbita; iii) B. henselae, DNA seqüenciado em cão com hepatite granulomatosa e iv) B. washoensis, isolada em material de paciente com endocardite da válvula mitral. (BREITSCHWERDT et al., 1998; GUNDI et al., 2004; CHOMEL et al., 2006).
Pappalardo e colaboradores (1997) demonstraram que dos cães soro reativos para Ehrlichia canis (Donatien & Letosquart), 3,6% eram concomitantemente soro reativos para B.vinsonii subsp. Berkhoffii. Breitschwerdt et al (1998) demonstraram que 42% de 12 cães diagnosticados com ehrlichiose no NCSU Veterinary Teaching Hospital eram também B. vinsonii subsp. Berkhoffii sororreativos, concluindo que cães domiciliados ou livres, quando expostos a artrópode, devem ser considerados também como potenciais transmissores de diferentes espécies de Bartonella.
Kordick e colaboradores (1999) após estudarem um surto de cães doentes em um canil e seus proprietários, relataram que dos 18 animais PCR positivos para Bartonella, 17 tinham co-infecção para E.canis, E.chaffeensis, E. ewingii, Rickettsia spp. ou Babesia canis. Nesse estudo, foi possível identificar que 25 dos 27 cães (93%) eram B.vinsonii subsp. berkhoffii sororreativos.
Bolouis e colaboradores (2005) identificaram uma baixa incidência de infecção por B.vinsonii subsp berkhoffii em cães (< 5%) embora estudos com cães de ruas em regiões tropicais mostrem elevadas taxas de infecção por B. henselae como a de 19%, na Guiana Francesa, 63%, no sudeste dos Estados Unidos, 10,1% dos cães saudáveis e 27,2% de cães doentes. No mesmo ano, Henn e colaboradores relataram a prevalência na Califórnia e os cães foram todos sororreativos para B. henselae. (HENN et al, 2005)
Solano-Gallego et al (2006) em estudo sorológico de cães doentes (n= 206) e cães saudáveis (n= 260) expostos a artrópodes, na região nordeste da Espanha, demonstraram uma prevalência de 16,8% para B. henselae e de 56,4% para Rickettsia conorii. A soroprevalência dos grupos estudados tanto para a infecção para Bartonella
24
quanto para R. conorii, foi similar tanto para os animais doentes quanto os controle: 15,7% e 48,6% no grupo de cães saudáveis e e 19,2% e 49,3% no grupo dos cães doentes apresentaram positividade para Bartonella e R. conorii respectivamente.
Em outro estudo, o DNA de Bartonella foi detectado em amostras de sangue de tartarugas marinhas (Caretta careta Linnaeus), sugerindo a possibilidade da persistência de infecção sanguínea não somente em animais não mamíferos, dado este que reforça a complexidade do ciclo assim como a importância de estudos sobre o assunto. (VALENTINE, 2007)
No Brasil, estudos mais recentes realizados em gatos têm demonstrado prevalências elevadas de Bartonella spp. (LAMAS et al., 2006; SOUZA et al., 2009; STAGGEMEIR, 2010). Assim, no Estado de São Paulo, 46% dos 102 gatos avaliados por Diniz e colaboradores (2007) apresentaram soro reatividade para B. henselae, enquanto no Rio de Janeiro a presença da infecção por Bartonella foi reportada por LAMAS et al., (2006) e SOUZA (2008). Pesquisa realizada por Souza (2008) revelou que 90% dos gatos sadios e domiciliados apresentaram sororreatividade para Bartonella, na região de Vassouras, caracterizando a ampla circulação desse agente zoonótico na área. Até o momento, com exceção dos estudos em gatos e cães, não existem, no Brasil, estudos sobre a presença de bartonelas em outros animais, em especial nos animais silvestres.
