Procedimento de lavagem:

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Esta etapa foi realizada em cabine de segurança biológica classe II B2.

A superfície externa dos carrapatos foi desinfetada deixando-os submersos em hipoclorito 10% misturando através de vórtex 3 minutos, seguida pela imersão em álcool 70% por 3minutos sob agitação. Após a retirada do álcool e lavagem por 3 vezes com água destilada estéril (misturando com agitador vórtex a cada troca de água), a água foi totalmente removida na última lavagem, utilizando para todas as etapas, exceto a última retirada da água, pipetas automáticas com volume de 1000 µL

3.6.2.2. – Extração de DNA

Após lavagem, os ectoparasitos foram acondicionados em microtubos estéreis, e posteriormente mergulhados em nitrogênio líquido por cerca de 10 segundos para possibilitar a pulverização do carrapato com um pistilo plástico estéril.

Uma vez triturados, o DNA dos ectoparasitos foi extraído utilizando o protocolo para tecido, do QIAamp DNA mini Kit, descrito a seguir.

Descrição do procedimento:

1. No microtubo (Eppendorf) de 1,5ml, contendo a amostra (ectoparasito triturado) foram adicionados 180µl do tampão de lise ATL;

2. Em seguida foram adicionados 20 µL de proteinase K, que foram homogeinizados, utilizando o vortex e depois incubados a 56ºC “overnight”.

3. Após a incubação, o material foi centrifugado brevemente (spin) para a retirada das bolhas;

4. 200 µl do tampão de lise AL foram adicionados a amostra, homogeneizados, utilizando o vortex por 15s. Após incubação a 70ºC por 10 minutos, o material foi centrifugado brevemente (spin) para a retirada das bolhas que possam ter sido formadas em cima do liquido.

5. 200 µL de etanol (96-100%) foram adicionados na amostra, misturados, utilizando o vortex por 15s. Após homogeneização, foi realizada uma breve centrifugação (spin) do tubo para retirada das bolhas que possam ter sido formadas em cima do liquido.

6. A mistura, inclusive o precipitado da etapa 5 foi transferida para a Coluna QIAamp. Após transferência do conteúdo para a coluna, a tampa foi fechada e submetida à

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centrifugação a 8000rpm por 1 minuto. A coluna foi transferida para um novo tubo coletor de 2 mL e o tubo descartado com o filtrado. Essa etapa foi repetida até que toda a mistura da etapa 6 tivesse sido filtrada.

7. 500 µl de tampão AW1 foram adicionados na coluna e depois centrifugados por 8000 rpm por 1 minuto. O tubo com o filtrado foi descartado e a coluna colocada em um tubo novo.

8. 500 µL de tampão AW2 foram adicionados na coluna e centrifugados a 14000 rpm por 3 minutos. O filtrado foi desprezado e o material centrifugado novamente (spin). O tubo coletor com o filtrado foi descartado e a coluna colocada em um microtubo estéril de 1,5mL.

9. Um volume de 100 µl de tampão AE fracionada em duas vezes foi adicionado, incubado a temperatura ambiente por 5 minutos, seguida de centrifugação a 8000 rpm por 1 minuto. A coluna foi descartada e o tubo de 1,5mL, devidamente identificado, foi acondicionado a -20º C.

3.6.2.3- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A técnica de reação em cadeia da polimerase foi realizada no LHR, seguindo os protocolos previamente estabelecidos e validados, de acordo com a tabela 1

Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados para detecção de bactérias do gênero Rickettsia e Bartonella. Primer Seqüência (5’-3’) Temp. Anelamento Tamanho do Frag. Amplif. Referência 1_CAT1 CAT2 2 Rr190-70 Rr190-602 GATTCAATTGGTTTGAAGGAGGCT TCACATCACCAGGACGTATTC ATGGCGAATATTTCTCCAAAA AGTGCAGCATTCGCTCCCCCT 60°C 55°C 414 pb 532 pb Anderson et al. 1994 Eremeeva et al. 1994 2 RpCS877 RpCS1258 GGGGGCCTGCTCACGGCGG ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA 55°C 381 pb Eremeeva et al. 1994 2_TZ15 TZ16 TTCTCAATTCGGTAAGGGC ATATTGACCAGTGCTATTTC 55°C 246 pb Tzianabos et al 1989 1 – Bartonella; 2 – Rickettsia

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As amostras de DNA obtidas das amostras de sangue dos cães foram processadas em “pool”, que foi constituído de até 5 amostras de DNA. Os “pools” que apresentaram positividade, as suas referidas amostras (DNA) foram, posteriormente, testadas individualmente. Este procedimento foi preconizado em decorrência do grande número de amostras e a restrição orçamentária para a realização da análise molecular individual de todas as amostras incluídas no estudo.

