A análise estatística dos resultados obtidos foi realizada comparando os dados referentes à contagem das espécies de Candida estudas para cavidade bucal no grupo hanseníase e no controle (UFC/ml) por ANOVA, teste de Mann-Whitney, com nível de significância 5%.
5 RESULTADOS
Foram coletadas amostras de 38 indivíduos portadores de hanseníase multibacilar, com idade entre 10 e 89 anos, com média 49,5 anos e desvio padrão 20,3. Destes, 47,4% (n=18) eram do gênero masculino e 52,6% (n=20) do gênero feminino.
A idade dos indivíduos do grupo controle variou entre 11 e 89, com média de 50,9 anos e desvio padrão de 20,3.
Os dados individuais referentes aos pacientes do grupo hanseníase e indivíduos controle estão apresentados no Anexo C.
5.1 Gênero Candida
Vinte e cinco (65,8%) dos pacientes hansenianos estudados foram positivos para leveduras na cavidade bucal. No grupo controle observou-se que 47,4% foram positivos para este microrganismo (Tabela 1).
Tabela 1- Distribuição porcentual de indivíduos positivos e negativos para levedura do gênero Candida nos grupos hanseníase e controle
Hanseníase Controle
N % n %
Positivos 25 65,8 18 47,4
Negativos 13 34,2 20 52,6
Os dados obtidos para as contagens de leveduras nos grupos estudados estão apresentados na Tabela 2.
Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os valores de UFC/ml obtidos nos grupos hanseníase e controle (p=0,0918).
Tabela 2 - Estatística descritiva dos dados obtidos para os grupos hansenianos e controle (Valores em UFC/ml)
Hansenianos Controle Número 38 38 Mínimo 0,0 0,0 Percentual 25% 0,0 0,0 Mediana 68,8 0,0 Percentual 75% 1722 238 Máximo 50800 16863 Média 2349 798 Desvio padrão 8301 2783
Na Figura 1 estão apresentados os valores de mediana e desvios-padrão de UFC/ml obtidos no grupo hanseníase e controle.
FIGURA 1- Distribuição dos valores ao redor da média (gráfico de pontos, dot plot) e o correspondente esquema dos cinco números (diagrama de caixa, box-plot) dos valores unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/ml) nos grupos hanseníase e controle. No box-plot, as linhas horizontais representam a mediana e os quartis: 25% e 75%. As linhas verticais da caixa: superior e inferior especifica 1,5 vezes a faixa interquartil mais e menos os quartis superior e inferior, respectivamente. No box-plot, um valor é considerado atípico (medida discrepante ou outlier) quando excede esses limites e, nesses casos, são representados por um outro símbolo que pode ser diferente do asterisco (círculo). No box-plot, ainda, um valor é considerado extremo quando excede 3,0 vezes a faixa interquartil mais e menos os quartis superior e inferior, respectivamente, nesses casos, são representados por um asterisco.
Foi obtido um total de 57 isolados de leveduras, sendo que 34 das amostras foram coletadas do grupo hanseníase e 23 do grupo controle. A Tabela 2 demonstra as espécies isoladas e identificadas em cada grupo. Observa-se que em ambos os grupos C. albicans foi a espécie mais freqüentemente identificada, seguida por C. tropicalis.
Tabela 3- Espécies isoladas e identificadas no grupo hanseníase e controle Hanseníase Controle n % n % C. albicans 22 64,8 14 60,9 C. tropicalis 10 29,4 6 26,2 C. glabrata 0 0 1 4,3 C. parapsilosis 1 2,9 0 0,0 C. kefyr 0 0 1 4,3 Total 34 100 23 100
No grupo hanseníase, foram detectadas 13 amostras identificadas como C. albicans que não cresceram ou cresceram escassamente a 45°C e foram consideradas sugestivas de C. dubliniensis. No grupo controle, 14 amostras apresentaram esta característica.
Os resultados obtidos para os testes de susceptibilidade de isolados de Candida, para anfotericina B, fluconazol, 5-fluorocitosina e cetoconazol para o grupo hanseníase e o grupo controle são apresentados nas Tabelas 3 e 4 respectivamente. Nestas Tabelas os valores são expressos como intervalos de mínima inibição de concentração e valores de CIM50 e CIM90.