Diniz et al., (2007) avaliaram, utilizando o teste imunofluorescência indireta para a detecção de anticorpos anti-B. henselae e anti-B. vinsonni subsp. berkhofftii, 198 amostras de soro de cães com histórico de infestação de carrapato e com manifestação clínica (epistaxis, melena, equimoses, sinais neurológicos e lesões oculares) ou com achados laboratoriais (leucopenia, trombocitopenia, hiperproteinemia) consistentes com doença de carrapato. Do total de amostras avaliadas, 2% (4/197) apresentaram reatividade para B. henselae e 1,5% (3/197) para B. vinsonii subsp . berkhofftii. Neste relato apenas em um cão (1/197) apresentou amplificação do DNA de Bartonella (16S-23S rRNA). Seis dos sete cães com anticorpos anti-Bartonella foram também positivos para E. canis, confirmando uma co-infecção.
25 2.1.4- Vetores:
Piolhos, flebotomíneos ácaros, pulgas e carrapatos são considerados vetores em potencial de Bartonella (DINIZ et al., 2007b). (Quadro 2)
No que diz respeito aos artrópodes convém ressaltar que há uma diferença significativa entre competência vetorial comprovada e vetor potencial. Experimentalmente, estudos relatam que há confiável transmissão entre vetor e hospedeiro, característica do vetor competente. O vetor competente é aquele com capacidade real de transmissão do agente. Em muitos casos a detecção de Bartonella spp em artrópodes é determinada por PCR ou cultura celular, não fornecendo, assim, provas definitivas da competência vetorial e podendo, consequentemente, representar apenas a ingestão de sangue infectado por Bartonella durante uma bacteremia do hospedeiro. (BILLETER, 2008)
Quadro2: Vetores confirmados na transmissão de espécies do gênero Bartonella e suas respectivas referências.
Vetor Confirmado Bartonella Referência
Ctenocephalides felis B.clarridgeiae, B.quintana Rolain et a (l2003) B.koehlerae,
B.henselae Ishhida et al,( 2001)
Ctenocephalides nobilis nobilis B.grahamiii e B.taylorii Bown et al (2004) B.elizabethae Reeves et al (2003), Lutzomyia verrucarum B.baciliformis Battisti (1929, 1931)
Pediculus humanus humanus B.quintana Swift (1920)
Adaptação de Billeter et al. , (2008)
Ctenocephalides canis (pulga do cão) é descrito como vetor suspeito na transmissão de B. henselae (Ishida et al, 2001) enquanto a espécie Ctenocephalides felis
26
é o vetor confirmado da pela transmissão de B. quintana, B.clarridgeiae e B. koehlerae. (ROLAIN, 2003; BILLETER et al, 2008)
A associação entre hospedeiro natural, vetores e Bartonella spp., geralmente determina o hospedeiro natural ou acidental assim como a provável distribuição geográfica da doença/infecção. Estudos realizados por Chul-Min-Kin et al., (2005) na Korea, relataram a presença de anticorpos específicos em humanos, fato que possibilitou a sugestão indireta de que a bactéria Bartonella poderia estar circulando em uma população de roedores e carrapatos hospedeiros- vetores envolvidos no ciclo natural da infecção. No mesmo ano Halos et al., (2005) a partir de seu estudos incluíram os ruminantes como hospedeiros de Bartonella, com a suspeita de que o vetor seria uma espécie do carrapato do gênero Ixodes já descrito anteriormente na Europa e na Califórnia.
Estudos sugerem que diversas espécies de carrapatos podem ser consideradas vetores em potencial de Bartonella spp. e apontam para a importância dos carrapatos na transmissão de Bartonella spp. para os hospedeiros,(Quadro 3) (BILLETER et al , 2008).
Quadro 3: Espécies de Bartonella presentes em Carrapatos vetores e suas respectivas origens e referências.