Os ectoparasitos foram processados individualmente (quando o animal apresentava ectoparasitos de sexos e ou espécies diferentes) ou em “pool” (animais que apresentavam mais de três ectoparasitos da mesma espécie e sexo).

3.6.2.3.1- PCR Bartonella (DNA cães e DNA de ectoparasitos)

a) DNA das amostras de sangue dos cães

A PCR para a proteína 60-kDa foi feita como descrito anteriormente (Anderson et al., 1994; Avidor et al., 1997; Lamas et al., 2007) e os primers utilizados para amplificação do fragmento do gene htrA, que define um fragmento de 414 pares de base para B. henselae e B. quintana se encontram listados na Tabela 1. O Mix da reação de PCR (volume total de 25 μL) foi composto por 8 μL de DNA, 10,95 μL de água (DNAse free), 2,5 μL de tampão de PCR 10x, 1,2 μM de cada primer (IDT/ PRODIMOL), 0,2 μL de cada nucleotídeo (dNTP), 0,75 μL de MgCl2 e 0,25 μL de

Taq polymerase (Platinum Taq, INVITROGEN). O termociclador automático 2.400 (Applied Biossystem) foi programado para desnaturação de 95ºC por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 95ºC por 30 segundos, anelamento a 60ºC por 30 segundos, e extensão a 72ºC por 1 min. A amplificação foi completa na temperatura de 72ºC por 7 minutos para permitir a total extensão dos produtos da PCR. Cada reação de PCR incluiu DNA extraído de B. henselae como controle positivo e água DNAse free (PROMEGA) como controle negativo para verificar a ausência de contaminação pelo DNA.

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O DNA extraído foi amplificado utilizando os pares de primers para amplificação do fragmento de gene htrA, que define um fragmento de 414 pares de base para B. henselae e B. Quintana, descritos na Tabela 1. O MIX da reação de PCR (volume total de 25 μL) era composto por 8 μL de DNA; 10,15 μL de água (DNAse free) 2,5 μL de tampão de PCR 10 x, 1,5 μL de MgCl2, 1,2 μM de cada primer (IDT/ PRODIMOL),

0,2 μL de cada nucleotídeo(dNTP), 0,25 μL de Taq polymerase (Platinum Taq, INVITROGEN). O termociclador automático 9.700 (Applied Biossystem) foi programado para desnaturação de 95ºC por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 95ºC por 30 segundos, anelamento a 60ºC por 30 segundos, e extensão a 72ºC por 1 minuto. A amplificação foi completa na temperatura de 72ºC, por 7 minutos, para permitir a total extensão dos produtos da PCR. Cada reação de PCR incluiu DNA extraído de B. henselae como controle positivo e água DNAse free (PROMEGA) como controle negativo para verificar a ausência de contaminação pelo DNA.

3.6.2.3.2- PCR Rickettsia (amostras DNA de cães e ectoparasitos)

a) DNA das amostras de sangue dos cães

A PCR para a proteína de superfície 17-kDa foi feita como descrito anteriormente (TZIANABOS et al., 1989). O DNA extraído foi amplificado com o par de primers (Tabela1) para amplificação do fragmento de 17-kDa, que define um fragmento de 246 pares de base para RGFM. O “Mix” da reação de PCR (volume total de 25 μL) era composto por 8 μL de DNA, 10,95μL de água ( DNAse free), 2,5 μL de tampão de PCR 10 x, 1,2 μM de cada primer (IDT/ PRODIMOL), 0,2 μL de cada nucleotídeo (dNTP), 0,75 μL de MgCl2 e 0,25 μL de Taq polymerase (Platinum Taq,

INVITROGEN). O termociclador automático 9.700 (Applied Biossystem) foi programado para desnaturação de 95ºC por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 95ºC por 40segundos, anelamento a 55ºC por 1 minuto, e extensão a 72ºC por 1 minuto. A amplificação foi completa na temperatura de 72ºC por 7 minutos para permitir a total extensão dos produtos da PCR. Cada reação de PCR incluiu DNA extraído de R.rickettsii como controle positivo e água DNAse free (PROMEGA) como controle negativo para verificar a ausência de contaminação pelo DNA.

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As amostras também foram testadas para os primers citrato sintase (RpCS 877/Rp CS 1258) e ompA (Rr 190-70 e Rr 190-602) que amplifica com 532 pares de base (Tabela 1) sendo o protocolo o mesmo, mudando apenas o primer.