De acordo com os parâmetros adotados e considerando os valores de MIC obtidos, no grupo controle todos os isolados de Candida spp foram sensíveis. Analisando os resultados obtidos aos antifúngicos testados para o grupo hanseníase, pôde ser observado que apenas uma amostra de C. tropicalis foi resistente a anfotericina B.
Tabela 4- Número de isolados (n=33), faixa de valores de concentração inibitória mínima (CIM), valores CIM50 e CIM90(µg/ml) obtidos pelo teste de sensibilidade aos antifúngicos de isolados de Candida spp. de pacientes portadores de hanseníase
Isolados n Intervalo CIM CIM50 CIM90
C. albicans 22 anfotericina B 0,50 - 1 0,50 1 Fluconazol 0,25 - 2 0,50 1 5-fluorocitosina 0,16 - 4 0,25 1 Cetoconazol 0,04 - 8 0,08 8 C. tropicalis 10 anfotericina B 0,25 - 2 1 1 Fluconazol 0,25 - 16 2 16 5-fluorocitosina 0,16 - 8 0,16 0,25 Cetoconazol 0,04 – 8 2 8 C. lusitaniae 1 anfotericina B 0,50 0,50 0,50 Fluconazol 2 2 2 5-fluorocitosina 2 2 2 Cetoconazol 8 8 8
Tabela 5- Número de isolados (n=29), faixa de valores de concentração inibitória mínima (CIM), valores CIM50e CIM90 (µg/ml) obtidos pelo teste de sensibilidade aos antifúngicos de isolados de Candida spp. de indivíduos controle
Isolados n Intervalo CIM CIM50 CIM90
C. albicans 20 anfotericina B 0,16 - 1 0,50 1 Fluconazol 0,25 - 16 0,50 2 5-fluorocitosina 0,16 - 8 0,25 1 Cetoconazol 0,04 - 2 0,08 1 C. tropicalis 6 anfotericina B 0,16 - 1 0,50 1 Fluconazol 0,25 - 32 1 2 5-fluorocitosina 0,16 - 1 0,50 0,50 Cetoconazol 0,04 - 8 0,08 0,16 C. kefyr 1 Anfotericina B 1 1 1 Fluconazol 0,50 0,50 0,50 5-fluorocitosina 0,50 0,50 0,50 Cetoconazol 0,04 0,04 0,04 C. lusitaniae 1 anfotericina B 1 1 1 Fluconazol 1 1 1 5-fluorocitosina 0,50 0,50 0,50 Cetoconazol 0,16 0,16 0,16 C. glabrata 1 anfotericina B 1 1 1 Fluconazol 32 32 32 5-fluorocitosina 0,16 0,16 0,16 Cetoconazol 8 8 8
6 DISCUSSÃO
A moléstia de Hansen depende basicamente da resposta imune celular do indivíduo, podendo ser definidas as formas paucibacilar, de resposta imune eficiente, com até 5 lesões de pele e multibacilar, de resposta imune ineficaz, com mais de 5 lesões de pele46. Estima-se que entre as pessoas que entram em contato com os pacientes multibacilares (forma disseminadora da doença), 90% são infectados, mas apenas cerca de 8% ficam doentes indicando que apenas um pequeno número de indivíduos não tem resistência ao M. leprae. A imunologia não conseguiu responder até hoje por que alguns indivíduos têm resistência e outros não à doença*.
A cavidade bucal é um sistema de crescimento aberto, onde microrganismos são constantemente introduzidos e removidos29. Leveduras do gênero Candida fazem parte da microbiota residente do organismo, porém em condições favoráveis como doenças sistêmicas, condições de imunossupressão e uso de antibióticos pode haver desequilíbrio provocando um aumento exacerbado do número dessas leveduras levando ao quadro de candidose. C. albicans é a espécie mais freqüentemente encontrada em candidose oral. Em pacientes com candidose oral recidivante, espécies como C. glabrata, C. krusei e C. dubliniensis são mais frequentemente encontradas74.