Carrapato Bartonella País Referência
Rhipicephalus saguineus B.henselae California, USA Wikswo (2007)
Dermacentor variabilis Bartonella spp California, USA Chang et al., (2002)
Dermacentor reticulates Bartonella spp California , USA Chang et al.,(202) Ixodes ricinus Bartonella henseale Italia Sanogo et al., (2003)
Polonia Podsiadly et al., (2007) Bartonella spp Austria Schabereiter-Gurtner et al.,(2003)
Ixodes pacificus B.henselae, B.quintana, California, USA Chang et al., (2001) B.vinsonii subsp. Berkhofii Chang et al., (2001) B.washoensis
Sem identificação Bartonella spp. Peru Parola et al., (2002)
27
A espécie de carrapato R. sanguineus, conhecido vetor de Babesia canis, é suspeita de ser o vetor de B. vinsonii subsp. berkhoffii uma vez que co-infecção em cães indiretamente reforça a importância do carrapato como vetor em potencial para B.vinsonii subsp. berkhoffii e B. canis.
Estudos realizados por La Scola et al., (2004); Halos et al., (2005); Estrada et al (2006); Billeter et al, (2008); Szabó et al, (2009) confirmaram que a o estádio de vida do carrapato é um fator que deve ser considerado tanto no diagnóstico molecular do microorganismo como também na transmissão da doença
Spitlsk e colaboradores (2008), detectaram, por meio de técnicas de biologia molecular (PCR), a presença de Bartonella spp., Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia muris, Rickettsia helvetica em roedores e carrapatos coletados da vegetação.
Halos et al, 2005 demonstraram a evidência de Bartonella sp em formas adultas e ninfal de Ixodes ricinus na França e a co-infecção com Borrelia burgdorferi lato sensu e Babesia sp. O estudo foi realizado em 94 amostras de carrapatos da espécie Ixodes ricinus, sendo 76 ninfas e 18 adultos (9 machos e 9 fêmeas), coletados da vegetação (pasto) durante a primavera na França, nove amostras (9,8%), sendo 3 ninfas e 6 adultos, apresentam um fragmento amplificado no tamanho esperado para Bartonella. Uma amostra referente a um carrapato adulto apresentou 96% de identidade para o gene de Bartonella schoenbuschensiis.
Outro estudo realizado nos Estados Unidos, em três locais de Santa Clara, na Califórnia, 151 carrapatos adultos coletados da vegetação foram testados para Bartonella e desses, 29 (19,2%) amostras apresentaram PCR detectável para Bartonella. Foi possível a identificação da espécie de Bartonella em 18 carrapatos infectados, sendo, 3 B. quintana, 6 B. henselae, 3 Bartonella washoensis, 5 Bartonella “strain cattle” -1 e 1 Bartonella vinsonii subsp berkhoffii. (CHANG et al , 2001)
Parola et al, (2002), descreveram a primeira evidência molecular de uma nova espécie de Bartonella spp. em pulgas e carrapatos no Peru, em um trabalho de campo realizado em novembro de 1998, no subúrbio de Santo Antônio, distrito de Wanchac,
28
cidade de Cusco, após uma epidemia de bartonelose humana ocorrida entre 1988 -1999 na área rural da cidade. Um total de 83 pulgas foi coletado de crianças de 40 escolas (educação infantil) e de adultos que frequentavam escola além da casa das crianças. Dez piolhos também foram obtidos de três pessoas e cinco pulgas coletadas de dois cães, cinco carrapatos no total sendo, quatro em um cão, e um em ovelha. Das 83 pulgas coletadas das pessoas, 30 pertenciam ao gênero Pulex e 53 ao Ctenocephalides. Os carrapatos não foram identificados, mas as pulgas dos cães pertenciam ao gênero Ctenocephalides e os piolhos eram Pediculis humanus corporis. O DNA de Bartonella por meio da PCR foi detectado em três exemplares de Pulex coletadas de pessoas e em um carrapato. Essa Bartonella (genótipo BF 1782; 17541 e 17688) apresentava diferenças quando comparada com Bartonella bacilliformis, cujo vetor Lutzomyia verrucarum é responsável pelos surtos na região. Sendo assim concluiu-se que se tratava de uma nova espécie de Bartonella detectada em pulgas e carrapatos no Peru e que apesar de humanos e flebotomíneos (Lutzomyia verrucanum) serem largamente conhecidos como reservatórios e vetor respectivamente, neste país latino americano, o papel dos roedores e dos artrópodes no ciclo da doença ainda está indefinido.