.

b) DNA dos ectoparasitos

As amostras de DNA de ectoparasitos foram processadas separadamente ou em “pool”, sendo que cada “pool” foi constituído de no máximo 5 amostras de ectoparasitos, da mesma espécie e sexo. E esses ectoparasitos pertencentes ao mesmo hospedeiro.

A PCR para a proteína de superfície 17-kDa foi feita como descrito anteriormente (TZIANABOS et al., 1989). O DNA extraído foi amplificado com o par de primers TZ15/TZ16 para amplificação do fragmento de 17-kDa que define um fragmento de 247 pares de base para RGFM. O MIX da reação de PCR (volume total de 25 μL) era composto por 8 μL de DNA, 10,15 μL de água ( DNAse free), 2,5 μL de tampão de PCR 10 x, 1,2 μM de cada primer (IDT/ PRODIMOL), 0,2 μL de cada nucleotídeo(dNTP), 1,5 μL de MgCl2 e 0,25 μL de Taq polymerase (Platinum Taq,

INVITROGEN). O termociclador automático 9.700 (Applied Biossystem) foi programado para desnaturação de 95ºC por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 95ºC por 40 segundos, anelamento a 55ºC por 1 minuto, e extensão a 72ºC por 1 minuto. A amplificação foi completa na temperatura de 72ºC por 7 minutos para permitir a total extensão dos produtos da PCR. Cada reação de PCR incluiu DNA extraído de R.rickettsii como controle positivo e água DNAse free (PROMEGA) como controle negativo para verificar a ausência de contaminação pelo DNA.

Para as amostras de DNA de ectoparasitos, além da reação do primer descrito acima foi realizado também reação para os primer RpCS 877/RpCs 1258 (gltA -381pb) e ompA-531pb ( Rr190-70 e Rr 190-602 ), como descrito anteriormente.

62 3.6.2.3.3.- Eletroforese

Esta etapa foi realizada para as amostras de DNA dos cães e dos ectoparasitos. Para confirmar a amplificação, 10L de cada produto de amplificação acrescido de 2l de tampão da amostra (10X Blue Juice, INVITROGEN) foram separados em gel de agarose a 1,5 % corado com 2L gel Red. A eletroforese foi realizada em tampão TBE 1X a 5V/cm (100volts) e os produtos de amplificação foram visualizados sob luz ultravioleta, documentado com um sistema de documentação de gel. Para permitir o cálculo do tamanho dos fragmentos foi utilizado o padrão de tamanho de DNA 100 pb em cada gel. A presença de uma banda de 414 pares de base foi considerada positiva para Bartonella e a banda de 381pb (primer CS), banda 532pb (primer ompA) e banda 247 (primer TZ) foram consideradas positivas para RGFM.

3.6.2.3.4- Sequenciamento das amostras de DNA de ectoparasitos

A reação de sequenciamento foi realizada em amostras de DNA de ectoparasitos dos cães e da vegetação positivas para B. henselae e R. rickettsii. As amostras positivas foram escolhidas, utilizando como critério, a espécie de ectoparasito, de tal forma que foram selecionados exemplares das diferentes espécies de ectoparasitas coletados na área de estudo R. sanguineus, A. cajennense e ninfas de Amblyomma, Ctenocephalides canis e Ctenocephalides felis.

O produto amplificado foi produzido por PCR a partir do DNA genômico bacteriano, como descrito anteriormente. Para ser sequenciado, o produto de amplificação foi primeiramente submetido à eletroforese em gel de agarose, A seguir, o produto foi extraído do gel de agarose utilizando o kit de purificação de ácidos nucléicos QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN). Após a purificação, a concentração do fragmento de DNA foi determinada (DNA low mass ladder – Invitrogen). A reação de sequenciamento foi realizada por uso do ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit versão 3.1 (Applied Biosystem), seguindo o descrito pelo manual do fabricante.

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Reação de sequenciamento: Após a purificação e quantificação de todas as amostras, o volume necessário foi estimado para aproximadamente 60 ng por reação de sequenciamento, cujo volume final foi de 20 ul. Reações, com os dois iniciadores específicos, para cada amostra, foram realizadas separadamente; assim o sequenciamento foi realizado nas duas direções do gene. Na reação foram utilizados, 5 ul de DNA molde, 2 ul de BigDye, 4ul de buffer 5x e 1ul de iniciadores (3,2 pmoles), e 8 ul de água. O microtubo com a reação foi colocado no termociclador (GeneAmp 9700, Applied Biosystem), com um programa de 30 ciclos (96°C por 10 segundos; 50°C por 5 segundos; 60°C por 4 minutos). Após o final da reação, procedeu-se a precipitação do material, utilizando Kit comercial, BigDye® XterminatorTM Purification, da Applied Biosystems.