O grupo do presente estudo incluiu 38 pacientes hansenianos, sendo 52,63% do gênero feminino e 47,36% do gênero masculino. Apesar de estudos mais recentes não demonstrarem a associação da presença das leveduras estudadas em relação ao gênero13, tentou-se formar um grupo equilibrado, para evitar possíveis
variáveis a respeito. Da mesma forma, objetivou-se selecionar indivíduos controle pareados aos pacientes hansenianos, ou seja, com perfil semelhante quanto à idade e condições bucais para minimizar possíveis interferências relacionadas a estas condições nos resultados. Consideramos que esta consideração é particularmente importante para a variável idade, já que os indivíduos grupo de estudo apresentaram idades bastante diferentes. O escopo inicial era encontrar pacientes hansenianos com idades similares, no entanto, apesar de termos percorrido os grandes centros de acompanhamento de hanseníase do Vale do Paraíba, não conseguimos um número suficiente de pacientes na mesma faixa etária.
Os pacientes deste estudo estavam sob PQT por no mínimo 45 dias, ou seja, rifampicina – uma dose mensal de 600mg (2 cápsulas de 300 mg) com administração supervisionada, clofazimina – uma dose mensal de 300 mg (3 cápsulas de 100 mg) com administração supervisionada e uma dose diária auto-administrada. A duração do tratamento era de 12 doses mensais supervisionadas de rifampicina e o critério de alta era de 12 doses supervisionadas em até 18 meses, conforme preconizado pelo Ministério da Saúde9. Por vários motivos particulares e de ordem sócio-econômica, em alguns casos de pacientes com dificuldades ou relutantes em aderir ao tratamento convencional, a terapia era sempre reiniciada dentro de um prazo de 6 meses para dar continuidade ao tratamento para que o mesmo pudesse ser completado em até 18 meses procurando cobrir as eventuais falhas no tratamento9.
O grau de resistência ao bacilo varia entre os indivíduos portadores de hanseníase determinando o número de bacilos que abrigam no seu organismo e que conseqüentemente podem eliminar para o exterior. Estes pacientes se não estiverem em tratamento quimioterápico, infectar outras pessoas e são denominados portadores da forma multibacilar - MB. Os indivíduos que apresentam maior resistência ao bacilo são denominados de paucibacilares (PB), que abrigam um pequeno número de bacilos no organismo, insuficiente para infectar
outras pessoas9. Os pacientes selecionados para o presente estudo foram multibacilares, com o objetivo de estudar prevalência de leveduras do gênero Candida nos pacientes hansenianos que apresentam resposta imunológica mais comprometida. Foram excluídos do presente estudo, pacientes paucibacilares por terem perfil de resposta imune diferente do paciente MB, procurando minimizar desta forma interferências quanto às variáveis individuais de resposta.
Vários autores relataram em seus estudos que diabetes mellitus pode ser considerada como um fator adicional que pode influenciar não somente a candidose, mas também a potencialização de Candida spp. nos seus fatores de virulência5,28,29,33,37,57,77. Baseando-se nestes estudos pacientes portadores deste quadro foram excluídos. Por outro lado, o fumo é citado na literatura como um dos fatores predisponentes locais para colonização por Candida na cavidade bucal79, o que justificou a não inclusão de pacientes fumantes. Pacientes multibacilares com PQT inferior a 45 dias, também foram descartados para que se pudesse avaliar a presença de leveduras do gênero Candida em plena vigência do tratamento PQT.
Com objetivo de enriquecer os dados obtidos na presente pesquisa, foi também realizado exame intra-bucal em 29 dos 38 nos pacientes hansenianos, pelo mesmo examinador, em ambiente de ambulatório odontológico, para avaliação da presença de lesões bucais. O exame intra-bucal foi realizado pela Profa. Dra. Janete Dias de Almeida, docente da Clínica da Disciplina de Semiologia da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos/UNESP. Não foi revelada a presença de lesões bucais, incluindo aquelas relacionadas à hanseníase. Observações diferentes das encontradas neste estudo foram relatadas por Santos et al.70 que registraram a presença de lesões com bacilo de Hansen em vários sítios bucais. Reichart et al.55 também relataram que dentre 44 pacientes examinados 7 (3,1%) pacientes apresentavam perda parcial da úvula devido ao leproma e 3 (1,3%) lábios deformados pela
doença. Girdhar & Desikan26 examinaram 40 pacientes multibacilares na Índia, encontrando 23 (57,5%) com lesões orais envolvendo principalmente o palato duro.