.
Mais recentemente Holden e colaboradores (2006), em um estudo realizado com 168 amostras adultas de I.pacificus, utilizando também a técnica de PCR, detectaram presença de B. henselae em 6,55% das amostras testadas.
Por fim, no contexto de estudo experimental, merece citação o estudo de Chomel et al, (1996), que após a coleta de pulgas de um gatil durante bacteremia, infestou, com estes exemplares, filhotes de gatos livres de patógenos (clinicamente saudáveis). A avaliação dos animais, após duas semanas demonstrou a bacteremia por Bartonella em 4 dos 5 gatinhos estudados, confirmando assim, C. felis como um vetor competente na transmissão de B.henselae e também como vetor potencial na transmissão da B. clarridgeiae, B quintana, B. koehlerae. Breitschwerdt et al, 2007 citaram a possibilidade da Ctenocephalides felis manter a infecção de B. quintana e a transmissão do microorganismo entre gatos que podem posteriormente transmitir Bartonella ao homem por mordedura ou arranhadura.
29
2.1.5 – Patogenia e Manifestações Clínicas nos Hospedeiro
Os cães com bartonelose apresentam quadro clínico caracterizado por epistaxis, melena, equimoses, sinais neurológicos e processos inflamatórios oculares que incluem uveíte, hifema e inflamação na retina. Febre pode estar presente, temperatura em torno de 39,4ºC. Os achados laboratoriais incluem trombocitopenia, hiperproteinemia, e leucopenia (BREITSCHWERDT et al., 2004; DINIZ et al., 2007).
Endocardites também são descritas em cães com infecção natural por B. henselae. (BREITSCHWERDT, 1995; MEXAS et al., 2002; CHOMEL et al., 2006). PAROLA et al, (2002), relataram que B. vinsonii subsp. berkhofii como responsável pela bacteremia e endocardites em cães, como também tem implicação em endocardites humanas. Estudos realizados por Breitschwerdt et al., (2004), descreveram que cães com evidência sorológica para B. vinsoni subsp. berkhofii apresentavam reação imunomediada, anemia hemolítica, meningoencefalite, vasculite cutânea e uveítes. Nos cães que apresentavam alterações hepáticas (hepatopatia granulomatosa e hepatite linfocítica), foram detectados DNA de B. henselae (Quadro 4).
Os gatos normalmente são assintomáticos mesmo os que apresentam infecção por B. henselae (CDC, 2006).
Nos homens as alterações clínicas são diversas (endocardites a sepsis) e informações mais completas podem ser obtidas em uma amplarevisão sobre as bartoneloses com ênfase no Brasil publicada por LAMAS e colaboradores em 2008e 2010.
Quadro 4: Aspectos clínicos da infecção por Bartonella em cães Bartonella spp. Sintomas em cães
B.clarridgeiae, Endocardite e Hepatite linfocítica
B. elizabethae Letargia, anemia e perda de peso
B. henselae Hepatite granulomatosa e epistaxis
30
B. koehlerae Não diagnosticada em cães
B.vinsonii subs. berkhoffii Endocardite, miocardite, arritmia, inflamação do coróide, uveíte , esplenomegalia, claudicação,
poliartrite e epistaxis
B. washoensis Endocardite
B.quintana Endocardite
Adaptação de Chomel et al, (2006)
2.1.6- Diagnóstico
Em cães, o teste sorológico de imunofluorescência indireta tem sido usado para detecção de anticorpos, anti-B. henselae e anti–B. v. berkhoffii com diluição inicial de 1:16 e cut-off em 1:64 ( DINIZ et al., 2007a).
Blanco et al, 2008, relataram que as técnicas mais utilizadas pra diagnóstico de Bartonella spp. são a imunofluorescência indireta e ELISA, lembrando que reações cruzadas podem ocorrer com outras espécies, como por exemplo, C.burnetii. Apesar do ponto de corte para se considerar uma amostra positiva possa variar de acordo com o autor, os autores sugerem neste trabalho que o ponto de corte para pacientes com doença da arranhadura do gato deveria ser de 1:64 e com endocardites, de 1:800.