Toda a análise do seqüenciamento dos fragmentos foi realizada através do

Programa BioEdit sequence Alignmen Editor 7.0.9

(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) e a identidade dos nucleotídeos e dos aminoácidos foi determinada pelo uso do BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). A análise de alinhamento múltiplo pelo programa clustal W com o programa MEGA 4.0.2. (http://www.megasoftware.net/).

Descrição do procedimento de sequenciamento:

1- Adição, em cada poço, do volume de solução (SAM TM solution), especificados no protocolo: Para cada 10 µl de reação, foram adicionados 45 µl de SAM TM solution e 10 µl de BigDye® XterminatorTM solution

2- Adição, em cada poço, do volume de solução (BigDye® XterminatorTM solution) de acordo com o protocolo: Para cada 10 µl de reação, foram adicionados 45 µl de SAM

TM

solution e 10 µl de BigDye® XterminatorTM solution 3- A placa foi selada com filme

4- Homogenização do conteúdo da placa por 30 minutos 5- Centrifugação da aplaca por 2 minutos a 1000rpm. 6- Colocação da placa no Sequenciador

64 IV- RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1.- Análise das amostras de sangue dos cães

4.1.1- Análise sorológica das amostras de sangue dos cães

IFI Bartonella henselae

Nove (4,76%) de 189 amostras submetidas à pesquisa de anticorpos anti-B. henselae foram reativas, resultado este próximo aos dados obtidos por Diniz e colaboradores em 2007, no qual foi observada uma prevalência de 2% de cães incluídos no estudo. (Figura 4.1). No entanto, a prevalência de B. henselae em cães na literatura mundial tem se apresentado de forma variada na dependência da região onde foi realizada a pesquisa. Assim, Gary e colaboradores (2006) identificaram uma prevalência de 5,45% utilizando IFI com um ponto de corte de 1:64; Bolouis e colaboradores, (2005) encontraram uma elevada prevalência, 19%, em cães de ruas na Guiana Francesa e 63% em cães no sudeste dos Estados Unidos; Solano – Gallego e colaboradores (2006) identificaram uma prevalência de 15,7% em cães saudáveis na Espanha.

Figura 4.1. Teste de imunofluorescência indireta com antígeno Bartonella henselae, aumento de 40X. Imagem A (controle negativo), imagem B (amostra sororreativa), diluição de 1:64.

65

Apesar dos poucos trabalhos sobre o assunto é possível concluir que os resultados positivos obtidos no trabalho são superiores aos citados na literatura nacional e inferiores aos da literatura internacional.

IFI Rickettsia rickettsii

Dezessete das 22 amostras reativas para R. rickettsii na diluição 1:64 foram submetidas a novas diluições (“end point”) quando foi possível observar que três amostras apresentavam reatividade na diluição 1:128 e outras três apresentaram titulação de 256 (Figura 4.2.). Resultados semelhantes foram encontrados em estudos conduzidos no Brasil, com prevalência variando de 11,6% a 36,4% (LEMOS et al, 1996; GALVÃO et al, 1996; LABRUNA et al, 2007).

Figura 4.2. Teste de imunofluorescência indireta com antígeno Rickettisa rickettsii, aumento de 40X. Imagem A (controle positivo), imagem B (amostra sororreativa), diluição 1:64.

A

B

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Em 1996, Lemos e colaboradores identificaram sororreatividade para R. rickettsii em 36,4% dos cães incluídos no estudo em uma região endêmica para febre maculosa no interior de São Paulo. Galvão e colaboradores, também em 1996, em um estudo realizado em área endêmica no estado de Minas Gerais, identificaram uma soroprevalência de 25%. Mais recentemente, no estado de Rondônia, Labruna e colaboradores (2007) demonstraram que 11,6% (19 de 164 animais) dos cães da área rural apresentavam anticorpos anti-Rickettsia spp., mesma porcentagem encontrada no atual estudo para R. rickettsii.