Nossos achados clínicos estão de acordo com o de Scheepers et al.72 (1993) que afirmaram ser as lesões bucais de hanseníase raras e quando ocorrem, somente na forma multibacilar. Reichart et al.54 também relataram baixa ocorrência de lesões bucais nestes pacientes. O objetivo inicial deste estudo era de examinar todos os pacientes hansenianos, o que não foi possível devido à falta de estrutura física para exame clínico intra-bucal encontrada nas Unidades Básicas de Saúde onde foram realizadas as coletas.
Um único trabalho na literatura tem como tema a presença de leveduras na cavidade bucal de pacientes com hanseníase56. No presente estudo observou-se que em 25 pacientes hansenianos (65,79%) foram positivos para leveduras. Porcentagem inferior ao observado por Reichart et al.55 que relataram 80% dos pacientes hansenianos positivos para este microrganismo.
O valor observado também é inferior ao observado em outros estudos em pacientes com outros fatores predisponentes sistêmicos, tais como infecção por HIV (73,3%)3 e tuberculose sob tratamento antibiótico (72%)51 e transplantados cardíacos (88%)58. Em relação ao número de UFC/ml, também não foi observada diferença estatisticamente significativa entre o grupo hanseníase e o grupo controle, demonstrando que o tratamento poliquimioterápico parece não interferir em termos quantitativos a colonização da cavidade bucal por Candida spp. Estes resultados nos permitem inferir que a ocorrência da hanseníase, assim como a administração da PQT específica parece não interferir de modo importante na presença de leveduras do gênero Candida quando comparadas a outras condições clínicas sistêmicas.
O grupo controle apresentou 47,36% de freqüência de isolamento de leveduras na cavidade bucal, que está de acordo com os valores citados na literatura para indivíduos saudáveis (25 a 60%)32,40,60,68.
Observou-se maior isolamento de C. albicans em ambos os grupos de estudo e estes relatos estão de acordo com a literatura60,67. Em nosso estudo foram realizadas apenas provas fenotípicas, no entanto, para a diferenciação definitiva entre os isolados de C. albicans e C. dubliniensis será necessária a identificação genotípica destas amostras80. A incapacidade de C. dubliniensis crescer a 45°C consiste em um teste simples, de baixo custo e viável para se fazer uma triagem de um grande número de isolados de fungos que apresentam teste para tubo germinativo positivo49. Entretanto, Fotedar & Hedaithy24 encontraram 3 de 68 isolados de C. dubliniensis que cresceram à 45°C, indicando que este método pode falsamente sugerir a presença desta espécie, necessitando de testes moleculares confirmatórios. Será de grande importância dar continuidade à identificação destas amostras, para verificar a porcentagem de C. dubliniensis dentre os isolados sugestivos de C. albicans.
Estes resultados não foram encontrados no presente estudo, sendo que no grupo de hansenianos observou-se maior prevalência de C. albicans e C. tropicalis. A ocorrência de poucas espécies no grupo hanseníase chama atenção, pois tem sido observada na literatura grande variabilidade de espécies de leveduras do gênero Candida em pacientes com fatores predisponentes sistêmicos e locais para a candidose3,30,51,58. Este dado pode ser considerado mais um indicativo para a inferência citada anteriormente quanto a pouca influência da doença e do tratamento sobre a presença de Candida spp. na cavidade bucal.