Quanto à PCR, a amplificação do DNA bacteriano, utilizando “primer” 16S -23S tem sido amplamente utilizada nos estudos epidemiológicos das bartoneloses, permitindo a diferenciação de diversas espécies de Bartonella spp. Considerada uma técnica fácil e segura de ser realizada, se considerados os preceitos básicos para evitar contaminação, estudos mostraram que a PCR em tempo real é mais sensível e específica, sendo extremamente útil em pacientes com endocardites por Bartonella spp, quando se tem apenas o soro para realização do diagnóstico (MAGGI et al., 2005; BLANCO et al., 2006; BREITSCHWERDT, 2007;).
As bactérias do gênero Bartonella são consideradas microorganismos exigentes e fastidiosos (BLANCO et al., 2008) que podem ser cultivadas em um meio sólido,
31
Agar com infusão de cérebro e coração com chocolate (Agar chocolate - BHIA) ou em BAPGM, meio líquido de crescimento de Bartonella-alphabacteria, a temperatura de 35C em atmosfera saturada a 5% de CO2 , por seis semanas. A exigência de ambiente
controlado (temperatura e atmosfera) é um fator que dificulta muitas vezes o cultivo e desenvolvimento da bactéria nos laboratórios (KAMRANI, 2008).
2.1.7 – Prevenção
Segundo o CDC os indivíduos devem tomar cuidados quando estiverem brincando ou acariciando um gato, principalmente os filhotes, a fim de evitar arranhões e mordidas. No caso de mordidas e ou arranhões estas não podem ser lambidas pelos gatos e devem ser cuidadosamente higienizadas (com água e sabão). No caso de infecção no local da lesão e o paciente pode apresentar sinais como febre, dor de cabeça, inchaço dos gânglios linfáticos e fadiga, deve procurar atendimento médico especializado. O controle de pulgas do animal e do meio ambiente é uma medida preventiva bastante importante na bartonelose.
Medidas de higiene pessoal ao lidar com gatos, particularmente os jovens, evitando arranhaduras, mordidas e lambeduras, bem como a lavagem das mãos ao lidar com esses animais devem ser implementadas (COURA , 2005).
Segundo Boulouis et al (2005) cuidados na hora da adoção do filhote de gato, como por exemplo saber a procedência se o animal apresenta infestação por pulgas e medidas de higiene com o animal e após manipulação do mesmo diminuem o risco de uma infecção. Com relação aos cães, o uso de repelente, higienização do animal após passeio na rua e controle de pulgas que podem estar infectadas com B. henselae são medidas de controle eficazes.
2.2- Gênero Rickettsia
32
As rickettsioses são doenças causadas por bactérias da família Rickettsiaceae, constituída pelos gêneros Rickettsia, Orientia, Ehrlichia, Neorickettsia e Anaplasma (RAY et al.,2001). O gênero Rickettsia compreende bactérias da subdivisão alfa da classe Proteobacteria, as quais são coco-bacilos gram-negativos, em associação obrigatória com células endoteliais eucariotas, pertencentes à ordem Rickettsiales, distribuídos originalmente em três famílias Rickettsiaceae, Bartonellaceae e Anaplasmataceae (WEISS E MOULDER, 1984; YU E WALKER, 2003).
Rickettsia rickettsii, uma bactéria gram negativa intracelular obrigatória, é o gente etiológico da febre maculosa das Montanhas Rochosas nos Estados Unidos e no Brasil da febre maculosa brasileira, patogênica tanto para homens quanto para animais (LABRUNA et al., 2009). Encontrada em células intestinais e glândulas salivares de artrópodes, multiplica-se por divisão binária (RAOULT et al, 2005).