Na literatura internacional as prevalências variam em torno de 2,4 % a 50% (SATOH e t al, 2002; NICHOLSON et al, 2006; GALLEGO et al, 2006; SCORPIO et al, 2008). SCORPIO et al.,(2008), utilizando as mesmas diluições relataram prevalência de 43% para R. rickettsii. Em pesquisas de Demmma et al., (2006), os cães de duas comunidades apresentaram titulação ≥ 32 anti- R. rickettsii. Os cães pertencentes a uma das comunidades estudadas e com histórico de casos humanos de febre maculosa apresentaram 70% positividade enquanto que 57% apresentavam reatividade na comunidade sem casos de febre maculosa. Nos trabalhos de Niccholson et al., (2006), os cães apresentaram 5,1% de positividade anti- R. rickettsii com títulos ≥ 32, em uma área com casos de febre maculosa. Gary et al., (2006) observaram a prevalência de 4,41% de R. rickettsii, enquanto no Japão a circulação de RGFM foi de 2,4%, segundo Satoh e colaboradores (2002).

No presente estudo a prevalência de R. rickettsii em cães domiciliados é semelhante a descrita em literatura nacional e internacional, sugerindo assim o cão como sentinela. Considerando que o resultado de um teste sorológico fornece apenas a informação de uma evidência sorológica indireta de infecção, ressaltando a importância de uma interpretação cuidadosa, pois, além da possibilidade de um teste falso positivo, a presença de anticorpos poderá indicar apenas uma “cicatriz sorológica” e não uma infecção ativa/doença, já que a maioria dos estudos são com base na pesquisa de anticorpos da classe IgG.

Quando as amostras de soro com evidência sorológica de co-infecção foram avaliadas, observou-se que 11 das 189 amostras foram reativas para R. rickettsii e E. canis (1%) e 2 de 189 amostras foram reativas para B. henselae e E. canis, dados esses

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inferiores ao relatados por Breitschwerdt et al., (1998) e por Scorpio et al., (2008) quando avaliaram a prevalência de Ehrlichia, Rickettsia e Borrelia em cães que apresentavam sinais clínicos compatíveis com doença de carrapato. Em 1999, Breitschwerdt e colaboradores demonstraram que cães naturalmente infectados por Ehrlichia spp. apresentavam evidência sorológica para infecção por Bartonella, confirmando assim os dados obtidos no atual estudo. No mesmo ano, Kordick e colaboradores também demonstraram que cães de um canil da Carolina do Norte apresentaram sororreatividade com título de corte de 1: 32 para Ehrlichia spp e R. rickettsii. No Brasil, Diniz e colaboradores identificaram que apenas uma (01) dos 189 amostras de cães estudas apresentou co-infecção para B.henselae e E. canis.

Segundo alguns autores como Kordick et al., (1999), Boloius et al., (2005) e Scorpio, et al., (2008) fatores como, (i) exposição freqüente a vetores e reservatórios, (ii) imunossupressão, (iii) animais que passeiam ao ar livre e (iv) animais de rua que poderiam estar associados à bartonelose em cães. Os cães incluídos nesse estudo se apresentavam clinicamente sadios e apesar de domiciliados, os proprietários relataram que os mesmos passeavam regularmente no peridomicílio, tendo contato com vegetação, carrapatos vetores e equinos, fatores esses que podem, provavelmente, estar associados à presença de co-infecção, conforme sugerido pelos autores acima citados.

IFI Ehrlichia canis

Quarenta e cinco (23,8%) do total de 189 amostras testadas para E. canis apresentaram reatividade ≥ 64. Os resultados obtidos estão em concordância com os dados disponíveis na literatura nacional nos quais é possível observar prevalência de 6,3% a 42,5% em diversas regiões do Brasil comprovando a ampla dispersão desta zoonose (ALMOSNY et al, 2002, DIECKMANN et al, 2010, SILVA et al, 2011).

Na literatura internacional merece citação a publicação de Gary e colaboradores (2006) que obtiveram uma prevalência de 0,37%, em cães positivos (≥ 64) em Ontario/Quebec enquanto Scorpio et al , (2008), nos Estados Unidos utilizando ponto de corte 1:64 encontraram prevalência de 48% para E.canis.

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Uma figura esquemática é apresentada a seguir com o objetivo de sumarizar os dados sorológicos obtidos após análise como o teste de imunofluorescência para os três agentes pesquisados (Figura 4.3).

Figura 4.3: Relação do número de amostras de sangue dos cães sororreativas para Bartonella, Ehrlichia e Rickettsia

4.1.2 – Análise molecular (PCR) das amostras de sangue dos cães

Apenas um “pool” apresentou positividade para Bartonella, com amplificação do fragmento de 60-kDa que define um fragmento de 414 pares de base. No entanto, com a análise individual das amostras, as mesmas apresentaram banda abaixo do esperado, o que pode ser indicativo de uma reação cruzada. Os resultados obtidos necessitam de mais esclarecimentos que somente serão possíveis com a continuidade do estudo e com uma análise molecular a partir de outros iniciadores específicos para Bartonella.