Reichart et al.55 relataram a presença aumentada de C. krusei na cavidade bucal de pacientes hansenianos. Os dados obtidos neste estudo diferem das observações anteriores, sendo que tal
divergência pode ser relacionada às condições completamente diferentes dos dois estudos em questão. Entre estas podemos citar que no estudo anterior os pacientes tinham baciloscopia negativa há vários anos, não utilizavam PQT, eram utilizadas todas as formas clínicas de hanseníase (MB e PB), embora o seu número de pacientes fosse semelhante (n=44) ao deste trabalho (n=38), a faixa etária se concentrava entre 60 e 89 anos, bem menos diversificada que a deste estudo (10 a 89 anos). No estudo anterior foram coletadas amostras pela técnica de swab enquanto neste estudo a coleta foi realizada por enxágüe bucal e por fim e talvez a mais significativa foi a observação de lesões características de hanseníase em 10 dos 44 pacientes avaliados. Vale ressaltar que seus pacientes pertenciam a uma comunidade rural fechada no norte da Tailândia com costumes, alimentação e cultura completamente diferentes dos nossos. Também não foi usado o esquema de controle pareado como adotado no presente estudo. Os referidos autores não encontram explicações para a alta incidência de C. krusei em seu trabalho.
Os teste de sensibilidade aos antifúngicos mostraram que no grupo de pacientes portadores de hanseníase houve apenas uma cepa resistente a anfotericina B, enquanto que as demais cepas testadas foram sensíveis a todos os antifúngicos testados. Este achado vem de encontro a outros trabalhos onde poucas cepas bucais mostraram resistência aos antifúngicos25,27.
Poucos são os estudos sobre susceptibilidade aos antifúngicos em amostras bucais. Ito et al.27 relataram que todos os isolados bucais provenientes de pacientes com periodontite crônica testados foram susceptíveis a anfotericina B (nos grupos controle e com periodontite) e ao fluconazol. O mesmo não ocorreu em relação ao cetoconazol, já que um isolado de C. albicans do grupo periodontite e um isolado de C. glabrata e um de Candida spp. do grupo controle foram resistentes. No mesmo estudo, somente um isolado de C. albicans do grupo periodontite foi resistente a 5-fluorocitosina. Furletti25pesquisando a
susceptibilidade aos antifúngicos para Candida spp. em pacientes com doença periodontal encontrou valores de CIM50 e CIM90 dos antifúngicos azólicos para as amostras de C. albicans inferiores aos encontrados para as demais espécies, já para anfotericina B, os valores de CIM50 e CIM90 não foram diferentes entre C. albicans e as demais espécies.
Batista et al.4 estudando isolados de pacientes portadores de próteses totais, observou uma boa atividade fungistática da anfotericina B, equivalente à CIM de 0,03 µ/ml para a maioria das leveduras estudadas. Observou também excelentes resultados para ação fungicida de tal modo que as concentrações fungicidas mínimas (CFMs) variaram de 0,03 a 0,15 µ/ml para 15 das 19 cepas. Os níveis séricos alcançados pela anfotericina B no ser humano são de cerca de 2,00 µg/ml, valor muito superior ao obtido nesta pesquisa. Diferentes autores sugerem que MICs 1,0 µg/ml são compatíveis com os níveis séricos de anfotericina B1.
Apesar da anfotericina B, ser um dos antifúngicos mais antigos e seu emprego restringir-se quase que exclusivamente a administração sistêmica, ainda hoje, é considerada droga de referência para o tratamento da maioria das infecções fúngicas4. Por este motivo, foi incluída neste trabalho como um parâmetro, considerando-se também sua excelente ação fungicida.
Dentro dos limites do presente estudo, os resultados obtidos sugerem que a PQT empregada para o tratamento da hanseníase multibacilar não interfere de maneira significativa na presença de leveduras do gênero Candida na cavidade bucal destes pacientes. Estudos futuros analisando a presença de outros microrganismos poderão gerar dados importantes a respeito da microbiota bucal de pacientes com esta doença.
7 CONCLUSÕES
De acordo com o estudo realizado, podemos concluir que: a) o porcentual de pacientes hansenianos positivos para
leveduras foi superior ao de indivíduos controle;
b) não foi observada diferença significativa entre as contagens de leveduras nos grupos estudados;
c) houve maior prevalência de C. albicans e C. tropicalis em ambos os grupos estudados;
d) apenas uma amostra de C. tropicalis isolada da cavidade bucal de paciente hanseniano foi resistente à anfotericina B;
e) não houve diferença na suscetibilidade aos antifúngicos entre os isolados de pacientes portadores de hanseníase sob PQT e os indivíduos controle.
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