O gênero Rickettsia é composto por quatro grupos: 1) grupo do tifo (R. prowazekii (tifo epidêmico), R.typhi (tifo murino ou tifo endêmico) tendo como vetores o piolho do corpo (Pediculus humanus corporis) e pela inoculação de fezes de pulga (Xenopsulla cheopis) respectivamente; 2) grupo da febre maculosa 3) grupo transicional, representado pelas espécies R. akari, R. australis e R. felis e 4) grupo ancestral (R belli e R.canadensis) (LEMOS et al., 2002; HORTA et al, 2004; LEMOS, 2005 ; ESTRADA et al 2006; informação pessoal).
Com grande número de diferentes espécies (quadro 5), o grupo da febre maculosa, através de R. rickettsii, o protótipo das rickettsias do grupo da febre maculosa, tem sido relatada nos Estados Unidos, Argentina, Brasil, México, Costa Rica, Panamá e Colômbia (WEISS & MOULDER, 1984, BEATI & RAOULT, 1998; GUEDES et al, 2005; SANGIONE, 2003; PADDOCK et al, 2005; CARDOSO et al, 2006; BREITSCHWERDT, 2007) e em cada localidade a doença tem uma denominação: doenças das Montanhas Rochosas nos Estado Unidos, febre manchada no México, febre de Tobia na Colômbia e febre maculosa brasileira (GUEDES et al , 2005).
33
Quadro 5: Exemplos de Rickettsias Patogênicas do Grupo Febre Maculosa no Brasil e no Mundo. Espécie Doença Rickettsia rickettsii R. conorii R. africae R. australis R. honei R. sibirica R. japonica R. felis R. mongolotimonae R. slovaca R. helvética R. akari
Febre maculosa das Montanhas Rochosas, Febre Maculosa Brasileira
Febre botonosa
Febre da picada do carrapato Febre do carrapato de Queensland Tifo da ilha Flinders
Tifo siberiano ou do norte da Ásia Febre maculosa oriental
Tifo das pulgas californianas Rickettsiose européia Rickettsiose européia Rickettsiose européia
Rickettsiose variceliforme ou vesicular
Adaptação: Lemos et al, (1997 a, 2005); Beati e Raoult (1998); Sangioni (2003); Lamas et al (2008)
2.2.2 – Febre Maculosa
A febre maculosa é uma doença infecciosa descrita inicialmente em 1899 por Kenneth Marxy, na região das Montanhas Rochosas do noroeste dos Estados Unidos, tendo sido definida como uma doença febril endêmica (HARDEN et al 1990).
Em 1916 a bactéria foi nomeada de Rickettsia e em 1930 foi identificada no Brasil como tifo exantemático de São Paulo, quando José Toledo Piza diferenciou a febre maculosa das demais enfermidades exantemáticas (Weiss & Strauss, 1991). Desde então a febre maculosa vem sendo relatada em diversos estados do Brasil, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo e Rio de Janeiro (Lemos et al , 1996). Desde 2001, doença é de notificação compulsória (DNC) ao Ministério da Saúde, regulamentada pela portaria nº 2325/GM de dezembro de 2001.
34
O Brasil apresenta um histórico de doença rickettsial desde a década de 20, sendo a febre maculosa brasileira a mais grave das rickettsioses descritas, ocorrendo principalmente no sudeste do País. Em Minas Gerais tem sido registrada, desde a década de 1980, com uma maior ocorrência de inúmeros casos da doença em forma de epidemias em áreas rurais e periurbanas, com predominância nos vales do Jequitinhonha, do Mucuri e do Rio Doce (CARDOSO et al., 2006)
2.2.3- Transmissão
As rickettsias são transmitidas ao homem e animais por meio de picada de artrópodes hematófagos, tais como carrapatos, ácaros, pulgas e piolhos (hospedeiros invertebrados). Na natureza, a transmissão de R. rickettsii é vertical, transestadial e transovariana no carrapato, e horizontal nos hospedeiros e homem. (EREMEEVA & DASH, 2009).
A transmissão transovariana e a sobrevivência natural transestadial verificada por R. rickettsii em seus vetores, são fundamentais para perpetuação desses agentes na natureza e de sua manutenção na população de carrapatos, porém acredita-se que a presença de um hospedeiro amplificador, auxilia a manutenção da bactéria (HORTA et al., 2005).
A transmissão de R. rickettsii ocorre através da salivação do carrapato infectado no momento do repasto sanguíneo. Isto ocorre em um período de 4 a 6 horas após se fixar no hospedeiro, quando o artrópode regurgita o conteúdo com a bactéria, que penetra no hospedeiro através do sítio de fixação. Outra maneira é através da contaminação na pele do hospedeiro pelo esmagamento do carrapato, que pode ocorrer, caso o vetor seja retirado erroneamente (HARDEN, 1990; CAMARGO-NEVES et al, 2004). O microorganismo é então carreado pela via linfática ou por pequenos vasos para a circulação, invadindo as células alvo (WALTER, 2007).
35
Diversos animais auxiliam na manutenção do ciclo da doença, participando como hospedeiros primários ou acidentais. Segundo Speilman & Hodgson (2000), para que um vertebrado seja considerado bom hospedeiro amplificador de R. rickettsii na natureza, este deve preencher alguns requisitos como: ser susceptível à infecção; manter a bactéria circulante em níveis plasmáticos suficientes para infectar vetores; ter alta taxa de renovação populacional; ser abundante na área endêmica e ser bom hospedeiro do carrapato vetor. Equinos e cães são considerados animais sentinela para febre maculosa brasileira (LEMOS et al., 1996), atuando também como amplificadores da população de carrapatos, estes animais vivem no peridomicílio humano, tendo grande importância na epidemiologia da doença (Speilman & Hodgson, 2000).
Trabalhos conduzidos no Brasil têm sugerido que o gambá (Didelphis aurita) e a capivara (Hydrochaeris hydrochaeris) são amplificadores da população de carrapatos, nas regiões citadas como áreas de FMB. (HORTA et al., 2005; LABRUNA et al., 2007).
Em termos práticos o hospedeiro primário de A. cajennense são os eqüinos, as antas e capivaras e assim, em uma determinada área onde uma população de A. cajennense tenha se estabelecido, pelo menos uma destas três espécies de hospedeiros deverá estar presente. Uma vez que a população de carrapatos cresce, ele passa a parasitar outros hospedeiros, chamados secundários, o homem e o cão, por exemplo. (SUCEN,2004). Este carrapato caracteriza-se por ter uma baixa especificidade de hospedeiro, principalmente em seus estádios imaturos (ARAGÃO & FONSECA, 1961)
Considerando o grande número de estudos sobre a importância do cão na epidemiologia da febre maculosa, alguns resultados em diferentes regiões do Mundo serão apresentados a seguir, mostrando a complexidade e a especificidade epidemiológica da infecção em cada localidade.
Nos anos de 1984 e 1997, utilizando o teste de imunofluorescência indireta como método de diagnostico, 30 cães foram identificados com febre maculosa das Montanhas Rochosas (FMMR) na Carolina do Norte, com títulos sorológicos, para R. rickettsii, de 1:1024. Todos os 30 cães apresentavam idades variadas, sendo 50% idade superior a 7
36
anos, 43% idade entre 2 e 7 anos e 17% tinham histórico de exposição a carrapato. (GASSER et al., 2001).
Estudo realizado em três cães e duas pessoas que apresentavam sinais clínicos compatíveis com FMMR, na Carolina do Norte, utilizando a técnica de cultivo celular (Células VERO) para extração de DNA com posterior técnicas moleculares demonstrou 100% de homologia para R. rickettsii, para o “primer” “omp” A nas amostras dos cães e dos humanos. Esse estudo sugeriu que os cães servem como sentinelas naturais para o microorganismo. (KIDD et al., 2006).
No mesmo ano, ainda nos Estados Unidos, um estudo epidemiológico em cães em uma área com casos humanos confirmados de FMMR no Arizona, demonstrou alta sororreatividade para R rickettsii, com 5,1% de 329 cães com anticorpos séricos além da presença de R. sanguineus como a espécie de carrapato associada com os casos humanos. Os resultados obtidos neste estudo confirmaram a circulação do agente infeccioso e de R. sanguineus na região e com evidências da participação do cão como sentinela e hospedeiro primário para o carrapato da espécie R. sanguineus. (NICHOLSON et al., 2006).
Em outro estudo, Scorpio et al em 2009 descreveram que 21 cães, de rua, sem raça definida (SRD) que seriam utilizados em um estudos de alterações cardíacas, apresentaram, durante exames laboratoriais preliminares, algumas alterações, como febre e depressão. Esses cães então foram submetidos a testes de IFI para doenças relacionadas à exposição de carrapatos e 2 (10%) dos 21 cães estudados apresentavam sintomas clínicos, 15 (71%) eram sororreativos para três agentes transmitidos por carrapatos: Ehrlichia, Rickettsia e Borrelia, confirmando, assim. a premissa de que cães de rua, sem domicílio, são susceptíveis a doenças pela maior exposição a carrapatos.
Quanto à presença de coinfecção, Kordick et al (1999), relatou a infecção de múltiplos patógenos de doenças transmitidas por carrapatos em cães de um canil na Carolina do Norte e de pessoas que freqüentavam o local e que mantinham contato com os animais. No referido estudo 27 amostras de soros de cães e 23 de homens foram analisadas, os cães apresentaram reatividade para Ehrlichia spp. (26/27); Babesia canis (16/27); B. vinsonii (25/27) e R. rickettsii (22/27), enquanto as amostras humanas
37
apresentaram reatividade para B. henselae e E. chaffeensis. Segundo SCORPIO e colaboradores (2008) a infecção por Ehrlichia, Rickettisia e Borrelia nem sempre causam doença clínica evidente no cão, no entanto a infecção por Ehrlichia e Borrelia pode persistir e causar, consequentemente, uma estimulação imune que poderá afetar a fisiologia do animal, expondo-o a outros agentes infecciosos.
Já no continente asiático, estudos realizados no Japão têm confirmado a circulação de RGFM. Na cidade de Okinawa, 2,4 % de 340 amostras de sangue coletadas de cães apresentaram-se reativas para RGFM e 84 “pool” de 229 carrapatos capturados sobre os cães testados para a pesquisa de rickettsias por PCR, utilizando os primer 190 KDa e citrato sintase, apresentaram similaridade para R. japonica e R. aeschimanii os agentes da febre maculosa na região (SATOH et al, 2002).
Estudos na Europa têm demonstrado com freqüência crescente a circulação de agentes rickettsiais. Solano- Galego et al (2006) descreveram, na Espanha, alta prevalência (56,4%) de cães infectados por RGFM, confirmando assim o papel do cão como animal sentinela. No mesmo ano, Torina e Caracappa relataram prevalência de 21,7% na região da Sicília.
No Brasil, assim como nos EUA, a febre maculosa foi descrita inicialmente em seres humanos, em 1929, conhecida então como tifo exantemático de São Paulo (PIZA; MEYER; GOMES, 1932). Estudos realizados durante a década de 30 relacionando o tifo exantemático e a febre maculosas das Montanhas Rochosas, verificaram que a doença que ocorria no Brasil era semelhante a dos Estados Unidos, sendo assim foi denominada de Febre Maculosa Brasileira. Nas últimas três décadas estudos sobre rickettsia em cães têm sido realizados principalmente nos estados da região sudeste. Estudos realizados por De Lemos e colaboradores nos anos de 1994, 1996, 1997, 2001 e 2002 relataram animais e indivíduos infectados com R. rickettsia em Minas Gerais e São Paulo, áreas endêmicas para FMB. Galvão (1996), estudando o comportamento da febre maculosa brasileira no município de Caratinga, por meio de inquérito sorológico, registrou uma soroprevalência de 2% em humanos, 25% em cães e 53% em eqüinos para R.rickettsii, por meio de imunofluorescência indireta. Com a inclusão da FMB como doença de notificação no Brasil, um maior número de estudos com cães e eqüinos vem sendo
